Ex vivo-methode voor het beoordelen van het voortplantingsstelsel van muizen spontane beweeglijkheid en een op MATLAB gebaseerd baarmoeder bewegings Volgalgoritme voor gegevensanalyse

Samenvatting

Baarmoeder contracties zijn belangrijk voor het welzijn van vrouwen. Echter, pathologisch verhoogde contractiliteit kan leiden tot dysmenorroe, vooral bij jongere vrouwtjes. Hier beschrijven we een eenvoudige ex vivo voorbereiding waardoor een snelle beoordeling van de werkzaamheid van glad Spierrelaxantia die kunnen worden gebruikt voor de behandeling van dysmenorroe.

Samenvatting

Dysmenorroe, of pijnlijke krampen, is het meest voorkomende symptoom geassocieerd met menstruatie bij vrouwtjes en de ernst ervan kan het dagelijks leven van vrouwen belemmeren. Hier presenteren we een eenvoudige en goedkope methode die instrumentaal zou zijn voor het testen van nieuwe medicijnen die de contractiliteit van de baarmoeder verminderen. Deze methode maakt gebruik van het unieke vermogen van het hele muis voortplantingsstelsel om spontane beweeglijkheid te vertonen bij het onderhouden van ex vivo in een Petri schaaltje met zuurstofhoudende Krebs-buffer. Deze spontane beweeglijkheid lijkt op de golfachtige myometriale activiteit van de menselijke baarmoeder, aangeduid als endometriale golven. Om de effectiviteit van de methode te demonstreren, we werkten een bekende baarmoeder spierverslapper drug, adrenaline. We tonen aan dat de spontane beweeglijkheid van het hele muis voortplantingskanaal snel en omkeerbaar kan worden geremd door 1 μM epinefrine in dit Petri schaalmodel. Het documenteren van de veranderingen van de beweeglijkheid van de baarmoeder kan gemakkelijk worden gedaan met behulp van een gewone smartphone of een geavanceerde digitale camera. We ontwikkelden een op MATLAB gebaseerd algoritme dat bewegingsregistratie mogelijk maakt om spontane baarmoeder motiliteits veranderingen te kwantificeren door de snelheid van baarmoeder hoorn bewegingen te meten. Een groot voordeel van deze ex vivo-benadering is dat het voortplantingskanaal gedurende het hele experiment intact blijft, met behoud van alle intrinsieke intra-uteriene cellulaire interacties. De belangrijkste beperking van deze aanpak is dat tot 10-20% van de uteri geen spontane beweeglijkheid kan vertonen. Tot nu toe is dit de eerste kwantitatieve ex vivo -methode voor het beoordelen van de spontane baarmoeder beweeglijkheid in een Petri schaalmodel.

Inleiding

Als een groot vrouwelijk orgaan is de baarmoeder cruciaal voor de voortplanting en essentieel voor de voeding van de foetus¹. De baarmoeder bestaat uit drie lagen: het perimetrium, myometrium en endometrium. Het myometrium is de belangrijkste contractiele laag van de baarmoeder en speelt een sleutelrol bij de levering van foetus. Het endometrium is de binnenste laag die de baarmoederholte binnenvalt en is essentieel voor de implantatie van embryo's. Bij niet-zwangere vrouwen in de reproductieve leeftijd wordt de endometrium laag maandelijks vergoten aan het begin van de menstruatiecyclus. Het myometrium helpt bij dit afslijmingsproces door de spontane myometriale contracties te handhaven die nodig zijn voor het verwijderen van het necrotische baarmoederslijmvlies van de baarmoeder¹.

Helaas, verhoogde myometriale contractiliteit kan resulteren in negatieve bijwerkingen zoals dysmenorroe, of pijnlijke menstruele krampen. Dit is vooral te zien bij jonge vrouwtjes en nullipareuze vrouwen². Echter, dysmenorroe is verschillend voor elke vrouw en hangt af van de sterkte van hun myometriale contracties; sterkere contracties worden vaak geassocieerd met het gevoel van ernstige kramp³. Myometriale contractiliteit kan worden gevisualiseerd met behulp van baarmoeder echografie en wordt vaak herkend als endometriale golven. Verbeterde afgifte van prostaglandinen tijdens de menstruatie⁴ in een baarmoeder die endometrium verjering ondergaat, wordt verondersteld om bij te dragen aan verhoogde myometriale hypercontractiliteit, resulterend in ischemie en hypoxie van de baarmoeder spier en aldus verhoogd pijn³.

