Het onthullen van Hemolymph inzameling en inenting van anisopliae Blastospores in Rhipicephalus Microplus teken naar ongewervelde pathologie studies

Samenvatting

Analyse van Tick hemolymph vertegenwoordigt een belangrijke bron van informatie over hoe sommige ziekteverwekkers ziekte veroorzaken en hoe teken immunologisch reageren op deze infectie. De huidige studie toont aan hoe inoculeren schimmel propagulen en het verzamelen van hemolymph van Rhipicephalus Microplus engorged vrouwtjes.

Samenvatting

Teken zijn verplicht bloedzuigende ectoparasieten en Rhipicephalus Microplus heeft groot belang in de veterinaire geneeskunde, omdat het veroorzaakt bloedarmoede, gewichtsverlies, afschrijving van de dieren ' leer en kan ook fungeren als een vector van verschillende pathogenen. Wegens de exorbitante kosten om deze parasieten te controleren, schade aan het milieu dat door het ongepaste gebruik van chemische acariciden wordt veroorzaakt, en de verhoogde weerstand tegen traditionele parasieten bestrijdingsmiddelen uit, alternatieve controle van tikken, door het gebruik van entomopathogene schimmels, bijvoorbeeld, is beschouwd als een interessante aanpak. Niettemin, hebben weinig studies aangetoond hoe het immuunsysteem van de Tik handelt om deze entomopathogens te bestrijden. Daarom demonstreert dit protocol twee methodes die voor entomopathogen inenting in engorged wijfjes en twee technieken worden gebruikt die voor hemolymph inzameling en hemocytes het oogsten worden gebruikt. Inenting van ziekteverwekkers bij de been toevoeging in het lichaam van de Tik wijfje laat evaluatie van wijfjes biologische parameters in tegenstelling tot de inenting tussen Scutum en capitulum, die vaak Gené's orgaan beschadigen. Dorsale hemolymph collectie leverde een hoger volumeherstel dan de collectie door de benen. Enkele beperkingen van Tick hemolymph verzameling en verwerking omvatten i) hoge tarieven van hemocytes ' verstoring, II) hemolymph besmetting met verstoorde middendarm, en III) lage hemolymph volumeherstel. Wanneer hemolymph wordt verzameld door het been snijden, de hemolymph kost tijd om zich ophopen op het been opening, ten gunste van de stollingsproces. Bovendien worden in de collectie via het been minder hemocytes verkregen in vergelijking met de dorsale collectie, ook al wordt de eerste methode als gemakkelijker uitgevoerd. Inzicht in het immuunsysteem reactie in teken bemiddeld door entomopathogene agenten helpt om hun pathogenese onthullen en ontwikkelen van nieuwe doelen voor Tick Control. De hier beschreven inentings processen vereisen zeer lage technologische middelen en kunnen niet alleen worden gebruikt om teken aan pathogene micro-organismen bloot te stellen. Evenzo kan de collectie van Tick hemolymph vertegenwoordigen de eerste stap voor veel fysiologische studies.

Inleiding

Het vee Tick, Rhipicephalus Microplus, is een Hematophagus ectoparasite met een enorme negatieve invloed op de veestapel in tropische gebieden. Deze teek is de vector van pathogene agentia zoals Babesia bovis, Babesia Bigemina, en Anaplasma marginale dat, in combinatie met de directe hemofeeding schade, kan verminderen melk en vleesproductie, bloedarmoede veroorzaken en uiteindelijk de dood. De verliezen die door dit ectoparasite worden veroorzaakt werden geschat in 3.240.000.000 dollars jaarlijks in Brazilië¹. Er worden duurzame methoden geëist en het gebruik van entomopathogene middelen wordt beschouwd als een veelbelovend alternatief om het gebruik van chemische acariciden^2,3,4te verminderen.

Entomopathogene schimmels, zoals anisopliae spp., zijn natuurlijke vijanden van geleedpotigen met inbegrip van teken, en sommige isolaten kunnen worden gebruikt als biocontroller. Deze pathogenen infecteren actief de gastheer door de cuticula en koloniseren hun lichaam^2,5,6. Naarmate de infectie zich ontwikkelt, cellulaire en humorale reacties worden bemiddeld door de teek immuunsysteem. Analyse van de teek hemolymph wordt gerapporteerd als een nuttig instrument om het immuunsysteem reacties na de uitdagende met pathogenen^7,8te evalueren.

De immune reactie van geleedpotigen is verdeeld in humorale en cellulaire reacties. De humorale reactie betreft hemagglutination processen en de productie van antimicrobiële eiwitten/peptiden, terwijl de cellulaire immuunrespons wordt uitgevoerd door de hemocytes. Deze cellen zijn aanwezig in de hemolymph van alle geleedpotigen en worden gerapporteerd aan een expressieve rol in studies met innate immune response⁹te ontwikkelen, want het is direct gerelateerd aan de fagocytose en inkapseling processen. Dienovereenkomstig, kunnen de studies over hemocytes helpen om doods weg te onderzoeken en processen zoals autophagy, apoptosis, en necrose te begrijpen. In sommige ongewervelden als tweekleppigen, de hemocytes ' collectie gezichten beperkingen zoals cel verstoring, lage hemolymph volume verkregen, en lage concentratie van teruggewonnen cellen¹⁰. Zeer vaak, afhankelijk van de toegepaste methodologie, verminderde concentratie van cellen wordt verkregen, invloed rechtstreeks op de cellen kwantificering en analyse.

