Hier is een protocol voor het uitvoeren van tijd-en ruimtebeperkt gen knock-out in Axolotl ruggengraat koorden door het injecteren van CAS9-gRNA complex in het ruggenmerg centrale kanaal gevolgd door elektroporation.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Directe gen knock-out van Axolotl ruggenmerg neurale stamcellen via Elektroporation van CAS9 proteïne-gRNA complexen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De axolotl heeft de unieke mogelijkheid om zijn ruggenmerg volledig te regenereren. Dit is grotendeels te wijten aan de Ependymale cellen overgebleven als neurale stamcellen (NSCs) gedurende het hele leven, die zich vermenigvuldigen om de Ependymale buis te hervormen en te differentiëren in verloren neuronen na ruggenmergletsel. Ontcijferen hoe deze NSCs de pluripotentie post-ontwikkeling behouden en zich vermenigvuldigen met ruggenmergletsel om de exacte voor schade structuur te hervormen, kan waardevol inzicht geven in hoe de ruggengraat van zoogdieren kan regenereren, evenals mogelijke behandelingsopties. Het uitvoeren van genknock-outs in specifieke subgroepen van NSCs binnen een beperkte tijdsperiode zal het mogelijk maken om de moleculaire mechanismen achter deze regeneratieve processen te bestuderen, zonder te worden verward door ontwikkelings verstoringen. Hier beschreven is een methode om genknock-out in Axolotl ruggenmerg NSCs uit te voeren met behulp van het CRISPR Cas9 systeem. Door het CAS9-gRNA-complex in het Ruggenmergkanaal te injecteren, gevolgd door elektroporation, worden doel genen in NSCs in specifieke gebieden van het ruggenmerg op een gewenst tijdstip uitgeschakeld, waardoor moleculaire studies van ruggenmerg NSCs tijdens Regeneratie.
Inleiding
Het ruggenmerg van de meeste gewervelde dieren kan niet regenereren na letsel, wat leidt tot blijvende invaliditeit. Verschillende salamanders, zoals de axolotl, zijn opmerkelijke uitzonderingen. De axolotl kan een structureel identiek ruggenmerg volledig regenereren en de ruggenmerg functie volledig herstellen. Een groot deel van het regeneratieve vermogen van het ruggenmerg van Axolotl is te wijten aan Ependymale cellen. Deze cellen lijn het centrale kanaal, en in tegenstelling tot die in zoogdieren, Axolotl Ependymale cellen blijven als neurale stamcellen (NSCs) post-embryonale ontwikkeling. Na het ruggenmergletsel (bijv. van een staart amputatie), vermenigvuldigen deze nscs zich om de Ependymale buis te herkweken en te differentiëren om verloren neuronen1,2,3te vervangen. Het ondekken van hoe Axolotl-ruggenmerg NSCs pluripotente blijven en geactiveerd worden na letsel kan waardevolle informatie verschaffen over het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën voor menselijke patiënten.
Als gevolg van de vooruitgang in de crispr Cas9 genknock-out techniek, is het uitvoeren van knock-outs om de genfunctie te ontcijferen gemakkelijker geworden en is aangetoond dat het een brede toepasbaarheid heeft in verschillende soorten, waaronder Axolotls4,5, 6 , 7 , 8. de recente release van het volledige Axolotl genoom en transcriptome maakt het nu mogelijk elke genomische Locus te richten en voor een betere beoordeling van de doeleffecten 9,10,11,12 , 13 , 14. geoptimaliseerde protocollen zijn ontwikkeld voor knock-out en knock-in in Axolotls met behulp van het Crispr Cas9 systeem15. De levering van crispr Cas9 machines in de vorm van Cas9 proteïne-grna RiboNucleoProteïne (RNP) is efficiënter gebleken dan het gebruik van cas9 en grna-encoding plasmiden4. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de RNP kleiner is in grootte dan plasmide vectoren, haar vermogen om onmiddellijk DNA-onderbrekingen te maken en de gRNA te beschermen tegen RNA-degradatie. Bovendien, met behulp van RNPs omzeilt transcriptie en vertaling; Zo vermijdt het problemen zoals de kracht van de promotor en het optimale codon gebruik wanneer plasmide elementen zijn afgeleid van een andere soort.
