Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen van kweken menselijke parodontitis ligament (PDL) cel sferoïden door Chitosan films. De cultuur van drie-dimensionale (3D) cellulaire sferoïden biedt een alternatief voor conventionele weefselcultuur polystyreen (TCPS) cultuursysteem.

Samenvatting

Parodontitis ligament (PDL) cellen houden grote belofte voor parodontitis weefselregeneratie. Conventioneel worden PDL-cellen gekweekt op twee-dimensionale (2D) substraten zoals weefselcultuur polystyreen (TCPS). Nochtans, zijn de kenmerkende veranderingen van PDL cellen waargenomen tijdens in vitro cultuur. Dit fenomeen is waarschijnlijk omdat de 2D TCPS verschilt van de in vivo driedimensionale (3D) microomgeving. In vergelijking met cellen die op 2D-substraten worden gekweekt, vertonen cellen in een 3D-omgeving meer gelijkenissen met in vivo cellen. Daarom, 3D-cel cultuur modellen bieden een veelbelovend alternatief voor conventionele 2D monolayer Cell cultuur. Ter verbetering van conventionele PDL Cell cultuur modellen, hebben we onlangs ontwikkelde een 3D-cel cultuurmethode, die is gebaseerd op sferoïde vorming van PDL cellen op Chitosan films. Hier presenteren we gedetailleerde Cell sferoïde cultuur protocollen op basis van Chitosan films. De 3D-cultuursysteem van PDL cellulaire sferoïden overwinnen enkele van de beperkingen met betrekking tot conventionele 2D monolayer cel cultuur, en kan dus geschikt zijn voor het produceren van PDL cellen met een verbeterde therapeutische werkzaamheid voor de toekomst parodontitis weefselregeneratie.

Inleiding

Parodontitis, voornamelijk geïnitialiseerd door tandplaque¹, wordt gekenmerkt door de schade van parodontitis met inbegrip van PARODONTITIS (PDL), alveolaire bot, en cementum. Huidige behandelingen voor parodontitis zijn meestal succesvol in het voorkomen van de voortgang van de actieve ziekte, maar de regeneratie van verloren parodontitis weefsels blijft een klinische uitdaging. Onlangs is belangrijke vooruitgang geboekt in de cel-gebaseerde benaderingen voor parodontitis weefselregeneratie om de nadelen van de huidige behandelingen te overwinnen^2,3,4.

Onze vorige systematische herziening bleek dat PDL cellen groot potentieel voor parodontitis regeneratie⁵toonde. Conventioneel worden PDL-cellen gekweekt op twee-dimensionale (2D) substraten zoals weefselcultuur polystyreen (TCPS). Nochtans, zijn de kenmerkende veranderingen van PDL cellen waargenomen tijdens in vitro cultuur⁶. Dit fenomeen is waarschijnlijk omdat de 2D TCPS verschilt van de in vivo driedimensionale (3D) microenvironment⁷. In vergelijking met cellen gekweekt op 2D substraten, cellen geteeld in een 3D-omgeving vertonen meer gelijkenissen met in vivo cellen⁸. Daarom, 3D-cel cultuur modellen bieden een veelbelovend alternatief voor conventionele 2D monolayer Cell cultuur.

Conventionele 3D-cultuurmethode is inkapselen van cellen in 3D biomaterialen. Vergeleken met cellen ingekapseld in 3D biomaterialen, cellulaire sferoïden na te bootsen de in vivo situatie nauwer omdat sferoïden zijn aggregaten van cellen groeien vrij van buitenlandse materialen^{9,10,11, 12}. men rapporteert dat cellulaire sferoïden MSC bioactiviteiten bevorderde via het behoud van extracellulaire matrijs (ECM) componenten met inbegrip van fibronectine en laminin¹³. Ter verbetering van conventionele PDL Cell cultuur modellen, hebben we onlangs ontwikkelde een 3D-PDL Cell cultuurmethode, die is gebaseerd op sferoïde vorming van PDL cellen op Chitosan films¹⁴. De vorming van sferoïde verhoogde de zelf-vernieuwing en osteogene differentiatie capaciteiten van PDL cellen¹⁴. Hier presenteren we gedetailleerde PDL Cell sferoïde cultuur protocollen op basis van Chitosan films. De 3D-cultuursysteem van PDL cellulaire sferoïden overwinnen enkele van de tekortkomingen in verband met conventionele TCPS cel cultuur, en kan dus geschikt zijn voor het produceren van PDL cellen met een verbeterde therapeutische werkzaamheid voor de toekomst parodontitis weefselregeneratie.

