Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

Summary

Hier is een protocol voor het onderzoek van de interacties tussen inheemse vorm, prefibrillar, en volwassen amyloïde fibrillen van verschillende peptiden en eiwitten met mitochondriën geïsoleerd uit verschillende weefsels en verschillende gebieden van de hersenen.

Abstract

Een groeiende hoeveelheid bewijs geeft aan dat membraan permeabilization, met inbegrip van interne membranen zoals mitochondriën, is een gemeenschappelijk kenmerk en primaire mechanisme van amyloïde aggregaat-geïnduceerde toxiciteit in neurodegeneratieve ziekten. Echter, de meeste rapporten beschrijven de mechanismen van membraan verstoring zijn gebaseerd op fosfolipide modelsystemen, en studies direct targeting gebeurtenissen die zich voordoen op het niveau van biologische membranen zijn zeldzaam. Hier beschreven is een model voor het bestuderen van de mechanismen van amyloïde toxiciteit op membraan niveau. Voor mitochondriale isolatie wordt dichtheidsgradiënt gebruikt om preparaten met minimale myeline besmetting te verkrijgen. Na de mitochondriale membraan integriteit bevestiging, de interactie van amyloïde fibrillen die voortvloeien uit α-synucleine, runderinsuline, en kip eiwit lysozym (hewl) met rat hersenen mitochondriën, als een in vitro biologisch model, wordt onderzocht. De resultaten tonen aan dat de behandeling van de mitochondriën van de hersenen met fibrillar assemblies verschillende graden van membraan permeabilization en ROS inhoud Enhancement kan veroorzaken. Dit duidt op structuur afhankelijke interacties tussen amyloïde fibrillen en mitochondriaal membraan. Er wordt gesuggereerd dat biofysische eigenschappen van amyloïde fibrillen en hun specifieke binding aan mitochondriale membranen uitleg kunnen geven voor sommige van deze waarnemingen.

Introduction

Amyloïde-gerelateerde aandoeningen, bekend als amylodoses, vormen een grote groep van ziekten die worden gedefinieerd door het verschijnen van onoplosbare eiwit afzettingen in verschillende weefsels en organen^1,2. Onder hen, neurodegeneratieve aandoeningen zijn de meest voorkomende vormen waarin eiwit aggregaten verschijnen in het centrale of perifere zenuwstelsel². Hoewel een aantal mechanismen is voorgesteld om betrokken te zijn bij de toxiciteit van amyloïde aggregaten³, wijst een groeiend geheel van bewijsmateriaal op verstoring van de celmembraan en permeisatie als het primaire mechanisme van amyloïde pathologie^{4, 5}. Naast plasma membraan, interne organellen (dat wil zeggen, mitochondriën) kan ook worden beïnvloed.

Interessant, opkomende bewijs suggereert dat mitochondriale dysfunctie speelt een cruciale rol in de pathogenese van neurodegeneratieve aandoeningen, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson^6,7. In overeenstemming met deze kwestie, talrijke rapporten hebben aangegeven binding en accumulatie van amyloïde β-peptide, α-synuclein, huntingtine, en als-gebonden Mutant SOD1 eiwitten aan mitochondriën^{8,9,10, 11}. het mechanisme van membraan permeisatie door amyloïde aggregaten wordt verondersteld te gebeuren door vorming van discrete kanalen (poriën) en/of door middel van een niet-specifiek detergens-achtige mechanisme^{5,12, 13}. Het is opmerkelijk dat de meeste van deze conclusies zijn gebaseerd op rapporten met betrekking tot fosfolipide modelsystemen, en studies direct gericht op de gebeurtenissen die zich voordoen in biologische membranen zijn zeldzaam. Duidelijk, deze kunstmatige lipide bilayers niet noodzakelijkerwijs weerspiegelen de intrinsieke eigenschappen van biologische membranen, met inbegrip van die van de mitochondriën, die heterogene structuren en samengesteld uit een breed scala van fosfolipiden en eiwitten.