Ernstige dysmenorroe kan belemmeren de dagelijkse activiteit van sommige vrouwen en 3 aan 33% van de vrouwen hebben zeer ernstige pijn, die kan leiden tot een vrouw te bedlegerig voor 1 aan 3 dagen elke menstruele cyclus⁵. Dysmenorroe is de belangrijkste oorzaak van gynaecologische morbiditeit bij vrouwen in de reproductieve leeftijd ongeacht leeftijd, nationaliteit, en economische status⁵. De geschatte prevalentie van dysmenorroe is zowel hoog als variabel, variërend van 45% tot 93% bij vrouwen in de reproductieve leeftijd⁵.  Dysmenorroe-geassocieerde pijn heeft een effect op het dagelijks leven van vrouwen en kan resulteren in slechte academische prestaties bij adolescenten, lagere kwaliteit van de slaap, beperking van de dagelijkse activiteiten, en stemmingswisselingen⁵.

Veel vrouwen die ervaren ernstige dysmenorroe Resort om over-the-counter medicatie om hun pijn te verlichten. Dergelijke over-the-counter medicatie bevatten cyclooxygenase (COX) remmers die de vorming van prostaglandinen⁶voorkomen. Echter, COX-remmers worden geassocieerd met ongewenste cardiovasculaire voorvallen, en ongeveer 18% van vrouwen met dysmenorroe zijn niet reageren op deze remmers⁷. Daarom is er behoefte aan nieuwe medicijnen om menstruele krampen te verminderen. Aangezien over contractiliteit van de baarmoeder bijdraagt aan de pathogenese van dysmenorroe, kan een mogelijke strategie het gebruik van uteriene relaxants zijn.

Het is gunstig om de effecten van potentiële spierverslapper drugs te kwantificeren in een model van natuurlijk voorkomende spontane myometriale golf-achtige contracties. Tot dusver is echter geen efficiënte ex vivo-methode voor het testen van spier-ontspannende geneesmiddelen in de intacte baarmoeder beschreven. Op dit moment, isometrische spanning metingen worden gebruikt voor het evalueren van spierverslapper drug effecten. Tijdens dergelijke metingen, een baarmoeder spier strip wordt gehandhaafd op een constante lengte onder voorladen in een weefsel Bad terwijl de kracht van baarmoeder spiercontracties wordt geregistreerd voor en na oxytocine stimulatie in de aanwezigheid of afwezigheid van een spierverslapper drug. Hoewel deze aanpak is zeer nuttig, het vereist dure apparatuur. Bovendien lijken isometrische contracties niet op de spontane myometriale golfachtige contracties die van nature voorkomen in de intacte baarmoeder. Op unieke wijze kunnen de uteriene myometriale golven bij knaagdieren worden gevisualiseerd als de beweeglijkheid van de baarmoeder hoorn wanneer het gehele voortplantingskanaal (eierstokken, baarmoeder en vagina) in een bufferoplossing wordt gehandhaafd. Hier presenteren we een ex vivo-methode voor het monitoren van de spontane beweeglijkheid van de intacte muis baarmoeder geplaatst in een Petri schaaltje met een zuurstof buffer. We beschrijven ook een motiliteits kwantificerings algoritme met behulp van de MATLAB Motion tracker. Deze nieuwe aanpak biedt een eenvoudig en goedkoper alternatief voor het testen van het spierverslapper potentieel van natuurlijk voorkomende remedies en synthetische verbindingen.

Protocol

Alle procedures met dieren zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité aan de Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 maand-oude F2-129S-C57BL/6 seksueel volwassen vrouwelijke muizen werden gebruikt in de studie.

Let op: Zorg voor veiligheid door het dragen van een Labcoat, masker en handschoenen bij het werken met dieren en biogevaarlijke materialen.