Protocol

Het studie protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de school en het ziekenhuis van stomatologie, Tongji University. Alle patiënten hebben schriftelijk geïnformeerde toestemming gegeven.

1. PDL cel isolatie

1. Maak proliferatie medium voor cultuur van PDL cellen: α-MEM medium aangevuld met 10% FCS en 100 U/mL pen/keelontsteking.
2. Bereid een container met ijs voor de overdracht van geïsoleerde derde kiezen.
3. Steriliseren chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf.
4. Uittreksel normale menselijke beïnvloed derde molaren van volwassenen (18-28 jaar) op de tandheelkundige kliniek van school en ziekenhuis van stomatologie, Tongji University.
5. Plaats derde molaren in het proliferatie middel en breng in het laboratorium bij 4 °C over.
6. Plaats de geëxtraheerde tand in een steriel 100 mm Petri schaaltje, werkend binnen een laminaire stromings kap.
7. Voeg 10 mL PBS toe om de geëxtraheerde tand te wassen. Herhaal de wassen stap tweemaal.
8. Door het gebruik van een steriel scalpel, zachtjes scheiden van de PDL van de wortel.
   Opmerking: PDL moet worden geschraapt uit het middelste derde deel van de wortel om verontreinigingen te voorkomen van gingivale of apicale weefsels.
9. Mince PDL in 1-2-mm fragmenten met de hulp van een gesteriliseerd scalpel mes.
10. Plaats PDL fragmenten in een T-25 kweek kolf, gevuld met 3-4 mL proliferatie medium.
11. Kweek de monsters in een incubator bij 37 °C in 5% CO₂ met bevochtigde lucht.
12. Verander het cultuurmiddel na uitgroei van PDL cellen werd waargenomen. Het duurt meestal 1-2 weken voor de uitgroei van PDL cellen. Observeer de uitgroei van PDL cellen via een omgekeerde fasecontrastmicroscoop.
13. Verander het kweekmedium tweemaal per week daarna.
14. Wanneer PDL cellen hebben bereikt samenvloeiing, sub-cultuur cellen op ratio van 1:4 (passage 1).
15. Observeer de celgroei dagelijks en verander de cultuurmedium twee keer per week.
16. Voer elke volgende passage op ratio van 1:4 na de cellen te bereiken 80% samenvloeiing. Gebruik derde-tot vijfde generatie van PDL-cellen voor cel zaaien.

2. bereiding van Chitosan films

1. Voor de bereiding van een 1% (v/v) azijnzuur-oplossing voegt u 5 mL azijnzuur toe aan 495 mL dubbel gedistilleerd water in een glazen bekerglas.
2. Voor de bereiding van 1% w/v Chitosan oplossing, Weeg 5 g Chitosan poeder (gemiddeld molecuulgewicht 400 kDa, 85% graad van acetylatie) en voeg toe aan 495 mL van 1% (v/v) azijnzuur oplossing.
3. Roer de voor bereide oplossing voor 24 uur met roeren bar en magnetische roeren plaat op 60 ° c.
4. Autoclaaf de voor bereide oplossing om volledige ontbinding van Chitosan te verzekeren.
   Opmerking: het experiment kan in dit stadium worden onderbroken.
5. Om Chitosan films te vormen, voeg 1% w/v Chitosan oplossing in weefselcultuur polystyreen (TCPS) schotels bij 0,25 mL/cm²toe. Bijvoorbeeld, Voeg 0,5 mL van 1% w/v Chitosan oplossing om een goed van 24-goed plaat.
6. Droge TCPS gerechten in een oven op 60 °C voor 24 uur tot Chitosan films te vormen.
7. Bereid 0,5 N natriumhydroxide (NaOH). Roer 10 g NaOH, een beetje in een tijd, in een groot volume van dubbel gedistilleerd water met behulp van de magnetische roer Bar, en Verdun de oplossing om 0,5 L te maken.
   Nota: Voeg NaOH aan water toe--voeg geen water aan stevige NaOH toe. Raak NaOH niet aan! Het kan leiden tot chemische brandwonden.
8. Neutraliseer Chitosan films met 0,5 N NaOH. Voeg 0,5 mL van 0,5 N NaOH oplossing om een put van 24-Well plaat voor 2 uur.
9. Was Chitosan films drie maal met dubbel gedistilleerd water.
   Opmerking: het experiment kan in dit stadium worden onderbroken.
10. Voorafgaand aan cel zaaien, steriliseren de Chitosan-Coated 24-Well platen in 70% alcohol overnachting bij kamertemperatuur.
11. Spoel Chitosan-gecoate platen drie maal met PBS bij kamertemperatuur.
12. Steriliseren Chitosan-gecoate platen door behandeling onder Ultravioletlicht 's nachts bij kamertemperatuur.

