Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Tumorsphere afleiding en behandeling van primaire tumor cellen geïsoleerd van de muis Rhabdomyosarcomas

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59897

⸱

13 september 2019

 , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Development, Aging and Regeneration Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, Division of Female Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University California San Diego

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare methode voor isolatie van muizen rhabdomyosarcoom primaire cellen, tumorsphere vorming en behandeling, en transplantaat transplantatie vanaf tumorspheres culturen.

Samenvatting

Rhabdomyosarcoom (RMS) is het meest voorkomende wekedelensarcoom bij kinderen. Hoewel aanzienlijke inspanningen de identificatie van gemeenschappelijke mutaties in verband met RMS mogelijk hebben gemaakt en discriminatie van verschillende RMS-subtypen hebben toegestaan, bestaan er nog steeds grote uitdagingen voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen om de prognose verder te verbeteren. Hoewel geïdentificeerd door de uitdrukking van myogenic markers, er is nog steeds belangrijke controverse over de vraag of RMS myogenic of niet-myogenic oorsprong heeft, als de cel van oorsprong nog steeds slecht wordt begrepen. In de huidige studie wordt een betrouwbare methode geboden voor de tumorsphere assay voor muis RMS. De assay is gebaseerd op functionele eigenschappen van tumorcellen en maakt het mogelijk de identificatie van zeldzame populaties in de tumor met tumorigene functies. Ook beschreven zijn procedures voor het testen van recombinante eiwitten, het integreren van transfectie protocollen met de tumorsphere Assay, en het evalueren van kandidaatgenen die betrokken zijn bij tumor ontwikkeling en groei. Verder beschreven is een procedure voor allotransplantaat transplantatie van tumorferen in ontvangende muizen te valideren tumorigene functie in vivo. Over het algemeen maakt de beschreven methode betrouwbare identificatie en het testen van zeldzame RMS tumorigene populaties die kunnen worden toegepast op de RMS die in verschillende contexten. Tot slot, het protocol kan worden gebruikt als een platform voor drug screening en toekomstige ontwikkeling van Therapeutics.

Inleiding

Kanker is een heterogene ziekte; Bovendien kan hetzelfde type tumor verschillende genetische mutaties bij verschillende patiënten presenteren, en binnen een patiënt bestaat een tumor uit meerdere populaties cellen1. Heterogeniteit vormt een uitdaging bij de identificatie van cellen die verantwoordelijk zijn voor het initiëren en propageren van kanker, maar hun karakterisering is essentieel voor de ontwikkeling van efficiënte behandelingen. De notie van tumor propageren cellen (TPC), een zeldzame populatie van cellen die bijdragen aan de ontwikkeling van de tumor, is eerder uitgebreid beoordeeld2. Ondanks het feit dat tpc's zijn gekenmerkt in meerdere soorten kanker, de identificatie van markers voor hun betrouwbare isolatie blijft een uitdaging voor verschillende tumortypes3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. zo kan een methode die niet afhankelijk is van moleculaire markers, maar eerder van functionele eigenschappen van TPC (hoge zelf vernieuwing en de mogelijkheid om te groeien in omstandigheden met weinig gehechtheid), bekend als de tumorsphere Formation Assay, op grote schaal worden toegepast voor de identificatie van Tpc's van de meeste tumoren. Belangrijk is dat deze test ook kan worden gebruikt voor de uitbreiding van tpc's en dus rechtstreeks wordt toegepast op de screening van kankergeneesmiddelen en studies over kanker resistentie1,10.

Rhabdomyosarcoom (RMS) is een zeldzame vorm van wekedelensarcoom die het meest voorkomt bij jonge kinderen11. Althoug RMS kan histologisch worden geïdentificeerd door middel van de beoordeling van de expressie van myogene markers, de RMS-cel van oorsprong is niet eenzijdig gekarakteriseerd als gevolg van de meerdere tumor subtypen en een hoge heterogeniteit van de tumor-ontwikkelings stimuli. Inderdaad, recente studies hebben gegenereerd belangrijke wetenschappelijke discussie over de vraag of de RMS van myogene of niet-myogenic oorsprong is, wat suggereert dat RMS kan voortvloeien uit verschillende soorten cellen, afhankelijk van de context12,13, 14 , 15 , 16 , 17. talrijke studies over RMS-cellijnen zijn uitgevoerd met de tumorsphere Formation assay voor de identificatie van trajecten die betrokken zijn bij de ontwikkeling van tumoren en de karakterisering van markers in verband met zeer zelfvernieuwings populaties 18 , 19 , 20 , 21.