1. voorbereiding van de oplossing

1. Bereid de Krebs-buffer, die bevat: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mm Nah₂po₄, 0,56 mM MgCl₂, 25 mm NaHCO₃, en 5 mm glucose, pH 7,4. De Krebs-buffer continu oxygeneren met een mengsel van samengeperste gassen met 5% CO₂ en 95% O₂ met behoud van de buffer temperatuur bij 37 °c met behulp van een circulerend waterbad.
2. Bereid Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), die bevat: 2,68 mm KCl, 1,47 mm_{KH 2}po₄, 136,89 mM NaCl, en 8,1 mm na₂HPO₄, pH 7,4.

2. voorbereiding van dieren

1. Anesthetize muizen met inhalatie van Isofluraan (3%) met afvalgas opruiming. Zorg voor adequate anesthesie door het beoordelen van terugtrekking reflexen. Knijp de achterste teen om te bevestigen dat er geen bewegingen worden opgewekt, wat het verlies van reflex reacties aangeeft. Na de diepe verdoving wordt bereikt, euthanitatie van het dier door onthoofding.
   Opmerking: Isofluraan kan een gladde spier verwijding veroorzaken. Daarom moet de bereiding van het voortplantingskanaal grondig worden gewassen en geïnincubeerd in de Krebs-buffer gedurende ten minste 15-30 minuten voordat de ex vivo-experimenten worden begonnen. Isoflurane kan irritatie en ongemak veroorzaken wanneer het in aanraking komt met de huid, dus ga voorzichtig te werk.
2. Plaats het lichaam op een grote weeg boot bekleed met een papieren handdoek.
   Opmerking: Zwangere vrouwelijke laboratoriumpersoneel mag niet worden betrokken bij experimenten met Isofluraan, omdat het foetaal gewicht kan afnemen, de foetale skelet ossificatie vermindert en het risico op^{spontane abortus verhoogt}. CO₂ inademing kan worden gebruikt als vervanger voor het euthaniseren van muizen.

3. bepaling van de Estrous cyclus fase

1. Met kleine Tang, til de clitoris om toegang te krijgen tot het vaginale buurt en breng langzaam een micropipet punt met 10 μL dpbs in de vagina.
   1. Zorg ervoor dat de micropipet punt via het buurt onder een hoek van 10-30 ° wordt ingebracht om te voorkomen dat de vaginale wand prikken. De vloeistof moet nog steeds zichtbaar zijn in de tip na het inbrengen. Als de vloeistof niet zichtbaar is, werd de punt te ver in de vagina ingebracht en was het paracervicale gebied van de vagina mogelijk geperforeerd.
   2. Trek de vaginale ostiumspieren lichtjes naar beneden met de punt van de micropipet om lucht uit de vagina te laten verlaten.
2. Spoel de vaginale holte langzaam door het pipetteren op en neer 2-3 keer met 10 μL DPBS en plaats de getekende celsuspensie op een glazen glijbaan.
3. Gebruik een omgekeerde fase contrast Microscoop om te bepalen van de fase van de oestrische cyclus door middel van cytologische analyse. De procedure wordt uitgevoerd zoals elders beschreven^10,11. Zorg ervoor dat de celsuspensie niet uitdroogt voordat cytologische analyse kan worden uitgevoerd. De suspensie kan indien nodig worden verdund met verse DPBS.