Verlies-van-functie studies zijn een van de algemene benaderingen voor het onderzoeken van potentiële functies van genen van belang. Om de genfunctie tijdens de regeneratie te bestuderen, moet een knock-out idealiter net voor een blessure worden uitgevoerd om effecten op de ontwikkeling te voorkomen. Bovendien moet de knock-out worden beperkt tot zowel de NSCs en de regio van regeneratie. Een knock-out van het doel-gen in alle NSCs (met inbegrip van die in de hersenen, wat het geval is in CRE-LoxP-systemen), kan effecten veroorzaken die geen verband houden met regeneratie die de interpretatie van de resultaten kan vinden. Gelukkig biedt de structuur van de axolotl ruggenmerg een unieke kans voor tijd-en ruimtebeperkt knock-out in NSCs. Het merendeel van de ruggenmerg nscs zijn in contact met het centrale kanaal en vormen de overgrote meerderheid van de cellen in contact met het centrale kanaal16,17. Daarom kan een injectie van het CAS9-grna-complex in het centrale kanaal, gevolgd door elektroporation, de levering aan ruggenmerg nscs in een gewenste regio op een specifiek tijdstip4,18,19. Dit protocol laat zien hoe dit wordt uitgevoerd, wat leidt tot zeer penetrerende knock-out in de beoogde ruggenmerg NSCs. vervolgens wordt de analyse uitgevoerd om de effecten op regeneratie en NSC-gedrag te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de plaatselijke en nationale voorschriften inzake dierproeven en met goedkeuring van de relevante institutionele beoordelings Raad.
1. het bereiden van de CAS9-gRNA RNP mix
- Ontwerp en synthetiseren gRNAs.
Opmerking: Raadpleeg andere publicaties voor het ontwerpen en synthetiseren van grna's, waaronder een exclusief met betrekking tot Axolotls15,20,21,22. - Het verkrijgen van CAS9-NLS-eiwit door in-House voor te bereiden of commercieel te kopen.
- Bereid CAS9-gRNA mix door 5 μg CAS9-NLS-eiwit te mengen, 4 μg gRNA, 0,9 μL 10x CAS9 buffer, en vul het volume tot 10 μL met Nuclease-vrij H2O. aliquot het mengsel en bewaar bij-80 °c indien niet onmiddellijk gebruikt.
2. agarose platen voorbereiden voor elektroporation
- Bereid 200 mL van 2% (WT/vol) agarose oplossing in 1x DPBS. Oplossen door het verwarmen van de oplossing in een magnetron en giet het op 10 cm Petri schalen tot een diepte van ongeveer 10 mm (diep genoeg om het hele dier te bedekken).
- Laat de platen op kamertemperatuur stollen. Bewaar platen bij 4 °C indien niet onmiddellijk gebruikt.
- Met behulp van chirurgische scalpels, snijd de agarose plaat om een spleet voor het vasthouden van de staart recht, een goed voor het aanbrengen in het lichaam van het dier, en twee extra putjes voor het plaatsen van de elektroden (Figuur 1E).
- Leg het bord op ijs en vul het tot de rand met ijskoud 1x DPBS. Gebruik dezelfde DPBS-oplossing voor het maken van de platen om een consistente elektrische geleiding in de opstelling te garanderen.
3. de elektroporator configureren
- Configureer de elektroporator. Instellen van de poring puls te bestaan uit een bipolaire puls van 70 V, met een duur van 5 MS, interval van 50 MS, en geen spannings verval. Stel de overdrachts puls in op vier bipolaire pulsen van 40 V, met een duur van 50 MS, een interval van 999 MS en een spannings verval van 10%.
- Sluit de elektroden aan op de elektroporator en stel de pincet in op 7 mm van elkaar. Dompel de elektroden in een bekerglas van DPBS voor en tussen de elektroporation.
4. voorbereiding en het laden van micro-injectie glazen capillairen
- Voer een ramp test uit op een Vlaming/bruine micro pipet trekker volgens de instructies van de fabrikant om de warmte waarde te bepalen.
- Pull injectie capillairen met taps toelopende uiteinden met behulp van de volgende parameters: Heat = helling Testwaarde, pull = 100, snelheid = 100, tijd = 100.
- Let op de naald onder een stereomicroscoop. Met behulp van fijne Tang, breek het capillair onder een hoek zodat het een schuine punt heeft. Breek op een positie waar het dun genoeg is om het centrale kanaal te targeten, terwijl het sterk genoeg is om de huid door te boren.