Ondanks de mogelijkheid van tumorsphere Formation om RMS-cellen van oorsprong te identificeren, is echter nog geen betrouwbare methode beschreven die kan worden toegepast op primaire RMS-cellen. In deze context heeft een recente studie van onze groep een geoptimaliseerde tumorsphere-formatie test gebruikt voor de identificatie van de RMS-cellen van oorsprong in een Duchenne-spierdystrofie (DMD) muismodel22. Meerdere pre-tumorigenic celtypen, geïsoleerd uit spierweefsels, worden getest op hun vermogen om te groeien in lage-gehechtheid voorwaarden, waardoor de identificatie van spier stamcellen als cellen van oorsprong voor RMS in dystrofische contexten. Hier beschreven is een reproduceerbaar en betrouwbaar protocol voor de tumorsphere Formation assay (Figuur 1), die met succes is gebruikt voor de identificatie van uiterst zeldzame celpopulaties die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van de muis RMS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De huisvesting, de behandeling en de opoffering van muizen werden uitgevoerd volgens het goedgekeurde IACUC-Protocol van het Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.

1. bereiding van het reagens

  1. Bereid 100 mL celisolatiemedia voor: F10 medium aangevuld met 10% paarden serum (HS).
  2. Bereid 50 mL Collagenase type II-oplossing: Los 1 g Collagenase type II poeder op in 50 mL celisolatiemedia (Noteer de eenheden van het enzym per 1 mL media, aangezien het aantal eenheden afhankelijk van de partij verandert). Aliquot de oplossing en bewaar deze in een vriezer van-20 °C tot ze klaar zijn voor gebruik.
    Opmerking: elke partij Collagenase moet vóór gebruik worden getest, omdat de enzymactiviteit over verschillende partijen kan veranderen.
  3. Bereid 10 mL per monster van de tweede spijsvertering oplossing: cellen isolatie media met 100 eenheden/mL Collagenase type II oplossing en 2 eenheden/mL dispase II vers gewogen. Bereid onmiddellijk voor gebruik.
  4. Bereid 500 mL van tumorcellen media: DMEM hoge glucose aangevuld met 20% FBS en 1% pen/STREP.
  5. Bereid 500 mL FACS buffer: 1x PBS aangevuld met 2,5% v/v normaal geit serum en 1 mM EDTA.
  6. Bereid 500 mL tumorsphere media: DMEM/F12 aangevuld met 1% pen/STREP. Net voor gebruik, voeg de volgende groeifactoren: 1% N2 supplement, 10 ng/mL EGF, en 10 ng/mL β-FGF.