In de huidige studie, mitochondriën geïsoleerd van rat hersenen worden gebruikt als een in vitro biologisch model om te onderzoeken van de destructieve effecten van amyloïde fibrillen die voortvloeien uit α-synucleine (als een amyloidogenic eiwit), bovine insuline (als een model peptide tonen significante structurele homologie met humane insuline die betrokken zijn bij injectie-gelokaliseerde Amyloïdose), en kip eiwit lysozym (hewl; als een gemeenschappelijk model eiwit voor studie van amyloïde aggregatie). De interacties en mogelijke schade van mitochondriale membranen geïnduceerd door amyloïde fibrillen worden vervolgens onderzocht door het observeren van het vrijkomen van mitochondriale malaat dehydrogenase (MDH) (gelegen in de mitochondriale matrix) en mitochondriën reactieve zuurstof Soort (ROS) Enhancement.

Protocol

Alle dier experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de medische wetenschappen van de Universiteit van Teheran. Er werden maximale inspanningen geleverd om het lijden en de nadelige effecten voor de ratten te minimaliseren door de guillotine bladen te verscherpen en resolute en snelle bewegingen van het blad toe te passen.

1. hersen homogenisatie en mitochondriale isolatie

Opmerking: alle reagentia voor mitochondriale isolatie werden bereid volgens de Sims en Anderson¹⁴.

