Methodenartikel

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

DOI:

10.3791/59901

⸱

21 augustus 2019

 ,  , 
1Division of Medical Genetics, University of Washington School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna's, verrijkend voor Microrna's en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De helft van alle menselijke transcripties wordt verondersteld te worden gereguleerd door microRNAs. Daarom kan het kwantificeren van de microRNA-uitdrukking onderliggende mechanismen in ziektetoestanden onthullen en therapeutische doelen en biomarkers bieden. Hier wordt gedetailleerd beschreven hoe u Microrna's nauwkeurig kwantificeren. In het kort beschrijft deze methode het isoleren van Microrna's, het ligeren ervan aan adapters die geschikt zijn voor sequentiëren met hoge doorvoer, het versterken van de eindproducten en het voorbereiden van een voorbeeld bibliotheek. Vervolgens leggen we uit hoe de verkregen sequentiëren leesbewerkingen kunnen uitlijnen op microRNA haarspelden, en kwantificeren, normaliseren en berekenen van hun differentiële uitdrukking. Veelzijdig en robuust, deze gecombineerde experimentele workflow en bio informatica analyse stelt gebruikers in staat om te beginnen met weefsel extractie en finish met microRNA kwantificering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor het eerst ontdekt in 19931, is nu geschat dat bijna 2000 Microrna's aanwezig zijn in het menselijk genoom2. Microrna's zijn kleine niet-Codeer Rna's die meestal 21-24 nucleotiden lang zijn. Het zijn posttranscriptionele regulatoren van genexpressie, vaak bindend voor complementaire locaties in de 3-onvertaalde regio (3-UTR) van doel genen om eiwit expressie te onderdrukken en mRNA te degraderen. Het kwantificeren van Microrna's kan waardevol inzicht geven in genexpressie en er zijn verschillende protocollen voor dit doel ontwikkeld3.

We hebben een gedefinieerd, reproduceerbaar en lang staand protocol ontwikkeld voor kleine RNA-sequencing en voor het analyseren van genormaliseerde leesbewerkingen met open source bioinformatica tools. Belangrijk is dat ons protocol de gelijktijdige identificatie van zowel endogene Microrna's als exogenously geleverde constructies die microRNA-achtige soorten produceren mogelijk maakt, terwijl leest die naar andere kleine RNA-soorten, waaronder ribosomale Rna's ( rRNAs), overdracht van RNA-afgeleide kleine Rna's (Tsrna's), herhaald afgeleide kleine Rna's, en mRNA afbraakproducten. Gelukkig zijn microrna's 5-fosforyleerd en 2-3 gehydroxyleerde4, een functie die kan worden gebruikt om ze te scheiden van deze andere kleine rna's en mRNA afbraakproducten. Er bestaan verschillende commerciële opties voor het klonen en sequentiëren van microRNA die vaak sneller en gemakkelijker te multiplex zijn; echter, de gepatenteerde aard van Kit reagentia en hun frequente modificaties maakt het vergelijken van monster runs uitdagend. Onze strategie optimaliseert het verzamelen van alleen de juiste grootte van Microrna's door middel van acrylamide en agarose gel zuiveringsstappen. In dit protocol beschrijven we ook een procedure voor het uitlijnen van sequentie lezen op microRNAs met behulp van open source tools. Deze set instructies zal vooral nuttig zijn voor beginnende informatica gebruikers, ongeacht of onze bibliotheek bereidingsmethode of een commerciële methode wordt gebruikt.

Dit protocol is gebruikt in verschillende gepubliceerde studies. Het werd bijvoorbeeld gebruikt om het mechanisme te identificeren waarmee het dicer-enzym kleine haarspeld Rna's op een afstand van twee nucleotiden uit de interne lus van de stuurlus structuur-de zogenoemde "lustellings regel"5. We volgden ook deze methoden om de relatieve overvloed van geleverde kleine haarspeld Rna's (shRNA) te identificeren, uitgedrukt uit recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren (rAAVs), om de drempel van shRNA-expressie te identificeren die voorafgaand aan de lever kan worden getolereerd toxiciteit die gepaard gaat met overmatige shRNA-expressie6. Met dit protocol identificeerden we ook Microrna's in de lever die reageren op de afwezigheid van microRNA-122-een sterk uitgedrukt hepatisch microRNA-terwijl het afbraak patroon van deze microRNA7ook kenmerkend is. Omdat we ons protocol consequent in tal van experimenten hebben gebruikt, hebben we de voorbereidingen in de lengterichting in de lengterichting kunnen observeren en zien dat er geen waarneembare batch-effecten zijn.