2. celisolatie en-cultuur

  1. Bereid een 10 cm plaat met 5 mL cellen isolatie media (één plaat per tumor monster) en plaats deze in een incubator bij 37 ° c totdat het tumorweefsel is geoogst.
  2. Er is gemeld dat RMS spontaan ontwikkelt in zowel mannelijke als vrouwelijke Muismodellen voor spierdystrofie van Duchenne, zoals B10 MDX-muizen op ongeveer 18 maanden oud en in B6 MDX/mTR muizen met 9 maanden22,23. Anesthetiseer de muis die de RMS-tumor ontwikkelt met behulp van isoflurane, en offer het dier via cervicale dislocatie of volgens de IACUC-richtlijnen van de instelling. Met een schaar, maak een incisie op de huid in het gebied waar de tumor gelokaliseerd is, en (met behulp van pincet) Trek de huid weg van het gebied van belang. Met een scheermesje, accijns de tumor van het dier.
  3. Weeg 500 – 1000 mg van het tumorweefsel en plaats het in de plaat bereid in stap 2,1 (Figuur 1a).
    Opmerking: grotere hoeveelheden weefsel hebben een negatieve invloed op de digestie stappen en verlagen het totale rendement. Als de geoogste tumor groter is dan 1000 mg, verdeel deze dan in delen en proef willekeurig totdat het gewenste gewicht is bereikt. Willekeurige bemonstering is noodzakelijk voor de beoordeling van weefsel heterogeniteit.
  4. Plaats de plaat met tumorweefsels in de steriele celcultuurkap en gehakt met een scheermesje. Tumor weefsel van RMS is heterogeen; Zo kunnen verschillende gebieden verschillende weerstand tegen de bezuinigingen te presenteren. Zorg ervoor dat de afmetingen van de resulterende gehakt stukken uniform zijn om een optimale spijsvertering te garanderen.
    Opmerking: RMS bestaat als mengsels van verschillende weefsel typen (voornamelijk fibrotische, vascularized, en vetweefsel) die kunnen worden geïdentificeerd in elke tumor. Naar 1) isoleren van een heterogene celpopulatie nauwkeurig recapituleren van de samenstelling van de oorspronkelijke tumor en 2) niet bias de isolatie procedure, uitvoeren willekeurige bemonstering van het geoogste weefsel. Cellen uit verschillende delen van de tumor moeten worden verteerd en parallel in vitro worden getest in de in punt 3 beschreven assay.
  5. Verplaats de media met gehakt weefsel en celisolatie in een centrifugebuis van 15 mL, was de plaat met 4 mL celisolatiemedia en plaats deze in de buis.
  6. Voeg 700 eenheden/mL Collagenase-oplossing toe om het weefsel te verteren en inbroed in een bad met schud water bij 37 °C voor 1,5 uur.
  7. Na incubatie, spin het weefsel op 300 x g gedurende 5 min bij RT. aspireren de supernatant zonder de pellet te verstoren, regeer de pellet in 10 ml tweede spijsvertering oplossing (dispase), en inbroeden in een schudden waterbad bij 37 °c gedurende 30 minuten.
  8. Zodra de tweede spijsvertering is voltooid, pipetteren op en neer en doorgeven de celsuspensie door een 70 μm nylon filter op een 50 mL centrifugebuis. Voeg vervolgens 10 mL celisolatielaag toe om het filter te wassen en de digestie oplossing te verdunnen, en draai het weefsel af op 300 x g en RT gedurende 5 minuten.
  9. Aspireren de supernatant en respenderen van de pellet in 20 mL van tumorcellen media. Breng vervolgens de celsuspensie over in een celkweek plaat van 15 cm. Plaats de cellen in de incubator bij 37 °C 's nachts. Deze plaat zal worden geïdentificeerd als P0.
  10. De dag na isolatie, wijzigt u de media. Deze stap is noodzakelijk voor het verwijderen van vuil en dode cellen die een negatieve invloed kunnen hebben op de overleving van de cel.
  11. Cel confluentie beoordelen nadat de media is gewijzigd, die variëren van 30% – 60% afhankelijk van de hoeveelheid begin materiaal en celgrootte. Laat de cellen groeien in de incubator tot ze 90% confluency bereiken. Bewaak cellen elke dag en verander de media elke 2 dagen. De tijd die nodig is voor tumorcellen te worden Confluent Health varieert afhankelijk van meerdere parameters: tumor agressiviteit, genotype van de tumor, leeftijd van de muis, heterogeniteit van het weefsel.
  12. Voor celpassaging, doe het volgende:
    1. Pre-warm de cel loslating oplossing en tumorcellen media in een waterbad bij 37 ° c.
    2. Was de cellen met 1x steriele PBS en inbroed ze bij 37 °C in 10 mL warme cel loslating oplossing voor 5 – 10 min.
    3. Wanneer alle cellen zijn losgemaakt van de plaat, voeg 10 mL warme tumorcellen media, verplaats de oplossing in een 50 mL centrifugebuis en spin cellen op 300 x g gedurende 5 min bij RT.
    4. Respendeer de cellen in 5 – 10 mL van tumorcellen media, afhankelijk van de korrelgrootte, en Tel levende cellen met Trypan Blue (1:5 verdunning) om dode cellen uit te sluiten.
    5. Plaat 105 cellen in 10 cm platen of 3 x 105 cellen in 15 cm platen. De verdubbelingstijd van de cel varieert afhankelijk van de factoren die in stap 2,10 zijn beschreven.