Opmerking: het punt waarop de diameter ongeveer 20 μm of ongeveer 50% van de diameter van het ruggenmerg is, is een goed uitgangspunt. Er kunnen meerdere pogingen nodig zijn om een optimale breuk te verkrijgen. - Voeg een snelle groene FCF-oplossing toe aan de RNP-mix met een verhouding van 1:30 en laad ongeveer 5 μL injectiemix in het capillair met een Microloader pipetpunt.
- Monteer het capillair op de Pneumatische pomp met de schuine punt naar beneden gericht.
5. de Pneumatische pomp configureren
- Configureer de Pneumatische pomp. Stel de Hold in op 0,5 pond per vierkante inch (PSI), uitwerpen naar 2 psi Hold en duur tot gated.
- Test capillaire en pneumatische pompinstellingen door het capillair in een druppel water te dompelen en op het voetpedaal te drukken om te injecteren. Zorg ervoor dat de injectiemix in een langzame maar gestage stroom komt.
- Pas de Hold-druk aan als de injectiemix spontaan uitlekt of water het capillair opzuigen. Verhoog de ejectiedruk of breek meer van het capillair als de injectiemix te traag komt. Verlaag de ejectiedruk als de injectie te snel komt.
6. injecteren van RNP mix in het ruggenmerg
- Anesthetize Axolotls in 0,03% benzocaïne oplossing gedurende ten minste 10 min. Controleer of de dieren niet reageren door ze ondersteboven in het water te spiegelen.
- Pak een dier met ring Tang en leg het op een bed van silicium, met de linker kant van het dier naar boven en de staart naar rechts gericht. Plaats de injectieplaats in het midden van het gezichtsveld van de stereomicroscoop (Figuur 1A).
- Stel de micromanipulator zodanig in dat het capillair op 60 ° van de rechterkant van het gezichtsveld komt (Figuur 1B).
- Identificeer het ruggenmerg en het centrale kanaal (Figuur 1C).
Opmerking: het ruggenmerg is de buis structuur boven de notochord. - Gericht op het centrale kanaal, verplaats het capillair naar voren om zachtjes de huid en spieren door te boren in het centrale kanaal van het ruggenmerg. Beperk de beweging van het capillair tot kleine stapjes, omdat het ruggenmerg zich direct onder de staart spieren bevindt.
- Houd het voetpedaal ingedrukt om de mix in het centrale kanaal te injecteren. Kijk of de RNP-mix zich langs het centrale kanaal verspreidt als een blauwe lijn in beide richtingen, wat aantoont dat het capillair correct is gepositioneerd (Figuur 1D).
- Als dit niet gebeurt, houdt u het voetpedaal ingedrukt terwijl u de capillaire lichtjes in en uit beweegt totdat de RNP-mix begint. Als de capillaire verstopt raakt door weefsel, wis het dan door in water te werpen bij een hogere druk.
- Pas de ejectiedruk aan zodat het net genoeg is om de RNP-mix te verspreiden in het centrale kanaal, maar niet zozeer dat het de structuur opblaast.
- Blijf het voetpedaal vasthouden zodat de injectiemix zich verder verspreidt langs het centrale kanaal, totdat het de klem blaasje bereikt aan het einde van het ruggenmerg en de ventrikels in de hersenen.
Opmerking: dit kan tot 2 minuten duren, afhankelijk van de grootte van het dier. Het kan nodig zijn om de druk na enige tijd te verhogen, waardoor de RNP-mix de hersenventrikels binnenkomt. - Ga zo snel mogelijk naar elektroporation na succesvolle injectie.
7. elektroporation
- Breng het dier over met een ring Tang op de bereide agarose-elektroporation plaat (Figuur 1E) op het ijs. Plaats de staart in de gleuf zodat deze is ingeklemd door agarose (Figuur 1F).
- Plaats de elektroden in de putjes aan beide zijden van de staart. Zorg ervoor dat het hele dier en de elektroden worden bedekt door ijskoude PBS.
- Druk op de voetschakelaar om de elektroporation te starten.
- Nadat de elektroporation is voltooid, keert u het dier terug naar water.
- Ga zo nodig meer dieren injecteren.