Bij het delen van dit protocol is het ons doel om gebruikers in staat te stellen hoge kwaliteit, reproduceerbare kwantificering van Microrna's te genereren in vrijwel elke weefsel-of cellijn, met behulp van betaalbaar materiaal en reagentia, en gratis bioinformatica tools.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierproeven werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Washington.

Kleine RNA bibliotheek voorbereiding

1. RNA-isolatie

  1. Isoleer RNA van een biologische bron met behulp van een standaard RNA-isolatie reagens of een kit die verrijkt wordt voor Microrna's. Voor weefsels, het is het beste om te beginnen met monsters snap-bevroren in vloeibare stikstof en gemalen tot een poeder met behulp van een voorgekoelde mortel en stamper.
  2. Meet de RNA-integriteit van elk monster op een instrument dat RNA kan kwantificeren en een RNA-integriteits nummer (RIN) verschaft. RINs moet worden > 7.

2.3 ' ligatie van de adapter

  1. Maak een ligatie reactie in PCR-strip buisjes door te combineren: 11 μL RNA (1-3 μg, met dezelfde hoeveelheid voor elk monster), 1,5 μL van 10x T4 RNA ligase-reactiebuffer, ATP-vrij, 1 μL polyethyleen glycol (PEG) en 0,5 μL van 3 '-linker (100 μM universeel miRNA-kloon Lin ker).
    Opmerking: de afwezigheid van ATP helpt bij het verrijken van miRNAs en minimaliseert het klonen van mRNA afbraakproducten. PEG fungeert als een moleculaire verdringing agent, verbetering van de succesvolle ligatie. De universele miRNA klonen linker heeft een 3 ' blokkerende groep (amine) om te voorkomen dat zelf-ligatie, circularisatie, en ligatie aan RNA op het einde van de 5 '.
  2. Verwarm de monsters bij 95 °C op een Thermocycler voor 30-40 s. koel op ijs gedurende 1 minuut. Voeg 1 μL T4 RNA ligase 2 toe en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. bereid de gel (stap 2,3) terwijl de monsters inbroed.
    Opmerking: incubatie bij kamertemperatuur helpt voorkomen dat linker-linker ligatie. We hebben ook met succes gebruikt T4 RNA ligase 1.
  3. Bereid 30 mL van een 15% polyacrylamidegel met 8 M ureum (voor een gel van 20 cm): 14,4 g ureum, 3 mL 10x tris-gebufferd ethyleendiaminetetraazijnzuur (TBE), 11,2 mL 40% 19:1 acrylamide en H2O tot 30 ml. Oplossing wordt het beste opgelost bij 42 °C. Voeg onmiddellijk vóór het gieten 150 μL van 10% ammonium persulfaat (APS) en 30 μL tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe voor polymerisatie.
  4. Giet tussen 0,8 mm gescheiden glazen platen in een kunststof gegoten en insert kam. Zodra de gel is gestijgd (ongeveer 20 min), Voeg 0,5 x TBE toe aan de tank en spoel de putten van residueel ureum door krachtig te pipetteren.
  5. Pre-run de gel op een constante 375 V gedurende 25 minuten zonder monsters, zodat ureum de gel kan binnengaan, en vervolgens de putten opnieuw wassen.
    Opmerking: de hoeveelheid spanning moet mogelijk worden verlaagd, afhankelijk van het type voeding en het elektroforese systeem dat wordt gebruikt.
  6. Nadat de monsters zijn afgelend, voegt u 15 μL acrylamide-laad kleurstof toe aan de monsters (voor een verhouding van 1:1) en denatureert u 5 min bij 95 °C op een Thermocycler.
  7. Bereid 25 ng/μL van 37 en 44 BP grootte markers, verdund met één deel acrylamide laad kleurstof. Reeksen worden weergegeven in tabel 1.
  8. Laad de monsters op de polyacrylamidegel en laat ten minste één rijstrook tussen elk monster. Laad 20 μL van ten minste twee sets markers, in een asymmetrisch patroon om de geloriëntatie te volgen.
  9. Voer de gel op een constante 375 V voor de eerste 15 min en vervolgens te verhogen tot een constante 425 V voor de resterende run. Lopen tot broomfenolblauw is ongeveer 1-4 cm van de bodem, die ongeveer 2 uur duurt.
    Opmerking: indien nodig kan de gel gedurende langere tijd met een lagere constante spanning worden uitgevoerd totdat de broomfenolblauw ongeveer 1-4 cm van de bodem is.
  10. Verwijder de gel van de glasplaten met behulp van een plaat separator en plaats de gel op een plastic pagina beschermer. Verdun 5 μL ethidiumbromide bromide in 500 μL gedistilleerd water en Pipetteer de markerings stroken net boven de bovenste licht blauwe marker (Zie Figuur 1a).
    Let op: gebruik handschoenen voor ethidiumbromide bromide en gooi afval weg in overeenstemming met de lokale regelgeving. Laat zitten voor 5 min.
  11. Snijd onder ultraviolet (UV) licht de gels van de bovenste naar de onderste marker in elke rijstrook met schoon scheermesje (Zie Figuur 1a). Breng over naar een 4 x 4 cm vierkant van een laboratorium afdichtings film, snijd vervolgens de gel met ongeveer 4 sneden horizontaal en 3 verticaal om 12 kleine vierkantjes te produceren (Zie Figuur 1b).
  12. Pipetteer 400 μL van 0,3 M NaCl op de afdichtings film vierkante en trechter stukjes in 1,5 mL Gesiliconiseerde buizen (Zie figuur 1c). De monsters op een nutator bij 4 °C 's nachts agiteren.
    Opmerking: andere buizen met lage retentie 1,5 mL kunnen worden vervangen door Gesiliconiseerde buizen.
  13. Na ten minste 12 h van agitatie bij 4 ° c, haalt u de monsters op en zet ze op ijs, samen met een conische buis van 100% ethanol.
  14. Breng 400 μL supernatant over naar een nieuwe buis en voeg vervolgens 1 mL 100% ethanol en 1 μL van 15 mg/mL glycogeen coprecipitant toe. Zorg ervoor om zoveel mogelijk supernatant te verzamelen, te draaien bij 4 °C en meer te pipetteren indien nodig. Plaats bij-80 °C gedurende 1 uur of-20 °C gedurende 2 uur of langer. Glycogeen coprecipitant verbetert de zichtbaarheid en het herstel van pellets.
  15. Spin bij 4 °C bij 17.000 x g gedurende 20-30 min. Verwijder alle sporen van ethanol en laat de pellet lucht drogen gedurende 5 min.