3. tumorsphere afleiding

  1. Gebruik tumorcellen op passage P1 of P2 om celselectie door meerdere passages te vermijden (Figuur 1b). Om cellen los te maken van de plaat, moet u eerst het gerecht wassen met 1x PBS, zonder de cellen te storen, ze vervolgens bedekken met een cel loslating oplossing (5 mL voor een 10 cm plaat of 10 mL voor een 15 cm plaat) en deze in de incubator plaatsen voor 5 – 10 minuten.
  2. Bevestig dat cellen worden losgekoppeld door te kijken naar de plaat onder een helder-veld Microscoop, voeg 1:1 volume van tumorcellen media (cel loslating oplossing: tumorcellen media), plaats de celsuspensie in een centrifugebuis en draai de cellen naar beneden op 300 x g voor 5 min bij RT.
  3. Respenderen cellen in beide FACS buffer (sectie 3,4) of tumorspheres media (sectie 3,5), volgens de methode die wordt gebruikt voor het beplating.
  4. Plating cellen doorstroming cytometer
    1. Respendeer cellen in FACS-buffer (het bedrag is afhankelijk van de korrelgrootte) en meet handmatig Live cellen met Trypan-blauwe uitsluiting. Zorg ervoor dat de uiteindelijke celconcentratie 107 cellen/mL (100 ΜL FACS buffer per 106 cellen). Voeg 1 μL FX-cyclus Violet vlek per 106 cellen toe om levend te discrimineren uit dode cellen tijdens het sorteren van de cel. Maak een onbevlekt besturingselement waarin FX-cyclus Violet vlek niet aan de cellen wordt toegevoegd.
      Opmerking: de concentratie is geoptimaliseerd voor efficiënte kleuring en snelheid tijdens het sorteren. Een lagere celconcentratie zal resulteren in een langere Sorteer tijd, terwijl een hogere concentratie van invloed is op vlekken.
    2. Het gebruik van de Onbevlekte controle, het opzetten van een FACS Gate scheiden levend (FX Cycle Violet-) uit dode (FX Cycle Violet+) cellen. Gebruik vervolgens TL-geactiveerde celsortering (met 450/50 filter band pass) voor scheiding en telling van levende/dode cellen en voor het beplating van het gewenste aantal levende cellen in elke put van de 96 goed lage bevestigings platen. Elk goed van de plaat moet worden gevuld met 200 μL tumorspheres media voordat de sortering begint.
      Opmerking: gezien het feit dat Tpc's zijn een zeldzame subpopulatie binnen de hele tumor, het protocol te optimaliseren door plating 100 cellen/goed van de muis RMS om de vorming van tumorspheres in de suspensie cultuur observeren. Het aantal cellen per put moet worden aangepast voor de specifieke tumor getest.
    3. Plaats cellen in de incubator tot het einde van het experiment. Probeer de plaat niet te storen, tenzij dat nodig is. Voor een experiment van 30 dagen, elk goed moet worden aangevuld met media en een passend aandeel van de groeifactoren elke week (media hebben de neiging om te verdampen en groeifactoren zijn niet effectief na 1 week).
    4. Na voltooiing van het experiment, handmatig scherm platen onder een helder-veld microscoop om tumorspheres te identificeren (zie stap 3,6).
      Opmerking: een tijdpunt van 30 dagen is geoptimaliseerd voor het eenvoudig detecteren van muis RMS tumorbollen van maten variërend van 50 – 300 μm diameter. Het tijdspunt moet worden aangepast afhankelijk van de agressiviteit van de tumor getest en de proliferatieve snelheid.
  5. Plating cellen handmatig
    1. Respendeer cellen in tumorsphere media (het bedrag is afhankelijk van de pellet) en meet handmatig levende cellen met trypan Blue (1:10 verdunning). Bereken de celconcentratie in de buis en plaat het juiste aantal cellen in een 96 goed lage bevestigingsplaat. Plaats cellen in de incubator tot het einde van het experiment. Probeer de plaat niet te storen, tenzij dat nodig is voor het aanvullen van media-en groeifactoren, zoals beschreven in stap 3.4.3.
    2. Na voltooiing van het experiment, scherm platen handmatig onder een helder-veld Microscoop te identificeren tumorspheres of het gebruik van de Celigo-software, zoals eerder beschreven in Kessel et al.24 zie stap 3,6 hieronder.
  6. Houd er rekening mee dat twee afzonderlijke uitlezingen kunnen worden geëvalueerd als gevolg van deze assay: aantal en grootte van gevormde tumorspheres.
    Opmerking: wanneer meer dan één cel in een put is verguld, kunnen tumorspheres of celclusters worden vormgegeven (afbeelding 1c, derde en vierde deelvensters). Celclusters zijn kleine cellulaire aggregaten die vormen in de suspensie cultuur die de overleving van cellen verbeteren en worden gekenmerkt door een onregelmatige vorm. Tumorspheres zijn groot en hebben een compactere structuur met een spheroid-vorm. Ze zijn afgeleid van een enkele cel die de mogelijkheid heeft om te overleven in een verankerings onafhankelijke manier en te vermenigvuldigen met een hoog tarief25. Plating cellen via flow cytometer of handmatig kunnen door elkaar worden gebruikt, afhankelijk van de capaciteiten die beschikbaar zijn in het laboratorium. Bovendien is het gebruik van platen met een geringe hechting van andere afmetingen dan 96 goed mogelijk en afhankelijk van het vereiste resultaat. Inderdaad, beoordeling van tumorsphere frequentie moet worden gedaan met 96 goed lage bevestigings platen, terwijl de initiële screening voor de beoordeling van cellen tumorigene potentieel snellere en betrouwbare resultaten zal opleveren op 6 goed laag-bevestigings platen.