1. Bereiding van buffers voor mitochondriale isolatie
   1. Bereid een 100 mM tris-HCl-oplossing voor: Weeg 0,605 g tris-HCl af en los deze op in ongeveer 40 mL gedeïoniseerd water (DW) in een bekerglas. Breng de oplossing over in een maatkolf van 50 mL en verhoog het eindvolume tot 50 mL door DW toe te voegen.
   2. Bereid een EDTA-oplossing van 10 mM: Weeg 0,202 g EDTA af en los deze op in ongeveer 40 mL DW in een bekerglas. Breng de oplossing over in een maatkolf van 50 mL en verhoog het eindvolume tot 50 mL door DW toe te voegen.
      NB: beide oplossingen kunnen gedurende ten minste 4 weken bij 4 °C worden bewaard.
   3. Bereid een tris-HCl/EDTA/sucrose stockoplossing: Voeg 30 mL 100 mM tris-HCl en 30 mL EDTA in een bekerglas toe. Weeg 32,86 g sucrose af en voeg deze toe aan het bekerglas terwijl u met een magneetroerder roeren. Wanneer de sacharose is opgelost, breng de oplossing over naar een maatkolf van 100 mL en verhoog het eindvolume tot 100 mL door DW toe te voegen.
      Opmerking: deze oplossing kan maximaal 3 dagen bij 4 °C worden bewaard.
   4. Maak een isolatie buffer (IB): Voeg 100 mL tris-HCl/EDTA/sucrose kolf toe aan ongeveer 150 mL DW. Pas de pH op 7,4 door toevoeging van 0,1 M HCl. Verhoog het eindvolume tot 300 mL door DW toe te voegen.
   5. Bereid 15% (v/v) dichtheidsgradiënt in met IB door toevoeging van 1,5 mL dichtheidsgradiënt medium aan 8,5 mL koude IB.
   6. Bereid 10 mg/mL boviene serumalbumine (BSA) oplossing: Weeg 20 mg vetzuur vrije BSA af en los deze op in ongeveer 1,5 mL DW in een 2 mL injectieflacon. Verhoog het eindvolume tot 2 mL door DW toe te voegen en op te slaan op ijs tot het gebruik.
      Opmerking: bereid de oplossingen vers van stap 1.1.4 – 1.1.6 op de dag van de mitochondriale isolatie en bewaar ze op ijs tot gebruik.
2. Isolatie van de hersenen van de rat
   Opmerking: onthoofding en hersen verwijdering van mannetjesratten (150 – 200 g) werden uitgevoerd volgens de Sims en Anderson¹⁴.
   1. Plaats een bekerglas van 30 mL in een ijsemmer en voeg 10 mL koude IB toe aan het bekerglas.
   2. Onthoofde rat met een kleine dierlijke guillotine en verwijder de hersenen van de schedel binnen 1 minuut na het onthoofding om de verslechtering van de mitochondriale eigenschappen te beperken.
   3. Breng de hersenen snel over in het bekerglas dat koude IB bevat.
3. Brain homogenisatie en voorbereiding van mitochondriën
   Opmerking: mitochondriale breuken werden geïsoleerd volgens het protocol beschreven door Sims en Anderson¹⁴, met enkele wijzigingen zoals eerder beschreven¹⁵. Het is belangrijk om snel te werken en alles op ijs te houden gedurende de hele procedure.
   1. Was het weefsel 2x met 30 mL IB, breng het over in een beker met Cold IB en snijd de hersenen fijn met een schaar.
   2. Voeg 10 volumes voorgekoelde IB (ongeveer 10 mL IB per rat brein) toe.
   3. Breng de weefsel suspensie over in een koude Dounce homogenisator van 20 mL.
   4. Homogeniseren de weefsel stukken met behulp van negen omhoog-en-omlaag slagen met een gemotoriseerde stamper.
      Opmerking: laat het mengsel op ijs gedurende ongeveer 30 sec. na elke set van drie homogenisatie slagen om ervoor te zorgen dat het homogenaat koud blijft.
   5. Breng het homogenaat over in een voorgekoelde centrifugebuis van 10 mL en Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1, 300x g en 4 °c.
   6. Decanteren zorgvuldig het supernatant en breng het over in een voorgekoelde centrifugebuis van 10 mL en centrifugeer op 21, 000x g bij 4 °c gedurende 10 minuten.
   7. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in een koude 15% dichtheidsgradiënt oplossing (5 mL voor elke hersenen) door het mengsel zachtjes met een pipet te roeren.
   8. Centrifugeer in een rotor met een vaste hoek bij 30, 700x g bij 4 °c gedurende 5 minuten met langzame acceleratie (45 s van 0 rpm tot 500 rpm, gevolgd door een normale acceleratie) en vertraging (geen remmen). Dit moet twee verschillende materiaal klassen produceren (Figuur 1a, links).
   9. Met behulp van een Pasteur-pipet verwijdert u de scherpe band van het materiaal dat aan de bovenkant van het verloop is opgebouwd, dat meestal myeline bevat. Verwijder vervolgens de dichtheidsgradiënt medium oplossing boven het materiaal (in band 2) zoveel mogelijk zonder verlies van een van de verrijkte mitochondriale breuk in band 2.
      Opmerking: de band 2 bevat zowel de synaptische en niet-synaptische mitochondriën.
   10. Voeg 8 mL IB toe aan de mitochondriale fractie terwijl het mengsel zachtjes met een pipet wordt geroerd.
   11. Centrifugeer op 16, 700x g bij 4 °c gedurende 10 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant, waardoor de onderste losse pellet ongestoord wordt verwijderd.
   12. Voeg 1 mL van 10 mg/mL vetzuur vrije BSA toe aan de centrifugebuis terwijl het mengsel zachtjes met de punt van een pipet wordt geroerd. Verhoog het eindvolume tot 5 mL per hersenen door het toevoegen van IB.
   13. Centrifugeer op 6, 900x g bij 4 °c gedurende 10 minuten, wat een stevige pellet moet produceren (Figuur 1a, rechts).
   14. Decanteer de supernatant en breng de mitochondriale pellet in IB, aliquot ze in 0,5 mL tubes, en bewaar in vloeibare stikstof tot gebruik.

2. bepaling van de eiwitconcentratie

Opmerking: de eiwitconcentratie wordt gemeten met behulp van de methode van Lowry et al.¹⁶.

