Methodenartikel

Voordelige Gait-analyse voor Gedragsfenotypen van Muismodellen van neuromusculaire ziekte

DOI:

10.3791/59878

⸱

18 juli 2019

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Duke University School of Medicine, 2Duke Center for Neurodegeneration & Neurotherapeutics, Duke University School of Medicine, 3Biomedical Sciences Graduate Program, University of California San Diego, 4Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Footprint Analysis is een voordelig alternatief voor gedigitaliseerde gang analyseprogramma's voor onderzoekers die bewegings afwijkingen bij muizen kwantificeren. Door zijn snelheid, eenvoud en longitudinale potentiaal is het ideaal voor het gedragsfenotypen van Muismodellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meting van de dier motoriek is een gemeenschappelijk gedrags instrument dat wordt gebruikt om het fenotype van een bepaalde ziekte, letsel of drug model te beschrijven. De goedkope methode van gang-analyse die hier wordt gedemonstreerd is een eenvoudige maar effectieve meting van afwijkingen in de gang in de Murine-modellen. Voetafdrukken worden geanalyseerd door het schilderen van de voeten van een muis met niet-giftige afwasbaar verf en waardoor het onderwerp te lopen door een tunnel op een vel papier. Het ontwerp van de test tunnel maakt gebruik van natuurlijk muisgedrag en hun affiniteit voor kleine donkere plaatsen. De paslengte, de breedte van de stap en de toe-spreiding van elke muis worden eenvoudig gemeten met een liniaal en een potlood. Dit is een gevestigde en betrouwbare methode en genereert verschillende metrische gegevens die analoog zijn aan digitale systemen. Deze aanpak is gevoelig genoeg om veranderingen in stap vroeg in fenotype-presentatie te detecteren, en vanwege de niet-invasieve benadering, maakt het testen van groepen over levensduur of fenotypische presentatie mogelijk.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Motoriek vereist complexe neurologische en musculoskeletale coördinatie, en tekorten in een enkel aspect van motorische trajecten kunnen waarneembare gang-afwijkingen1,2produceren. Gait-analyse is een essentieel hulpmiddel voor onderzoekers die Muismodellen testen, omdat het meetbare gedragsgegevens biedt over hoe een bepaalde ziekte, letsel of medicijn de beweging van een dier beïnvloedt3. Echter, gedigitaliseerde gang analyse vereist de aankoop van een loopband, een camera, en bijbehorende software, die buitensporig duur voor onderzoekers kan zijn. Gait-analyse wordt vaak gebruikt met tussenpozen om longitudinale veranderingen in de motorische functie bij te houden, vandaar dat het moeilijk kan zijn om de uitgaven te rechtvaardigen als deze sporadisch worden gebruikt4. Hoewel gedigitaliseerde analyses mogelijk gedetailleerdere gang-statistieken bieden dan eenvoudige footprint-analyse, zijn deze complexere maatregelen niet altijd noodzakelijk of relevant voor de karakterisering van een gedragsfenotype5.

Hier presenteren we een voordelige handmatige footprint-analysemethode als een snel en gevoelig alternatief voor gedigitaliseerde gang analyseprogramma's6,7. De handmatige footprint analyse is aangetoond dat er significante verschillen in de loop van de ziekte in een veelheid van muriene ziekten modellen4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17, en in ten minste één geval, deze goedkope methode geïdentificeerd veranderingen in gang die werden niet gedetecteerd door een gemeenschappelijk gedigitaliseerd gang-analyseprogramma12. De totale kosten van materialen zijn nominaal, en het kan gemakkelijk worden aangepast aan andere knaagdier onderzoekmodellen.

Hoewel er veel verschillende gang statistieken zijn waaruit gegevens kunnen worden getekend, richt de methode die we beschrijven op drie specifieke statistieken: staplengte, stap-breedte (alias "spoorbreedte") en teen spreiding. Het is belangrijk op te merken dat de te beoordelen parameters op basis van model-per-model moeten worden bepaald. Deze methode van gang-analyse is niet ontworpen om cognitieve functie te meten, en het wordt niet aanbevolen voor studies die complexe biomechanische metingen van gang16vereisen.

We presenteren gedragsgegevens uit een cohort van pre-en post-symptomatische muizen modellering X-linked spinale en bulbar musculaire atrofie (SBMA), een neuromusculaire aandoening gekenmerkt door motorische neuron degeneratie en spieratrofie. Deze muizen ontwikkelen progressieve tekorten in gang die samenvallen met het begin van andere ziektespecifieke fenotypes. Dit toont de geldigheid en specificiteit van deze methode aan en bevestigt dat zij op betrouwbare wijze kan discrimineren tussen getroffen en niet-aangetaste dieren.