4. tumorsphere behandeling met recombinant eiwit

  1. Herhaal de stappen 3,1 en 3,2.
  2. Als het opzetten van een behandeling met recombinant eiwitten, eerst bepalen de beste concentratie te gebruiken na punt 4,3, of als de optimale concentratie eerder is vastgesteld, ga naar sectie 4,4.
  3. Bepaal de concentratie recombinant eiwit behandeling.
    1. Respendeer de cellen in tumorsphere media (het volume is afhankelijk van de korrelgrootte) en meet handmatig Live cellen met Trypan blauwe uitsluiting. Bereken de celconcentratie in de buis en plaat 100.000 cellen in een 6 goed lage bevestigingsplaat. Plaat twee putjes per geteste concentratie en twee putjes voor onbehandelde controles (Figuur 2). De te testen eiwit concentraties zijn gebaseerd op literatuur zoeken.
    2. Behandel elke put van suspensie cellen met een verschillende eiwitconcentratie en plaats de cellen in de incubator voor 48 uur (tijd die nodig is om het effect van de behandeling op zowel de levensvatbaarheid van de cel als op de uitdrukking van de downstream-doel genen te kunnen evalueren). Evalueer vervolgens de volgende parameters:
      1. Overleving van de cel: met behulp van een helder-veld Microscoop, evenals vergelijking met onbehandelde controles, cel morfologie controleren. Gezonde cellen verschijnen helder en reflecterend onder de Microscoop, terwijl overmatige celdood de ophoping van vuil in de media zal induceren. Voor een kwantificeerbare bepaling van de celdood kunnen Trypaanse blauwe uitsluiting, kristalviolet kleuring, MTT of TUNEL assay worden gebruikt (in dit geval een put toevoegen aan de oorspronkelijke beplating).
      2. Effect van recombinante eiwitten op stroomafwaartse trajecten: Voer een literatuur zoekactie uit met PubMed voor de identificatie van de downstream genen waarvan bekend is dat ze worden beïnvloed door het geteste eiwit. Ontwerp qRT-PCR-primers voor de doel genen en voer qRT-PCR-analyse uit op het RNA dat geïsoleerd is van de behandelde cellen (Figuur 2).
  4. Behandel met recombinant eiwit.
    1. Respendeer de cellen in tumorsphere media (het volume is afhankelijk van de korrelgrootte) en meet handmatig Live cellen met Trypan blauwe uitsluiting. Bepaal het totale aantal cellen dat nodig is voor het gewenste experiment (100 cellen per stuk van een 96 goed lage bevestigingsplaat) en Verdun ze in het juiste tumorsphere-mediavolume. Als u meer dan één behandeling uitvoert, u afzonderlijke celbuizen bereiden.
    2. Behandel elke buis met de juiste concentratie van recombinant eiwit en plaat de cellen in een aparte put van 96 goed laag-bevestigingsplaat. De behandeling zal worden herhaald op elk goed afhankelijk van de halfwaardetijd van het recombinant eiwit tot de 30 dag eindpunt van het experiment.
    3. Volg aan het einde van het experiment de stappen 3.4.4 en 3,6 om de gegevens te analyseren.