1. Bereiding van oplossingen voor Lowry assay
   1. Oplossing voorbereiden A: Weeg 0,4 g NaOH en 2 g na₂co₃ af en los op in 80 ml DW, breng de oplossing over in een maatkolf van 100 ml en verhoog het volume tot 100 ml door DW toe te voegen.
   2. Bereid oplossing B: Weeg 0,1 g kalium natriumtartraat en 0,05 g CuSO₄ en los in 8 ml DW op, breng de oplossing over in een maatkolf van 10 ml en verhoog het volume tot 10 ml door DW toe te voegen.
      NB: beide oplossingen A en B kunnen gedurende maximaal 6 maanden stabiel blijven bij 4 °C.
   3. Oplossing bereiden C: Voeg 0,5 mL Folin oplossing toe aan 7,5 mL DW.
      Opmerking: bereid de oplossing C vers voor en houd ze uit de buurt van licht tot gebruik.
   4. Bereid de BSA-normen voor met de uiteindelijke concentraties van 0, 20, 40, 60, 80, 100 en 120 μg/mL door respectievelijk 0, 20, 40, 60, 80, 100 en 120 μL van 1 mg/mL BSA te combineren met voldoende DW om 1000 μL oplossing te maken.
2. Meting van de eiwitconcentratie
   Opmerking: Voer deze stap uit in Triplicate voor meer nauwkeurigheid.
   1. Voeg 50 μL standaard oplossingen en mitochondriale homogenaat toe aan elk goed van een 96-put, gevolgd door toevoeging van 45 μL oplossing A. Inbroed vervolgens de plaat 10 min in een warmwaterbad ingesteld op 50 °C.
   2. Voeg 5 μL oplossing B toe en inincuberen de plaat gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur (RT).
   3. Voeg 150 μL oplossing C toe en inincuberen de plaat gedurende 10 minuten in een warmwaterbad ingesteld op 50 °C.
   4. Laad de plaat in een plaat lezer en noteer de absorptie waarden voor standaarden en mitochondriale suspensie bij 650 nm. Vervolgens, met behulp van een kalibratiecurve, bereken het eiwitgehalte van de mitochondriën.

3. bepaling van de integriteit van mitochondriale membraan

Opmerking: de integriteit van mitochondriale membraan wordt bevestigd door het meten van malaat dehydrogenase (MDH) activiteit in geïsoleerde mitochondriën voor en na verstoring van het membraan door Triton X-100.

1. Verdun mitochondriale homogenaat tot 1 mg/mL met Cold IB en geplaatst in twee buisjes van 1,5 mL (gewoonlijk 195 μL mitochondriën per buis).
2. Voeg 5 μL 20% (v/v) Triton X-100 (verdund met DW) toe aan één buis (als een positieve controle voor maximale enzymactiviteit) en 5 μL DW naar een andere buis (voor controle) gevolgd door menging met een roerder.
3. Inbroed de buisjes gedurende 10 min in een warmwaterbad ingesteld op 30 °C.
4. De mitochondriën van de pellet door centrifugeren van buizen in een vaste hoekrotor bij 16.000 x g en 4 °c gedurende 15 minuten.
5. Verzamel zorgvuldig de resulterende supernatanten voor het aszeggen van de activiteit van mitochondriale MDH met behulp van een standaard spectrofotometrische assay zoals beschreven in de volgende sectie.
6. Bereken de integriteit van het mitochondriale membraan als volgt:
   

4. bepaling van de MDH-activiteit

Opmerking: MDH-activiteit werd gemeten spectrophotometrisch zoals beschreven door Sottocasa et al.¹⁷.