4. muis voortplantingskanaal Ddissectie

1. Rangschik de muis in rugligging en spreid de extremiteiten uit om de abdominopelvic-regio bloot te leggen.
2. Spray met 70% ethanol om het abdominopelvic-gebied te bevochtigen en te ontsmetten.
3. Met behulp van Tang, voorzichtig til de huid superieur aan de clitoris. Maak kleine dwarse incisies op de laterale aspecten van de onderste buikstreek, tot aan de bovenste ledematen om het peritoneum bloot te leggen (Figuur 1A). Tijdens dit proces wordt een externe flap vormgegeven. Als kleine incisies voortdurend worden gemaakt, de flap zal toenemen in grootte.
4. Snijd voorzichtig door het peritoneum om het maagdarmkanaal bloot te leggen (Figuur 1B). Het is belangrijk op te merken dat de baarmoeder hoorns kunnen vaak direct onder het peritoneum, dus Maak incisies voorzichtig en raak de hoorns niet als dit kan invloed hebben op de beweeglijkheid van de baarmoeder.
5. Gebruik de Tang, verwijder de fascia en vetweefsel die het maagdarmkanaal bedekken. Verwijder de volgende maagdarmkanaal segmenten uit de buikholte: de twaalfvingerige darm, het jejunum, het ileum, de blindedarm, de stijgende en dwarse Colon (Figuur 1C).
6. Om de voortplantingsorganen te lokaliseren, identificeert u eerst de urineblaas (Figuur 1C, "4"), die een leeg uiterlijk kan hebben als gevolg van het vernietigen na euthanasie. De vagina zal recht onder de urineblaas.
7. Lokaliseer de schaam-symphyse bij de samenvloeiing van de schaambeenderen (caudally naar de blaas).
8. Met behulp van een schaar, verwijder de schaam symphyse door het zorgvuldig maken van incisies op de laterale zijden door de interpubic fibrokraakbeen weefsel om toegang te krijgen tot en het verstrekken van een route voor de vagina extractie (Figuur 1D).
9. Snijd door het perineum gelegen tussen de anus en het onderste deel van de vulva.
10. Met behulp van de Tang, til de vagina en langzaam accijnzen het rectum.
11. Identificeer twee baarmoeder hoorns die bifurcate in een vork, rostrally naar de vagina. Zoek een ingewikkelde eileider en eierstok aan het einde van elke hoorn, die kan worden verborgen onder de overgebleven gastro-intestinale tractus segmenten. Gebruik een kleine Ontkoppel schaar om eventuele ligamenten te verwijderen die verbinding maken met en de hoorns, oviducts en eierstokken in de buikholte ondersteunen.
12. Verwijder het voortplantingskanaal, waaronder de vagina, baarmoeder, oviducts en eierstokken, uit de buikholte.
13. Breng het geïsoleerde voortplantingskanaal (Figuur 1E) over in een Petri schaaltje van 100 mm gevuld met 10 ml dpbs. Comprimeer de baarmoeder hoorns niet om beschadiging van het myometrium te voorkomen.
14. Gebruik een tang en een chirurgische schaar om een BIND-en vetweefsel rond de baarmoeder hoorns en de vagina te verwijderen, evenals elke vacht in de schaamstreek die de beeldkwaliteit zou kunnen belemmeren. Verwijder het brede ligament om de beweeglijkheid van de baarmoeder hoorns mogelijk te maken.
15. Was het geïsoleerde voortplantingsstelsel met verse DPBS twee keer en breng het over in een 35 mm Petri schaaltje gevuld met 3 mL zuurstofrijke Krebs-oplossing.

5. weefsel Imaging

1. Plaats de Petri schaal met het voortplantingskanaal in zuurstofrijk Krebs-buffer op een zwart oppervlak. Houd het Gerecht bij kamertemperatuur.
   Opmerking: Het is mogelijk om een infrarood verwarmend pad te gebruiken om het weefsel op 37 °C te houden.
2. Toestaan 15-30 min voor spontane contracties te beginnen. Record spontane uteriene motiliteit voor 10 min van een axiaal vlak met behulp van elk type van digitale video-apparatuur.
3. Breng het preparaat over in een Petri schaaltje met de zuurstof buffer, aangevuld met een teststof. Record spontane uteriene motiliteit voor ongeveer 10 min van een axiaal vlak met behulp van elk type van digitale video-apparatuur.
4. Was het gehele voortplantingsstelsel in 100 mm Petri schaaltje met 10 mL DPBS om de reversibiliteit van de behandeling te beoordelen.
5. Breng het preparaat over in een Petri schaaltje met de vers zuurstof achtige Krebs-buffer. Record spontane uteriene motiliteit voor ongeveer 10 min van een axiaal vlak met behulp van elk type van digitale video-apparatuur.
6. Breng het preparaat over naar een ander 35 mm Petri schaaltje gevuld met zuurstofrijk Krebs-buffer aangevuld met het voertuig voor de teststof om ervoor te zorgen dat er geen mechanisch veroorzaakte veranderingen in de spontane baarmoeder beweeglijkheid zijn. Dit is een belangrijke controle.
7. Breng de videobeelden over naar de harde schijf van een computer.