5. tumorsphere behandeling met overexpressie plasmiden

  1. Herhaal de stappen 3,1 en 3,2.
  2. Als het instellen van de behandeling op een nieuw tumor type, eerst bepalen de beste concentratie van plasmide te gebruiken na punt 5,3, of als de optimale DNA-concentratie eerder is bepaald, ga naar sectie 5,4.
  3. Bepaal de optimale plasmide concentratie.
    1. Respenderen cellen in tumorcellen media (het volume is afhankelijk van de korrelgrootte) en handmatig tellen Live cellen met Trypan blauwe uitsluiting. Plaat de getelde cellen om een confluentie te bereiken van 70%-90% (het celnummer is sterk afhankelijk van de celgrootte en morfologie). GFP-plasmide zal worden gebruikt om de transfectie-efficiëntie te testen volgens het fabrikant Protocol van het transfectie-reagens voor aanhandige cellen. Parallel, test ook een onbehandelde controle (Figuur 3a). Voer een efficiency test uit in een 24-put.
      Opmerking: Aanhandige cellen worden gebruikt om de transfectie-efficiëntie te verbeteren, omdat transfectie uitgevoerd op suspensie cellen niet efficiënt is en de levensvatbaarheid van de cel negatief beïnvloedt.
    2. 48 h na transfectie cellen beoordelen voor de volgende parameters:
      1. Overleving van de cel: met behulp van een heldere-veld Microscoop, vergelijk het aantal cellen aanwezig in elk-goed en vergelijk het met de onbehandelde cellen goed.
      2. GFP-expressie: Tel het percentage cellen dat GFP-positief is over het totale aantal cellen in elke put (Figuur 3b).
  4. Overexpressie plasmide behandeling
    1. Respendeer de cellen in tumor celmedia (het volume is afhankelijk van de korrelgrootte) en meet handmatig Live cellen met Trypan blauwe uitsluiting. Plaat 200.000 cellen per put van een 6 goed plaat. Elke put zal worden gebruikt voor een onafhankelijke transfectie evenement. Elke put zal worden getransffecteerd met behulp van de set-up ontwikkeld voor de specifieke tumor type (Figuur 3a).
    2. 24 h na transfectie, was elk goed met 1x PBS en inincuberen de cellen in warme cel loslating oplossing (genoeg om de put te bedekken). Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C gedurende 5 – 10 minuten, afhankelijk van de in punt 2,15 beschreven factoren.
    3. Wanneer cellen worden losgemaakt, Tel dan de cellen die zijn afgeleid van elke afzonderlijke put onafhankelijk met behulp van Trypan blauwe uitsluiting. Plaats 100.000 cellen per putje van een 6 goed lage bevestigingsplaat, en zorg ervoor dat er geen cellen worden gemengd die zijn afgeleid van verschillende putjes. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C en laat een week ongestoord.
      NB: de duur van deze test is 7 dagen, een voldoende tijd om tumorsphere vorming mogelijk te maken terwijl tumorsphere fusie wordt voorkomen. Tumorsphere Fusion is een fenomeen dat wordt duidelijk wanneer 100.000 of meer cellen samen worden verguld in suspensie voor meer dan 1 week, die de beoordeling van tumorsphere vorming vermogen kan bias. In het geval dat het experiment een langere incubatietijd vereist, moet de celdichtheid worden aangepast of moeten polymere steigers worden gebruikt om tumorsphere Fusion26te voorkomen.
    4. Volg de stappen 3.5.2 en 3,6 aan het einde van het experiment om de gegevens te analyseren.