3. Cell zaaien

1. Pre-warm proliferatie middelgrote PBS oplossing en trypsine/EDTA oplossing aan 37 °C.
2. Gooi de bovendrijvende van de T-75 Cell Culture kolf.
3. Was confluente PDL-cellen met 10 mL PBS-oplossing.
4. De PBS-oplossing verwijderen.
5. Voeg 1 mL trypsine/EDTA-oplossing toe aan T-75 Cell Culture kolf.
6. Incubeer cellen met trypsine/EDTA-oplossing voor 3 min bij 37 °C.
7. Beëindig het spijsverteringsproces van trypsine door 3 mL proliferatie middel aan T-75 cel cultuur kolf toe te voegen.
8. Breng de voor bereide cel schorsing in een 15 mL kegel centrifugebuis.
9. Centrifugeer de suspensie gedurende 5 min bij 300 x g en kamertemperatuur.
10. Gooi de bovendrijvende van de 15 mL kegel centrifugebuis en de cel pellet in 500 µ L van proliferatie medium opnieuw op te schorten.
11. PDL-cellen tellen met een hemocytometer.
12. Zaad PDL cellen op de dichtheid van 0,5 x 10⁴, 1 x 10⁴, 3 x 10⁴, en 6 x 10⁴ cellen/cm².
13. De PDL cellen van de cultuur op Chitosan films in een incubator bij 37 °C in 5% CO₂ met bevochtigde lucht.
14. Verander het kweekmedium tweemaal per week daarna.
15. Op dagen 1, 2, 3, 4, en 5, observeer de cel morfologie dagelijks via een omgekeerde fasecontrastmicroscoop.

4. cel overleving

1. Na 1, 3 en 6 dagen van cultuur, bepalen het voortbestaan van de cellen met behulp van een commerciële levensvatbaarheid/chemo Kit.
2. Maak in een buis van 15 mL 2 mL van een nieuwe oplossing van 2 mM calceïne-AM en 4 mM ethidium homodimer in PBS door voor 5 s te vortexen.
   Opmerking: Houd het proces in het donker.
3. Verwijder het kweekmedium en was sferoïden in PBS.
4. Incubeer sferoïden in van PBS met 2 mM calceïne-AM en 4 mM ethidium homodimer voor 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
5. Spoel sferoïden tweemaal in PBS. Voor sferoïden van één put van 24-goed plaat, gebruik 2 mL PBS voor elke keer.
6. Observeer de monsters met behulp van een fluorescentiemicroscoop met 10x of 20x vergroting.

Resultaten

Met behulp van de huidige protocol, levensvatbare PDL Cell sferoïden werden met succes gevormd. Figuur 1 toonde aan dat zwevende cellen of sferoïden in plaats van bijgevoegde cellen vooral werden waargenomen op Chitosan films. Voor de het zaaien dichtheid van 0,5 x 10⁴ cellen/cm², werden de in bijlage PDL cellen nu en dan gevonden op dag 1 en 3, en PDL de cel sferoïden werden zelden waargenomen. In tegendeel, voor de het zaaien dichtheid...

Discussie

De huidige studie introduceerde een 3D-cel cultuursysteem om enkele beperkingen met betrekking tot conventionele 2D monolayer cel cultuur te overwinnen. Volgens het Protocol, werden PDL cellulaire sferoïden met succes gevormd door kweken cellen op Chitosan films. Onze vorige studie meldde dat sferoïde vorming verhoogde de zelf-vernieuwing en osteogene differentiatie capaciteiten van PDL cellen¹⁴. In plaats van het gebruiken van een enzym om cellen van TCPS te oogsten, zou de cel sferoïden van PDL ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
α-MEM	Gibco	11900-073
azijnzuur	Sigma-Aldrich	64197
Celcultuurfles 25 cm2	Corning	430639
Celcultuurfles 75 cm2	Corning	430641
Chitosan	Heppe Medical Chitosan GmbH	/	moleculair gewicht 500 kDa, mate van deacetylering 85%
FCS	Gibco	26140-079
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	Molecular Probes	L3224
NaOH	Sigma-Aldrich	1310732
PBS	KeyGen Biotech	KGB5001
pen/strep	Gibco	15140-122
Trypsin/EDTA	KeyGen Biotech	KGM25200
15 mL conische centrifugeerbuis	Corning	430790
24-well plate	Corning	3524