3.5 ' linker ligatie

  1. De pellet opnieuw opschorten door pipetteren in 6,5 μL Nuclease-vrij water. De pellet in water te laten zitten voor een paar minuten zal eerst helpen met re-suspensie.
  2. Na het draaien van de pellet en het resuspenseren in water, Voeg 0,5 μL van 100 μM 5 '-linker (met streepjescodes; Zie tabel 1), 1 ΜL T4 RNA ligase buffer, 1 μl van 10 mm ATP en 1 μl peg. Verwarm bij 90 °C gedurende 30 sec., plaats dan op ijs. Voeg 1 μL T4 RNA ligase 1 toe en laat 2 uur inbroeren bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 400 μL 0,3 M NaCl toe, gevolgd door 400 μL zuur fenol/chloroform. Vortex 30 s-1 min (oplossing zal er bewolkt uitzien), en vervolgens draaien bij 4 °C gedurende 10-15 min bij maximale snelheid in een micro centrifuge (~ 17.000 x g). Trek de bovenste laag en plaats in nieuwe 1,5 mL buis.
    Opmerking: Vermijd pipetteren van de onderste laag.
  4. Voeg 350 μL chloroform toe, Vortex kort, en draai vervolgens bij 4 °C gedurende 10 min bij maximale snelheid (~ 17.000 x g). Trek de bovenkant later en plaats in nieuwe 1,5 mL buis. Voeg 1,5 μL glycogeen coprecipitant en 1 mL 100% ethanol toe.
    Opmerking: Vermijd nogmaals pipetteren van de onderste laag.
  5. Vortex kort, plaats dan bij-80 °C gedurende ten minste 1 uur, of-20 °C 's nachts.