6. tumorsphere voorbereiding voor allotransplantaat transplantatie

  1. Plaats extracellulaire matrix (ECM) oplossing (50 μL per Allograft) en tumorcellen media (50 μL per Allograft) op ijs.
  2. Tumorspheres kan worden gebruikt voor allotransplantaat transplantaties. Trek alle tumorsferen die zijn verkregen van een specifiek celtype of behandeling in een buis van 15 mL of 50 mL (volgens het totale volume van de media) (figuur 1d). Draai de tumorferen neer op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder de supernatant over de tumorspheres en was ze met 10 ml steriele 1x PBS.
  3. Draai de tumorferen weer omlaag bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT, zuig de 1x PBS op en voeg 500 μL toe aan 1 ml cel loslating oplossing bovenop de celpellet, die het dissociatie proces start. Inbroed tumorbollen in de spijsvertering in een schudden waterbad bij 37 °C en controleer de progressie van de spijsvertering elke 10 min. Om tumorspheres dissociatie in een enkele cel oplossing te helpen, Pipetteer de cellen op en neer voor mechanische verstoring. Het verteringsproces kan tot 30 minuten duren.
    Opmerking: ondanks het feit dat de incubatietijd aanzienlijk varieert wanneer tumorferen zijn afgeleid van verschillende primaire RMS-cellen, werd een significante afname van de levensvatbaarheid van de cellen in relatie tot de verterings tijd nooit waargenomen.
  4. Wanneer een enkele cel oplossing wordt verkregen, voeg een volume van tumorcellen media (1:1, cel loslating oplossing: tumorcellen media) en spin het neer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
    Opmerking: vanaf deze tijd moeten alle stappen worden uitgevoerd op ijs. Na het spinnen vormen tumorferen geen stabiele pellet zoals de oplossingen van de afzonderlijke cellen doen. Om er zeker van te zijn dat u de tumorsferen niet onttrekt of aspireren, gebruik dan een pipet van 1 mL en zuig de vloeistof zachtjes op. Ga naar een pipet van 200 μL als er slechts 1 mL overblijft.
  5. Respenderen cellen in de koude tumorcellen media (het volume zal afhangen van de korrelgrootte), plaats de cellen op ijs en tellen levende cellen met behulp van Trypan blauwe uitsluiting. Na het bepalen van de juiste hoeveelheid cellen te gebruiken voor de Allograft, respendeert ze in een totaal volume van 50 μL van koude tumorcellen media. Koel een pipetpunt af in de media van de koude tumorcellen. Wanneer de tip koud is, gebruik deze dan om 50 μL ECM-oplossing te nemen en toe te voegen aan de buis die de cellen bevat. Verwijder de buisjes niet uit het ijs tijdens dit proces.
    Opmerking: het aantal cellen te gebruiken voor de transplantatie moet worden bepaald volgens de tumor getest en experimentele doel: een groter aantal getransplanteerde cellen zal de tijd van de ontwikkeling van de tumor verminderen (20.000 cellen van muis RMS tumorspheres is aangetoond dat ontwikkelen tot een tumor 6 weken na injectie). Om verschillende cellijnen of verschillende behandelingen te kunnen vergelijken, is het belangrijk om te beginnen met hetzelfde aantal cellen.
  6. Als cellen nu klaar zijn voor transplantatie, handhaven op ijs tot de injectie. Plaats een afgetopte 0,5 mL insulinespuit met een 29 G naald op ijs, om te voorkomen dat de celoplossing vast komt te staan bij aspiratie.
  7. Zet de flowmeter aan tot 200 ml/min zuurstof en de Isofluraan vaporizer tot 2,5%. Anesthetiseer een 2 maanden oude mannelijke NOD/SCID muis door het plaatsen van het in de inductie kamer. Wacht 2 – 3 minuten totdat de muis in slaap verschijnt en de fokkerij is vertraagd. Voordat u begint met de procedure, eerst bevestigen door middel van een voet knijpen dat de muis slaapt, dan toepassen vet zalf op de ogen. Scheer de rechterkant van het dier, aspiraat de celoplossing in de voorgekoelde spuit en Injecteer ze subcutaan in het geschoren gebied. Een zichtbare hobbel onder de huid zal vormen als de injectie correct wordt uitgevoerd.
    Opmerking: cel-allograften kunnen worden uitgevoerd in dezelfde muis stam als die van de getransplanteerde cellen. Als de RMS-cellen bijvoorbeeld oorspronkelijk zijn geïsoleerd van een C57BL/6-muis, kan de transplantaat worden uitgevoerd in C57BL/6-muizen. Als de stam anders is, moeten immunodeficiënte muizen worden gebruikt om afstoting te voorkomen. De leeftijd van de ontvangende muizen kan ook worden aangepast, afhankelijk van het experimentele doel.
  8. Monitor de muizen voor tumorvorming eenmaal per week.
    Opmerking: om te valideren van de identiteit van de tumor afgeleid van transplantaat transplantatie, het moet worden vergeleken met de oorspronkelijke tumor waaruit de cellen werden geïsoleerd. Hiervoor kan histologische analyse van morfologische kenmerken en expressie van myogene markers en uitgebreidere RNAseq worden uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Tumorspheres detectie