1. Voorbereiding van oplossingen voor de MDH-activiteitstest
   1. Bereid een 50 mM tris-HCl oplossing (pH = 7,5): bereid een 7,9 mg/mL oplossing in DW met tris-HCl en stel de pH in op 7,5 bij 25 °C met 1,0 M NaOH.
   2. Bereid een 50 mM Oxaloacetaat oplossing voor: bereid een 6,6 mg/mL oplossing met behulp van Oxaloacetaat in tris-HCl.
      Opmerking: deze oplossing is niet stabiel eenmaal in de oplossing en moet onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik worden bereid.
   3. Bereid een 10 mM β-NADH oplossing: bereid een 7,81 mg/mL oplossing met β-NADH in tris-HCl.
2. Bepaling van de MDH-activiteit
   NB: de Eindassay concentraties in een reactiemengsel van 1,0 mL zijn 50 mM tris-HCl, 5 mM Oxaloacetaat en 0,1 mM β-NADH.
   1. Stel de spectrofotometer in op 25 °C en 340 nm. Pipetteer 890 μL tris-HCl-buffer, 100 μL Oxaloacetaat oplossing en 10 μL NADH-oplossing voor een lege cuvette en 880 μL tris-HCl-buffer, 100 μL Oxaloacetaat oplossing en 10 μL NADH-oplossing in een monster Cuvette.
   2. Incuberen cuvetten in de spectrofotometer gedurende 3 – 4 minuten en verwijzen naar blanco.
   3. Voeg vervolgens 10 μL mitochondriaal homogenaat (1 mg/mL) toe aan de monster cuvette, meng onmiddellijk door inversie, en record dalingen in de extinctie als gevolg van NADH-oxidatie bij 340 nm gedurende 1 minuut.

5. in vitro α-synucleine, boviene insuline en HEWL fibril vorming

1. Eiwit preparaat
   1. α-synuclein:
      Opmerking: expressie en zuivering van recombinant α-synuclein wordt uitgevoerd zoals beschreven door Hoyer et al.¹⁸ met enkele modificaties, en de zuiverheid van α-synuclein wordt bevestigd door SDS-page.
      1. Dialyze gezuiverde α-synuclein 's nachts tegen fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
      2. Bepaal de eiwitconcentratie met een extinctiecoëfficiënt van 5600 M^-1 cm^-1 bij 275 nm¹⁹.
      3. Aliquots eiwit in 1,5 mL buizen en bewaren bij-80 °C tot het gebruik.
   2. Boviene insuline en HEWL:
      1. Zorg voor zowel runderinsuline als HEWL.
      2. Los elk eiwit op in 50 mM Glycine buffer (pH = 1,6; Pas de pH aan met HCl).
      3. Bepaal de concentratie van runderinsuline en hewl met een extinctiecoëfficiënt van 1,0 en 2,63 voor 1,0 mg/ml bij 276 nm en 280 nm, respectievelijk^20,21.
2. Amyloid fibrillatie inductie
   1. Bereiding van oplossingen voor amyloïde fibrillatie:
      1. Bereiding thioflavin T (ThT) buffer: Weeg 0,3 g van NaH₂po₄ en los het op in 80 ml DW, stel de pH in op 6,5 en verhoog het volume tot 100 ml door DW toe te voegen.
      2. Bereiding ThT Stock Solution (5 mM): Weeg 1,6 mg ThT en los het op in 1 mL ThT buffer, loop door een 0,22 μm filtreerpapier en blijf bij 4 °C uit de buurt van licht tot gebruik.
         Opmerking: deze oplossing kan maximaal 4 weken bij 4 °C worden bewaard.
      3. ThT-oplossing voorbereiden (1 mM): Voeg 200 μL ThT-stamoplossing (5 mM) toe aan 800 μL ThT-buffer.
         Opmerking: deze oplossing kan maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
   2. In vitro α-synuclein amyloïde fibril vorming:
      1. Voeg aliquots (294 μL) eiwit oplossing (200 μM) en 6 μL ThT-oplossing (1 mM) toe aan buizen van 1,5 mL, gevolgd door roeren.
      2. Incuberen de buisjes in een thermomixer bij 37 °C onder constant roeren bij 800 rpm gedurende 4 dagen.
      3. Neem aliquots (10 μL) van geïnde monsters na regelmatige tijdsintervallen en voeg 490 μL ThT-buffer toe, grondig gemengd, en inincuberen gedurende 5 minuten bij RT.
      4. Stel excitatie-en emissie spleet breedtes in als respectievelijk 5 nm en 10 nm en meet ThT fluorescentie door excitatie bij 440 nm en uitstoot bij 485 nm met behulp van een fluorescentie spectrofotometer.
   3. In vitro bovine insuline amyloïde fibril vorming:
      1. Voeg 637 μL eiwit oplossing (250 μM) toe aan de buis van 1,5 mL. Voeg vervolgens 13 μL ThT-oplossing (1 mM) toe, gevolgd door roeren.
      2. Voeg aliquots (200 μL) eiwit oplossing (250 μM) met 20 μM ThT toe aan elk goed van een 96 goed met een heldere bodem en sluit de plaat af met een kristalheldere afdichtingsband.
      3. Plaats de plaat in een fluorescentie plaat lezer en incuberen bij 57 °C zonder roeren.
      4. Meet de fluorescentie op 30 min-intervallen, met excitatie bij 440 nm en emissie bij 485 nm, gedurende 12 uur.
         Opmerking: schud de plaat 5 sec. vóór elke meting.
   4. In vitro HEWL-amyloïde fibril vorming:
      1. Voeg aliquots (200 μL) eiwit oplossing) 1 mM) met 20 μM ThT aan elk goed van een heldere bodem 96 goed plaat en verzegelen de plaat met kristalheldere afdichtingsband.
      2. Plaats de plaat in een fluorescentie plaat lezer en incuberen bij 57 °C zonder roeren.
      3. Meet de fluorescentie bij 2 uur, met excitatie bij 440 nm en emissie bij 485 nm, gedurende 4 dagen.
         Opmerking: voor alle drie de eiwitten wordt de amyloïde fibril vorming bevestigd door een atoom kracht microscopie (Figuur 2b).