4. omgekeerde transcriptie (RT)

  1. Schakel het hitte blok van 42 °C in. Draai de monsters bij 4 °C en ~ 17.000 x g gedurende 20-30 min. Verwijder alle supernatant en laat de pellet lucht drogen gedurende 5 min.
  2. Herstel het gepelleteerde monster opnieuw in 8,25 μL Nuclease vrij water en voeg toe: 0,5 μL van 100 μM RT primer (tabel 1) en 5 ΜL 2x RT-reactie mix van een cDNA-synthese pakket. Incuberen bij 42 °C gedurende 3 min.
  3. Voeg 1,5 μL 10x RT-enzym toe aan elk monster en inincuberen bij 42 °C gedurende 30 minuten in een Thermocycler. Plaats bij-20 °C of ga verder met hydrolyse en neutralisatie.
    Opmerking: verschillende RT-kits kunnen worden gebruikt voor stappen 4,2 en 4,3.
  4. Alkalische hydrolyse en neutralisatie uitvoeren: Maak 1 mL van 150 mM kaliumhydroxide (KOH)-oplossing (150 μL van 1 M KOH, 20 μL van 1 M Tris-basis pH 7,5 en 830 μL H2O) en 1 ml zoutzuur van 150 mm (HCL) (150 μl van 1 m HCl en 850 μl van H2O).
  5. Voordat u aan de voorbeelden toevoegt, bepaalt u de hoeveelheid HCl die nodig is om de KOH-oplossing te neutraliseren. Over het algemeen neutraliseert ongeveer 20-24 μL HCl de 25 μL KOH. Controleer de combinatie op een pH-strip om ervoor te zorgen dat deze zich in het juiste bereik bevindt (pH 7,0 tot 9,5).
  6. Hydrolyseer de monsters door 25 μL van 150 mM KOH-oplossing toe te voegen en gedurende 10 minuten bij 95 °C te inbroeren.
  7. Neutraliseer de monsters door de in stap 4,4 bepaalde hoeveelheid van 150 mM HCl toe te voegen om een eindmonster pH tussen 7,0 en 9,5 te verkrijgen.

5. PCR-versterking

  1. Bereid na neutralisatie een PCR-reactie met: 29,5 μL water, 5 μL 10x Taq-buffer, 1 μL dNTP, 2 μL 25 μM voorwaartse primer (tabel 1), 2 μl van 25 μm omgekeerde primer (tabel 1), 0,5 μL Taq, en 10 μL van het omgekeerde getranscribeerd cdna uit stap 4,6 .
  2. Voer de volgende PCR-reactie uit: 94 °C gedurende 2 minuten en vervolgens 20 cycli van 94 °C voor 45 s, 50 °C voor 75 s en 72 °C voor 60 s.
  3. Voer een tweede PCR-reactie uit van ongeveer 2-4 meer cycli met 5 μL product uit stap 5,2. Mengsel: 34,8 μL water, 5 μL 10x Taq-buffer, 1 μL dNTP, 1 μL van 25 μM voorwaartse primer (tabel 1), 1 μl van 25 μm omgekeerde primer (tabel 1) en 0,2 μL Taq polymerase. Volg dezelfde Thermocycler parameters zoals beschreven in stap 5,2.
    Opmerking: het doel van het doen van twee PCR-reacties – met de eerste voor 20 cycli en de tweede voor slechts 2-4 meer – is om ervoor te zorgen dat de hoeveelheid cDNA versterkt in een dynamisch bereik is (d.w.z. geen verzadigde hoeveelheid).