Celisolatie werd geoptimaliseerd om de maximale heterogeniteit van de celpopulaties aanwezig in het tumorweefsel te verkrijgen. Ten eerste, omdat geïsoleerde weefsels morfologisch ongelijksoortige gebieden presenteerde, om de kans op het isoleren van uniforme zeldzame celpopulaties te vergroten, werd bemonstering uitgevoerd vanuit meerdere delen van de tumor (Figuur 1a, eerste paneel aan de linkerkant). Ten tweede wer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Meerdere methoden zijn gebruikt voor isolatie en karakterisering van Tpc's van tumor heterogene celpopulaties: tumor clonogenic assays, FACS isolatie, en tumorsphere Formation assay. De tumor clonogene test werd voor het eerst beschreven in 1971, gebruikt voor stamcel studies, en pas later toegepast op de Kankerbiologie29,30. Deze methode is gebaseerd op de tumor stamcellen intrinsieke eigenschap om uit te breiden zonder beperkingen in zachte gels culturen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11, en de NIH pilot Grant binnen het NCI Cancer Center steun Grant P30CA030199 aan A.S.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accutase cell dissociation reagentGibcoA1110501Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
CeligoNexcelomCeligoMicrowell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type IILife Technologies17101015Weefselverteringsenzym
Dispase II, proteaseLife Technologies17105041Weefselverteringsenzym
DMEM high glucose mediaGibco11965092Component van tumorcellen media
DMEM/F12 MediaGibco11320033Component van tumosphere media
EDTAThermoFisherS312500Component van FACS buffer
EGF recombinant mouse proteinGibcoPMG8041Component van tumosphere media
FACSAria II Flow CytometryBD Biosciences650033Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine SerumOmega ScientificFB-11Component van tumorcellen media
Fluriso (Isofluornae) anestheticumMWI Vet Supply502017Anesthetisch middel voor dieren
FxCycle Violet StainLife TechnologiesF10347Onderscheid tussen levende en dode cellen
Goat SerumLife Technologies16210072Component van FACS buffer
Ham's F10 MediaLife Technologies11550043Component van FACS buffer
Horse SerumLife Technologies16050114Component van celisolatie media
Lipofectamine 3000 transfectie reagensThermoFisherL3000015Transfectie reagens
Matrigel membraanmatrixCorningCB40234Biedt ondersteuning aan getransplanteerde cellen
N-2 Supplements (100X)Gibco17502048Component van tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic OintmentMWI Vet Supply701008Oogzalf
PBSGibco10010023Component van FACS buffer en gebruikt voor het wassen van cellen
pEGFP-C1Addgene6084-1GFP plasmid
Penicillin - StreptomyocinLife Technologies15140163Component van tumosphere en tumorcellen media
Recombinant Human βFGF-basicPeprotech10018BComponent van tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand ProteinR&D Systems427-FL-005Recombinant eiwit
Trypan blueThermoFisher15250061Onderscheid tussen levende en dode cellen

Referenties

  1. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  2. Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
  3. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  4. Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
  5. Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129(2013).
  6. Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
  7. Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
  8. Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
  9. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  10. Lee, C. -H., Yu, C. -C., Wang, B. -Y., Chang, W. -W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
  11. Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
  12. Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
  13. Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
  14. Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
  15. Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
  16. Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
  17. Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
  18. Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
  19. Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
  20. Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
  21. Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
  22. Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
  23. Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
  24. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
  25. Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
  26. Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
  27. Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
  28. Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
  29. Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
  30. Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
  31. Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
  32. Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
  33. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  34. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
  35. Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Tumorsfeervormingtumorcelisolatieweefseldigestiecollagenase-oplossinglow-attachment plaattellen met trypaanblauwallograft-transplantatietumorsfeer-mediumGFP-reporterplasmidedrugscreening
Tumorsphere afleiding en behandeling van primaire tumor cellen geïsoleerd van de muis Rhabdomyosarcomas
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.