De experimentele muizen in deze studie waren 2,5 (pre-symptomatische) en 9 maanden oude (post-symptomatische) BAC fxAR121 transgene muizen op een C57BL/6 achtergrond (nexpt= 12). Dit model is gegenereerd in ons lab en is volledig gekarakteriseerd als een krachtig muismodel van SBMA9. Niet-transgene littermates werden gebruikt als besturingselementen (nCTRL= 8). SBMA is een seks-beperkte ziekte die zich volledig manifesteert bij mannetjes, dus mannelijke muizen werden uitsluitend voor deze studie gebruikt. Tijdens de planningsfase, moeten onderzoekers rekening houden met de nationale instituten van gezondheid overwegingen van geslacht als een biologische variabele om te bepalen van de grootte van de groep en de samenstelling18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle tests uitgevoerd met muizen werden beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Duke University. Het personeel dat verantwoordelijk is voor het testen en scoren moet worden gebombardeerd tot dierlijk genotype of experimentele toestand totdat de gang-analyse en het scoren van papier voor de gehele cohort is voltooid.

1. voorbereiding van het testmateriaal

  1. Voer testen uit met een tunnel gebouwd van 3 voorgesneden Clear acryl panelen die 0,375 inch dik zijn. Monteer de tunnel door het lijmen van panelen samen met een Sealant die specifiek acryl bindt en geen geurtjes uitstraalt wanneer ze worden gedroogd.
    1. Gebruik voor standaard C57BL/6 muizen de volgende tunnel metingen: 2,5 in. Wide, 3 in. High en 13 in. Long. Muizen moeten comfortabel door de tunnel kunnen lopen en voldoende stappen kunnen nemen (> 4) zodat de gang kan worden gemeten.
  2. Bouw de doel kamer met voorgesneden grijze acryl panelen 0,375 inch dik, gelijmd samen met dezelfde Sealant als gebruikt op de tunnel. De binnenmaten van de kamer zijn 4 in. Wide, 4 in. Long en 3 in. Tall. Overeenkomen met de opening van deze kamer tot de opening van de tunnel (2,5 in. Wide x 3,0 in. Tall). Omdat de muizen de voorkeur geven aan verduisterd ruimten voor goed verlichte ruimten, gebruikt u materiaal dat ondoorzichtig en donker van kleur is.
  3. Gebruik papier voor het bijhouden van stappen die dik en soepel zijn (aquarel papier werkt goed). Snijd individuele papierstrips iets breder en langer dan de breedte en lengte van de tunnel. Als u de hier beschreven tunnel afmetingen gebruikt, knip dan de papiertjes naar 15 in. lang door 3,5 in. Wide.
  4. Gebruik twee contrasterende kleuren (bijv. groen en paars) van niet-giftige, afwasbare verf op waterbasis. Wijs één kleur voor achterpoten toe, de tweede voor forelimbs. Muizen zullen de resterende verf vanaf hun voeten likken na het testen, dus de geselecteerde verf moet volledig niet giftig zijn.
  5. Gebruik twee ronde spuit penselen, één voor elke Verfkleur (~ 0,5 cm in diameter, taps toelopende/puntige penseeluiteinde).
  6. Selecteer een liniaal met markeringen tot millimeters en een remklauw met metingen tot 0,1 mm. potlood wordt aanbevolen om te schrijven op de scoring papers.
  7. Optioneel: voor dieren met hoge angst of lage motivatie, bieden een gedrags stimulans in de doel kamer. Dit kan kleine hoeveelheden gesteriliseerde zonnebloempitten bevatten (2 dagen voorafgaand aan het testen in de huis kooi worden geplaatst om gegewijze toe te laten). Op de dag van de test, plaats zonnebloempitten in de doel kamer om muizen aan te moedigen om door te lopen zonder te stoppen.