Het aantal hemocytes dat in hemolymph circuleert is veranderlijk onder verschillende geleedpotigen en het kan in de zelfde soort veranderen toe te schrijven aan verschillende fysiologische stadia zoals geslacht, leeftijd, en ontwikkelingsstadium¹¹van de geleedpotige. Hemocytes kan ook worden gevonden gerespecteerd voor sommige organen en worden vrijgegeven in het verkeer net na de infectie proces¹¹. Niettemin, rapporteerden de meeste studies gebruik insecten, terwijl de tikken minder onderzocht betreffende hun fysiologie en pathologie blijven. Ondanks pathogeen inenting en hemolymph collectie in teken zijn minder gebruikte technieken, het vaststellen van standaard methoden helpt de ontwikkeling van meer accurate studies.

Het doel van deze studie was het vergelijken van de meest gebruikte methoden voor hemolymph inzameling en inenting van pathogenen in R. Microplus teken, het evalueren van de werkzaamheid in de hemolymph acquisitie en hemocytes concentratie.

Protocol

Teken gebruikt in de huidige studie werden verkregen uit een kunstmatige kolonie, onderhouden aan de federale rurale Universiteit van Rio de Janeiro, welke methoden zijn goedgekeurd door de Commissie ethiek voor het gebruik van gewervelde dieren (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).

1. Tick engorged vrouwtjes

1. Na het tikken verzamelen, wassen engorged vrouwtjes met behulp van leidingwater en dompel ze in 0,5% (v/v) natrium hypochloriet oplossing voor 3 min in een 500 mL glas beker ontvanger, voor de cuticula hygiëne (Figuur 1), dan drogen alle vrouwen met steriele papieren handdoeken (figuur 2).
2. Verdeel wijfjes in homogene gewogen groepen (met 20 wijfjes elk): één groep zonder enige behandeling, één controlegroep ingeënt met 5 µ L van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v), en één besmet-groep geënt met 5 µ L bij 1,0 x 10 ⁷ blastospores ml^-1.
   Opmerking: alleen onbehandelde teken werden gebruikt voor volume en hemocyte concentratie. Er zijn drie replica's van elke groep uitgevoerd.

2. ziekteverwekkers inenting tussen Scutum en capitulum

Opmerking: in de huidige studie, entomopathogene schimmel schorsingen werden gebruikt als een voorbeeld.

1. Suspendeer schimmel blastospores in 1 mL van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v) en stel in op een eindconcentratie van 1,0 x 10⁷ blastospores ml^-1. Voeg een hoeveelheid van 5 µ L anisopliae Blastospores (Figuur 3) suspensie toe aan het oppervlak van een plastic paraffine folie.
   Opmerking: anisopliae blastospores schorsing werd aangepast met behulp van een Neubauer ´ s kamer. Om het inentings proces te versnellen, kunnen meerdere bubbels worden toegevoegd aan het plastic paraffine folie oppervlak, elke zeepbel die overeenkomt met 5 µ L.
2. Gebruik een 1 mL ultra-fijne insuline spuit en een 0,3 mm naald om de vering te trekken en inoculeren het in de teek. Vergeet niet om alle lucht uit de spuit te nemen voordat u het.
3. Inoculeren 5 µ L van schimmel schorsing in de teek vrouwtje tussen de Scutum en capitulum. Inoculeren vrouwtjes uit de controlegroep met 5 µ L van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v) zonder schimmel.
   Opmerking: een klein volume van hemolymph kan aanwezig zijn op het foramen na de naald inbrengen. Wees voorzichtig om niet inoculeren lucht.

3. inenting van entomopathogene schimmels tussen het been dij en de teek vrouwelijk lichaam

1. Inoculeren wijfjes met schimmel suspensie (5 µ L bij 1,0 x 10⁷ blastospores ml^-1) tussen het been Tigh en het vrouwelijk lichaam, met behulp van een 1 ml ultra-fijne insuline spuit gekoppeld aan een 0,3 mm naald. Inoculeren wijfjes van de controlegroep met 5 µ L van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v).
   Nota: wanneer anisopliae blastospores inenting tussen het been Tigh en het lichaam van het teken wijfje wordt uitgevoerd, kan een klein volume van hemolymph op de Tigh na de naald toevoeging aanwezig zijn. Wees voorzichtig om niet inoculeren lucht.