- Controleer of de elektroporated dieren gezond zijn nadat de anesthesie is versleten en dat er geen schade aan de staart is toegebracht.
8. beoordeling van de knock-out efficiëntie
- Bevestig de staart van het elektroporated dier. Maak dwarsdoorsneden van de staart, gevolgd door immunohistochemische kleuring om de efficiëntie van de knock-out op het eiwit niveau te beoordelen.
Opmerking: als een staart amputatie moet worden uitgevoerd na elektroporation, kan de cut off tail voor dit doel worden gebruikt. Dieren die elektroporated met gRNAs tegen GFP of tyrosinase, bijvoorbeeld, kunnen worden gebruikt als een negatieve controle4. - Als alternatief kan het elektroporated ruggenmerg worden geëxtraheerd en gelyseerd voor DNA. Voer genotypering PCR uit, gevolgd door Sanger-sequencing of sequentiëren van de volgende generatie om het percentage bewerkte genetische loci15te beoordelen.
Opmerking: de resulterende bewerkings efficiëntie zal de werkelijke bewerkings efficiëntie voor NSCs onderschatten, vanwege de opname van niet-electroporated cellen en neuronen die geen apicaal contact hebben met het centrale lumen en dus niet de RNP-mix zullen ontvangen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Injectie en elektroporation van CAS9-gRNA-complex tegen Sox2 in het middenkanaal van het Axolotl-ruggenmerg leidde tot een enorm verlies van Sox2 immunoreactiviteit in een meerderheid van de ruggenmerg nscs, met Grna tegen tyrosinase (Tyr) als een controle (Figuur 2 A). B3-tubulin (gekleurd met TUJ1) is een marker voor neuronen en werd niet uitgedrukt in nscs, en SOX2-TUJ1-cellen rond het centrale kanaal werden beschouwd als cellen die Harkotteren SOX2 verw...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het beschreven protocol maakt het mogelijk om in de NSCs in het ruggenmerg van Axolotl tijd en ruimte te beperken. Het huidige protocol maakt specifieke targeting van NSCs mogelijk op een bepaald tijdstip en locatie met hoge penetrantie. Het voorkomt potentiële ongewenste effecten die afkomstig zijn van genknock-out in NSCs in andere regio's, zoals de hersenen die optreden bij het gebruik van het CRE-LoxP-systeem. Het voorkomt ook ontwikkelingseffecten die afkomstig zijn van een aanhoudende knock-out, waardoor de studie ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Wij danken Prof. Elly M. Tanaka voor haar voortdurende en lange termijn ondersteuning. Dit werk werd gesteund door een National Natural Science Foundation van China (NSFC) Grant (317716), onderzoek startsubsidies van de South China Normal University (S82111 en 8S0109), en een China postdoctorale Science Foundation Grant (2018M633067).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0,03 % (wt/vol) | Meng 500 ml van 10 × TBS, 500 ml van 400% (wt/vol) Holtfreter's oplossing en 30 ml van 10% (wt/vol) benzocaine stockoplossing. Vul het volume aan tot 10 L met dH2O. De oplossing kan tot 6 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Meng 50 g benzocaine in 500 ml 100% (vol/vol) ethanol. De oplossing kan tot 12 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard. | ||
| Borosilicaat glazen capillairen 1,2 mm O.D., 0,94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Meng 200 mM HEPES en 1,5 M KCl in RNase-vrij water. Breng de pH op 7,5. Filter steriliseren, opdelen en bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 24 maanden | ||
| CAS9-NLS eiwit | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture schalen, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Fijne pincetten | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Oplossing, 5x | Los 12,5 mg Fast Green FCF poeder op in 10 mL van 1 × PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipet Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter's oplossing 400% (wt/vol) | Los 11,125 g van MgSO4·7H2O, 5,36 g van CaCl2·2H2O, 158,4 g van NaCl en 2,875 g van KCl op in 10 L dH2O. De oplossing kan tot 6 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatische PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ringpintset | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscoop | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-gebufferde zoutoplossing, 10x | Los 24,2 g Tris base en 90 g NaCl op in 990 ml dH2O. Breng de pH op 8,0 door 10 ml van 37% (vol/vol) HCl toe te voegen. De oplossing kan tot 6 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard. | ||
| Pincet met variabele opening 2 ronde platina elektrode, 10 mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Referenties
- O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002(2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260(2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