6. behandeling van mitochondriën met amyloïde fibrils, MDH-vrijgave test en ROS-meting

1. Incubatie van geïsoleerde mitochondriën met amyloïde fibrillen
   1. Schakel centrifuge en warmwaterbad in en stel deze in op respectievelijk 4 °C en 30 °C.
   2. Gebruik indien, Verdun mitochondriale homogenaat tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL.
   3. Bereid twee series van 1,5 mL buisjes met mitochondriale homogenaten (één reeks voor de MDH-afgifte test en een andere voor de mitochondriale ROS-meting).
   4. Voeg aliquots toe van verse of amyloïde fibrillen van α-synucleine, runderinsuline of hewl (in de uiteindelijke concentraties van 5 μm, 10 μm, 20 μm en 25 μm; gebruik PBS of Glycine buffer als een controle) op mitochondriale homogenaat (eindvolume = 200 μL) (Zie tabel 1, tabel 2 en tabel 3) gevolgd door de oplossing zachtjes te roeren met een pipet.
      Opmerking: gebruik voor de MDH-vrijgave test de Triton X-100 (bij een eindconcentratie van 0,5% [v/v]) als een positieve controle voor de maximale afgifte van enzymen.
   5. Incubate buisjes met mitochondriale suspensies gedurende 30 min in warmwaterbad ingesteld op 30 °C.
   6. Meet de mitochondriale MDH-release en ROS-inhoud zoals beschreven in de paragrafen 6,2 en 6,3.
2. Mitochondriale MDH release assay
   1. Centrifugeer de geïnincubeerde mitochondriale homogeniteert bij 16.000 x g gedurende 15 minuten en verzamel vervolgens zorgvuldig de resulterende supernatanten voor het aszeggen van de activiteit van mitochondriale MDH zoals beschreven in rubriek 4.
   2. Bereken de afgifte van MDH als een fractie van het maximale effect (Triton X-100) als volgt:

3. Mitochondriale ROS meting
   Opmerking: mitochondriale ROS-inhoud wordt bepaald met de oxidatie gevoelige fluorogene precursor dihydrodichloorcarboxyfluorescein DIACETAAT (DCFDA)²².
   1. Bereid oplossingen voor mitochondriale ROS meting. Bereid een oplossing van 50 μM DCFDA door oplossen in methanol (bereid vers) en een 200 mM succinaat oplossing door oplossen in DW.
   2. Pipetteer 191 μL geïnineerd mitochondriaal homogenaat tot elke put van een 96-goed plaat en voeg 4 μL 50 μM DCFDA (eindconcentratie van 1 μM) en 5 μL 200 mM succinaat (eindconcentratie van 5 mM) toe.
   3. Inbroed de plaat gedurende 30 minuten in een warmwaterbad ingesteld op 30 °C terwijl deze zachtjes roeren.
   4. Plaats de plaat in een fluorescentie plaat lezer en meet de intensiteit van de fluorescentie, met een excitatie van 485 nm en een emissie van 530 nm.

7. statistische analyse

1. Voer alle experimenten ten minste 2x of 3x uit met drievoud assays en voer de juiste statistische tests uit. Hier worden de resultaten gepresenteerd als gemiddelde ± SD, en de gekoppelde t-toets van een student werd gebruikt om statistische significantie te berekenen. P-waarden kleiner dan 0,01 en 0,05 werden als statistisch significant beschouwd (* p < 0,05; * * p < 0,01).

Results

Het protocol beschrijft een model voor het bestuderen van de interacties van amyloïde fibril met rat hersenen mitochondriën als een in vitro biologisch model. Voor de mitochondriale bereiding werd 15% (v/v) dichtheidsgradiënt medium gebruikt om myeline te verwijderen als grote besmetting van hersenweefsel¹⁴. Zoals weergegeven in Figuur 1a, produceerde centrifugeren op 30.700 x g twee verschillende materiaal klassen, myeline (

Discussion

Een schat aan experimentele resultaten ondersteunt de hypothese dat de cytotoxiciteit van fibrillar aggregaten significant wordt geassocieerd met hun vermogen om te interageren met en permeabilize biologische membranen^4,5. Echter, de meeste van de gegevens zijn gebaseerd op kunstmatige lipide-bilayers die niet noodzakelijkerwijs de intrinsieke eigenschappen van biologische membranen weerspiegelen, die heterogene structuren met een breed scala van fosfolipiden en ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate	Sigma	35845
Ammonium sulfate	Merck	1012171000
Zwarte 96-well plaat	Corning
Zwarte 96-well plaat met heldere bodem	Corning
Rundereiwit insuline	Sigma	I6634
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma	A2153
BSA vrij van vetzuren	Sigma	A6003
Centrifuge	Sigma
Kristalheldere afdichtingstape	Corning
CuSO4	Sigma	451657
Dialysezakje (afsnijpunt 2 KDa)	Sigma	D2272
Dounce homogenisator	Potter Elvehjem
EDTA	Sigma	E9884
Fluorescentie plate reader	BioTek
Fluorescentie spectrofotometer	Cary Eclipse VARIAN
Folin	Merck	F9252
Glycine	Sigma	G7126
Guillotine	Gemaakt in Iran
HCl	Merck	H1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL)	Sigma	L6876
Na2CO3	Sigma	S7795
NaH2PO4	Sigma	S7907
NaOH	Merck	S8045
Oxaloacetaat	Sigma	O4126
Percoll	GE Healthcare
Fosfaatbufferoplossing (PBS)	Sigma	CS0030
PMSF	Sigma	P7626
Kaliumnatriumtartraat	Sigma	217255
Kwarts cuvet	Sigma
Spectrofotometer	analytik jena	SPEKOL 2000 model
Succinaat	Sigma	S2378
Sucrose	Merck	1076871000
Thermomixer	Eppendorph
Thioflavine T	Sigma	T3516
Tris-HCl	Merck	1082191000
Triton X-100	Sigma	T9284
Tryptone	QUELAB
Waterbad	Memmert
Gistextract	QUELAB
β-NADH	Sigma	N8129