4. dorsale hemolymph collectie

1. Gebruik het rubberen deel van een gevleugelde infusie set, een 0,3 mm capillaire buis, en een gefilterde tip om de hemolymph collectie uit te voeren.
2. Verstoort de vrouwelijke dorsale cuticula met behulp van een 0,3 mm naald.
3. Na verstoring, van toepassing zijn zachte druk op de voorste deel van de teek lichaam. Observeer een bijna transparante vloeistof te trekken uit de ontwrichting site. Verzamel de hemolymph door het zuigen van de vloeistof door de filter Tip gekoppeld aan het rubberdeel van een gevleugelde infusie set, en een 0,3 mm capillaire buis.
   Opmerking: druk niet op het lichaam van de teek nauwelijks tijdens de immobilisatie, omdat dit kan verstoren de middendarm en vervuilen de hemolymph. Wacht tot de zachte druk kan de vloeistof te verdrijven zonder vervuiling.

5. Hemolymph collectie van het teek been

1. Immobiliseren de teek, snijd een stuk van een voorpoot met een schaar.
   Opmerking: een of meer poten kunnen worden gesneden, evenals, hetzelfde been kan worden gesneden meer dan een keer.
2. Breng zachte druk op de achterste lichaamsdeel van de teek. Observeer een transparante vloeibare zeepbel die verschijnt op de cut site en het verzamelen met de capillaire buis, zoals beschreven in stap 4,3.
   Opmerking: druk niet op het lichaam van de teek nauwelijks tijdens de immobilisatie, omdat dit kan verstoren de middendarm en vervuilen de hemolymph. Wacht tot de zachte druk kan de vloeistof te verdrijven zonder vervuiling.

6. Hemolymph verwerking

1. Na hemolymph collectie, deponeren in 1,5 mL microtubes eerder gevuld met 30 µ L protease cocktail en 82 µ L Saline buffer. Houd de microtubes op het ijs in de hemolymph collectie.
2. Centrifugeer monsters (500 x g voor 3 min bij 4 °c). Een zachte pellet van hemocytes zal worden gevormd na hemolymph centrifugeren.
   Opmerking: voor hemolymph kwantificatie, kwantificeren van de hemolymph volume verkregen door het tellen van het totale volume in de micro tube en discontering het volume van protease cocktail en zoute buffer.
3. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende (Cell-Free hemolymph). Voorzichtig de cellen opnieuw op te schorten in, bijvoorbeeld, Leibovitz L-15 cultuur aangepast aan pH 7.0-7.2. Kwantificeren hemocytes door het plaatsen van 10 µ L van resuspended hemocytes in een Neubauer kamer.

7. Hemocyte bemonstering dia voorbereiding

1. Snijd de teek voorpoot met een schaar.
2. Breng zachte druk op de achterste lichaamsdeel van de teek. Observeer een transparante vloeibare zeepbel die verschijnt op de cut site.
3. Breng de hemolymph druppels direct op schone Microscoop dia's, na die, gebruik de juiste methoden om de cellen vlek.
   1. Aan vlek hemocytes gebruikend Giemsa, lucht-droog de hemolymph op de dia 30 min, bevestig het bij kamertemperatuur met methanol voor 3 min, en vlek in Giemsa oplossing (1:9 verhouding van de bufferoplossing van Sorensen, pH 7,2) 30 min bij kamertemperatuur. Was de dia's met stromend water om de overmaat van kleurstof te verwijderen, lucht-droog de dia en evalueer de cellen bij 400x in een optische Microscoop.

Resultaten

Dit artikel benadert inenting en hemolymph inzamelings methodes die op tikken worden toegepast. Na de inenting tussen de been dij en het lichaam van de teken wijfje, wat vloeistof (hemolymph) kan tijdens het proces worden uitgescheiden; Nochtans, is het belangrijk om op te merken dat wanneer de inenting wordt gebeëindigd, geen vloeistof of weefsels in de naald uiteinde of bij de inentings plaats aanwezig waren, ervoor zorgend dat de schimmel opschorting volledig werd ingeënt. Toen het ine...

Discussie

Inenting van ziekteverwekkers is nuttig wanneer de studie poogt de in vivo actie van micro-organismen in experimentele geleedpotige modellen te onderzoeken omdat het verzekert dat de ziekteverwekker binnen de gastheer is. De techniek kan ook worden toegepast op inoculeren moleculen zoals RNA interferentie (RNAi). De inenting tussen Scutum en capitulum wordt beschouwd als gemakkelijker uit te voeren maar vaak beschadigt Gené's orgaan, dat de eieren levensvatbaarheid^12,1...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alkaline Hypochlorite-oplossing	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Fetaal bovien serum	Gibco	16000036
Flexibele rubber	BD
Giemsa-kleurstof	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Glas capillair	CTechGlass	CT95-02
Insuline-sering (naald)	BD	SKU: 324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Leibovitz's L-15 kweekmedium	Gibco	11415-064
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microscoopglazen	Kasvi	K5-7105
Microtubes	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Neubauer-kamer	Kasvi	K5-0111
Penicilline	Gibco	15140163
Protease-remmercocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662