6. gegevensanalyse

1. Maak clips met behulp van videobewerkingssoftware van de originele videobeelden met de afleveringen besturing, behandeling en Wash.
2. Gebruik de MATLAB-software en het meegeleverde script (zie online aanvullend materiaal) om de spontane baarmoeder beweeglijkheid te kwantificeren.
   Opmerking: Computer vision Toolbox add-on voor MATLAB moet zijn geïnstalleerd om het script volledig functioneel te maken.
   1. Open het MATLAB-script, ga naar het tabblad Editor en klik op uitvoeren.
   2. Selecteer het eerste videobestand en klik op openen.
   3. Voer in het pop-upvenster een label in voor het videobestand en klik op OK.
   4. Voer het tijdsinterval (s) in dat nodig is voor de berekening van de snelheid van de hoorn beweging (Δ Euclidische afstand/Δs).
   5. Gebruik de muiscursor om twee punten te selecteren op het eerste frame van de video. Een pop-upvenster zal u vragen om te bevestigen dat de geselecteerde punten moeten worden gebruikt voor het bijhouden. Klik op Start om het real-time tracerings proces te starten dat wordt weergegeven in het pop-upvenster. U ook op punten opnieuw selecteren klikken om de twee punten opnieuw te selecteren.
   6. Controleer de nauwkeurigheid van het tracking proces in het pop-upvenster.
   7. Houd rekening met een koers versus tijd spreidings plot en afstand versus tijd spreidings plot in een nieuw pop-upvenster. Sla de twee cijfers op door bestand te selecteren | Opslaan als in hetzelfde venster om de gegevens te documenteren.
   8. Zoek een map met de naam Pointtrackerdata, automatisch gemaakt door MATLAB, in dezelfde map waar het MATLAB-script zich bevindt. Identificeer een Excel-bestand met de naam label_Data met gegevenspunten die zijn verzameld van de video in twee afzonderlijke werkbladtabs.
      Opmerking: elke alternatieve bewegings tracerings software kan worden gebruikt om de beweeglijkheid van de spontane baarmoeder te kwantificeren.
3. Gebruik een geschikte software (bijvoorbeeld Excel of Sigmaplot 13) om de statistische analyse uit te voeren.

Resultaten

Figuur 1 toont representatieve beelden die zijn genomen tijdens de gehele isolatie procedure voor het voortplantingsstelsel die in dit protocol wordt beschreven. Om besmetting van de buffer met bont, die de videokwaliteit zou afnemen, te voorkomen, bevochtigd we het muis lichaam met 70% ethanol. De belangrijkste benchmark voor het dissectie gedeelte van het protocol is het vinden van de urineblaas. De baarmoeder en de vagina zullen lager liggen dan de urineblaas.

...

Discussie

Hier beschrijven we een methode voor het beoordelen van de spontane contractiliteit van het gehele voortplantingsstelsel van knaagdieren, dat de eierstokken, oviducts, baarmoeder hoorns en de vagina omvat. We gebruikten een soortgelijke methode om aan te tonen van de spierverslapper effect van fenylefrine op spontane uteriene motiliteit¹³, echter, in het verleden waren we niet in staat om kwantitatieve analyse van de gegevens te verstrekken. In dit werk ontwikkelden we een algoritme voor kwantitat...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642
Dulbecco's PBS	Fisher Sceintific	17-512Q
Ethanol 200 PROOF	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps	Fisher Sceintific	13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system	Leica	DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources	Fisher Sceintific	12-562-21
Weigh Boat	Fisher Sceintific	WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown	Cardinal Health	9515	Klein, Medium of Groot
Handschoenen	McKesson Corporation	20-1080	Klein, Medium, of Groot; poedervrije steriele latex of nitril chirurgische handschoenen
Petri Dish	Corning Falcon	351029	100 mm
Petri Dish	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2- 5% CO2 gasmixtuur	Praxair	MM OXCD5-K
Oorlussen maskers	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	versie 2019 of nieuwer