2. verzamelen van gegevens

  1. Als de test wordt uitgevoerd in een aparte ruimte, acclimeren van de muizen om de nieuwe kamer voor 30 minuten en dan beginnen met de gedragstesten. Bovendien, omdat muizen natuurlijk nachtelijke, zorg ervoor dat alle muizen zijn volledig wakker en alert voor ten minste 5 minuten voor het testen.
  2. Bereid de testopstelling voor door de tunnel over het papier te positioneren en het papier met de muis-ID en de testdatum te markeren. Plaats de doel kamer aan het einde van de tunnel en Verbind beide open uiteinden. Voeg zonnebloempitten toe aan het einde van de tunnel (in de doel kamer) voor motivatie indien nodig.
  3. Verwijder de muis om uit de kooi te worden getest en pak hem stevig vast door zijn Scruff, zorg ervoor dat je de staart vasthoudt om de beweging van de achterpoten te stabiliseren.
  4. Verf poten zodat de gehele onderzijde van alle tenen en het midden van de voet volledig bedekt zijn met verf. Herhaal dit met een contrasterende kleur verf op de achterpoten. Veeg alle verf af die de muis op andere delen van het lichaam krijgt met een schone, vochtige doek om vlekken te voorkomen die de gegevensverzameling kunnen verstoren.
    Opmerking: muis afhandeling moet worden uitgevoerd door ervaren onderzoekers om dier stress te minimaliseren.
  5. Plaats de muis aan het begin van de tunnel en laat het helemaal in de doel kamer lopen en haal de muis vervolgens op, veeg de voetjes voorzichtig af met een watergedempte doek en breng deze terug naar de huis kooi.
  6. Laat papier met voetafdrukken volledig drogen voordat u gaat scoren. Veeg het testgebied en de tunnel af met ethanol of een gelijkwaardige reinigingsoplossing tussen elk dier.

3. beoordelingscriteria

  1. Gebruik stappen die consistent zijn verdeeld met duidelijke, niet-vlekken voetafdrukken voor het scoren. Afbeelding 1B is een goed voorbeeld van een volgorde van de voetafdruk die kan worden gescoord. Voor het genereren van voldoende scoregegevens, moet er ten minste 2 opeenvolgende stappen van elke voet, maar 4-6 stappen per voet wordt aanbevolen. Neem niet de eerste en laatste voetafdrukken op het papier, omdat ze waarschijnlijk geen normale gang geven omdat de muis de loopsnelheid verandert.
  2. Gebruik staplengte, stap breedte en teen gespreid als drie verschillende metingen van de gang die kunnen worden geanalyseerd met behulp van deze methode.
    Opmerking: de lengte en breedte van de stride vereisen duidelijke sequentiële afdrukken waarbij de voorvoet van de voorvoet goed is gedefinieerd in Paint. Teen spread vereist geen opeenvolgende afdrukken voor het scoren, alleen duidelijke afdrukken van de eerste en laatste tenen op een enkele voet. Echter, als een bepaalde voetafdruk niet is opgenomen in metingen van de lengte of breedte van de stap, het kan niet worden gescoord voor teen spread. Alle drie de maatregelen worden in centimeters beoordeeld.
    1. Definieer de lengte van de stap als de afstand tussen twee opeenvolgende voetafdrukken gemaakt door dezelfde voet (d.w.z. één stap) (Figuur 1A, 1B).
      1. Teken met een potlood een cirkel van 2-4 mm rond het voorvoet gebied van zowel de forelimb-voetafdrukken (aangeduid met de toegewezen kleur hierboven) in een enkele stap en teken een lijn tussen hen met behulp van een liniaal.
      2. Noteer de afstand tussen twee afdrukken vanaf het midden van elke cirkel (d.w.z. het midden van elk voetpad) als rechts voor 1 (RF1) of links-voor 1 (LF1).
      3. Herhaal dit voor alle stappen die kunnen worden gescoord (RF2, LF2, RF3, LF3 enzovoort).
      4. Herhaal dit voor de voetafdrukken van linker-en rechter achterpoten.
      5. Gemiddelde alle individuele vastgelegde stap afstanden voor elke ledemaat. Voor statistische analyse kunnen individuele cohort leden samen worden berekend.
    2. Definieer de breedte van de stap als de maat van de afstand tussen de linker-en rechter voor-of achterpoten (Figuur 1A, 1B).
      1. Om deze afstand te beoordelen, tekent en meet u een lijn uit de omcirkelde voorvoet van een achterledemaat die loodrecht doorsnijdt met de lijn voor staplengte op de contralaterale Hind-ledemaat.
      2. Herhaal dit voor alle afdrukken van de achterledematen die kunnen worden gescoord en voer vervolgens de gemiddelde metingen uit. De berekeningsmethode voor de stap-breedte is hetzelfde voor voor-en achterpoten.
    3. Geef de teen spreiding als de afstand tussen de eerste en de laatste tenen op een enkele voor-of achtervoet voetafdruk (Figuur 1a, 1B).
      1. Gebruik de remklauwen om de afstand tussen de punt van de eerste teen print en de punt van de laatste teen print te meten.
      2. Herhaal dit voor alle prints van de achterledematen die kunnen worden gescoord en de metingen gemiddelde. De berekeningsmethode voor teen spread is hetzelfde voor voor-en achterpoten.
  3. Als het papier niet kan worden gescoord, laat het dier dan 10 minuten rusten voordat u het opnieuw probeert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met voldoende aantallen dieren is deze procedure in staat om gang-verschillen tussen muis genotypes, binnen dezelfde stam na verloop van tijd, te detecteren. Afbeelding 1B toont representatieve sporen van footprint beelden verzameld in ons lab, met behulp van een muismodel van X-linked spinale en bulbar musculaire atrofie (SBMA), een neurodegeneratieve aandoening die lagere motorneuronen en skeletspieren beïnvloedt. We hebben eerder gemeld dat mannelijke BAC fxAR121 transgene muizen signific...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de hierboven beschreven lage-kostenanalyse methode voor gang tonen we een succesvolle identificatie van verschillende parameters van gang dysfunctie op post-symptomatische leeftijden in het BAC fxAR121 muismodel van SBMA. Dalingen in de lengte van de stap zijn consistent met eerdere SBMA-onderzoeken naar muizen modellen en humane patiënten9. We laten ook voor de eerste keer zien dat er significante verschillen zijn in de neus van achterledematen die zich verspreiden in symptomatisch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen A.M. bedanken voor de identificatie van dieren. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Amerikaanse National Institutes of Health (R01 7 RF1 AG057264 A.R.L.S. en C.J.C. en R01 NS100023 aan A. R. L. S) en de spierdystrofie Association (basisonderzoek subsidie aan A.R.L.S., ontwikkeling subsidie aan C.J.C.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Calipern/an/amoet markeringen hebben tot 0,1 mm
Craft GlueE6000n/a
Footprint Paint (Tempera Paint)Artmindn/amoet niet giftig zijn
Round Barrel PaintbrushesSymply Simmonsn/a0,5 cm diameter
Rulern/an/amoet markeringen hebben tot millimeters
Scoring Paper (Watercolor Pads)Cansonn/aop maat gesneden
Tunnel and Goal ChamberInterstate Plasticsn/aop maat gesneden

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clarke, K. A., Still, J. Development and consistency of gait in the mouse. Physiology & Behavior. 73 (1-2), 159-164 (2001).
  2. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50(2015).
  3. Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 Unit 8 (2001).
  4. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Exercise induces behavioral recovery and attenuates neurochemical deficits in rodent models of Parkinson's disease. Neuroscience. 119 (3), 899-911 (2003).
  5. Pallier, P. N., Drew, C. J., Morton, A. J. The detection and measurement of locomotor deficits in a transgenic mouse model of Huntington's disease are task- and protocol-dependent: influence of non-motor factors on locomotor function. Brain Research Bulletin. 78 (6), 347-355 (2009).
  6. Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost Protocol of Footprint Analysis and Hanging Box Test for Mice Applied the Chronic Restraint Stress. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  7. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  8. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  9. Cortes, C. J., et al. Muscle expression of mutant androgen receptor accounts for systemic and motor neuron disease phenotypes in spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 82 (2), 295-307 (2014).
  10. D'Hooge, R., et al. Neuromotor alterations and cerebellar deficits in aged arylsulfatase A-deficient transgenic mice. Neuroscience Letters. 273 (2), 93-96 (1999).
  11. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  12. Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson's disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
  13. Harper, S. Q., et al. RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5820-5825 (2005).
  14. Lin, C. H., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10 (2), 137-144 (2001).
  15. Sopher, B. L., et al. Androgen receptor YAC transgenic mice recapitulate SBMA motor neuronopathy and implicate VEGF164 in the motor neuron degeneration. Neuron. 41 (5), 687-699 (2004).
  16. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Detection of behavioral impairments correlated to neurochemical deficits in mice treated with moderate doses of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Experimental Neurology. 178 (1), 80-90 (2002).
  17. Wheeler, V. C., et al. Early phenotypes that presage late-onset neurodegenerative disease allow testing of modifiers in Hdh CAG knock-in mice. Human Molecular Genetics. 11 (6), 633-640 (2002).
  18. Clayton, J. A., Collins, F. S. Policy: NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 509 (7500), 282-283 (2014).
  19. Maricelli, J. W., Lu, Q. L., Lin, D. C., Rodgers, B. D. Trendelenburg-Like Gait, Instability and Altered Step Patterns in a Mouse Model for Limb Girdle Muscular Dystrophy 2i. PLoS One. 11 (9), e0161984(2016).
  20. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Animals. 44 (2), 88-103 (2010).
  21. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Voetafdrukanalysepaslengtepasbreedteteenspreidingniet invasieve methodegoedkope techniek

Gerelateerde artikelen