6. agarose gel zuivering

  1. Bereid een 4% agarose gel met laagsmeltende agarose. Laad 40 μL of meer van het PCR-product op de gel en laad kleurstof. Laad 100 BP en 25 BP-formaat markeringen.
    Opmerking: de 25 BP ladder helpt om versterkt product van linker-linker ligatie producten te onderscheiden. Low-smeltende agarose gels moeten met meer zorg worden gegoten dan traditionele agarose gels, dus volg de instructies van de fabrikant op de voet.
  2. Voor gel-extractie selecteert u het cyclusnummer dat zichtbaar is op de gel, maar niet verzadigd (gewoonlijk 22 – 24 cycli). Kies soortgelijke intensiteit bands bij het uitvoeren van meerdere samples.
  3. Snijd de band die boven de 125 BP band (de donkerdere band op 25 BP ladder; Zie figuur 1d). Volg met behulp van een gel extraction Kit de instructies van de fabrikant voor het toevoegen van een buffer op basis van een 4% gel en schud vervolgens om agarose in buffer bij kamertemperatuur op te lossen.
    Opmerking: oplossen op 55 ° c verhoogt de mogelijkheid voor linker-linker ligatie.
  4. Volg de instructies voor de gel-extractie van de fabrikant en elueer in 30 μL elzen-of waterbuffer. Als het product er zwak uitzag op de gel, Reduceer dan de elutie tot 20 μL.
  5. Meet de cDNA-concentratie met behulp van een gevoelige techniek en bereid de Sample Library voor op sequencing. De voorbereiding zal afhangen van het type sequencing dat wordt gebruikt.
    Opmerking: minimum vereisten voor een sequentiebibliotheek zijn meestal een 10 μL-volume van 10 μM product. Als de concentraties te laag zijn, nemen pool-en ethanol monsters neer om de bibliotheek naar de gewenste concentratie te brengen.
  6. Volg de voorbeelden met behulp van de beschikbare apparatuur. Een veelvoorkomend voorbeeld zou zijn om samples uit te voeren met behulp van een Kit voor 50 BP single leest, om ongeveer 15-25 miljoen leesbewerkingen in een FASTQ-uitvoerformaat te verkrijgen.

Kleine RNA sequentie uitlijning en bio-informatica

7. uploaden van gegevens

  1. Download FASTQ-bestanden gegenereerd op basis van elke sequentiëren uitvoeren. Download een lijst van microRNA haarspeld sequenties uit miRbase.org8,9,10.
  2. Genereer een Galaxy-account op www.usegalaxy.org en upload een FASTQ-bestand van Sequence-leesbewerkingen naar dit account.
  3. Upload een tekstbestand met barcode sequenties naar het Galaxy-account, zoals barcodes. txt, dat beschikbaar is als tekstbestand (aanvullende tabel 1).
  4. Upload een FASTA bestand van microRNA haarspelden naar de Galaxy account uit een database zoals miRBase.org. Voorbeelden van muizen (mousehairpins. FA) of humane (humanhairpins. FA) microRNA-precursoren zijn beschikbaar in de aanvullende tabel 2 en in de aanvullende tabel 3.

8. verwijderen van de adapter, barcode sortering en trimmen

  1. Navigeer in het linkertabblad naar genomic-bestands manipulatie > FASTA/FASTQ ≫ clip adapter sequenties.
  2. Voer in het invoerbestand in de FASTA-of FASTQ-indelingfastq-bestand in de vervolgkeuzelijst in. Wijzig de minimale sequentie lengte in 18. Wijzig de bron om een aangepaste reeks in te voeren. Voer Ctgtaggcin. Alle andere standaardparameters behouden. Klik op uitvoeren.
    Opmerking: sequentie leesbewerkingen die korter zijn dan 18 nucleotiden zijn moeilijk in te stellen op een unieke wijze aan Microrna's en bevatten veel afbraakproducten.
  3. Navigeer in het linkertabblad naar genomic-bestands manipulatie > FASTA/FASTQ ≫ barcode splitter.
    Opmerking: Galaxy functies en headers worden periodiek bijgewerkt, dus de zoekfunctie kan nodig zijn om een gelijkwaardig hulpmiddel of de locatie ervan te vinden. Commerciële kits met behulp van geïndexeerde primers zijn vaak al gesorteerd op streepjescode. Daarom zijn deze stap en de streepjescode trim stap niet nodig als u begint met een commerciële Kit.
  4. Voor het gebruik van barcodeswijst u barcodes. txtaan. Voor bibliotheek om te splitsen, gebruikt u clip op gegevens bestand dat in de vorige stap is geproduceerd. Voer 1in het aantal toegestane mismatchesin. Klik op uitvoeren.
  5. Trim de eerste 4 nucleotiden: Navigeer naar tekst manipulaties > voorloop-of volg tekens bijsnijden. Voor invoergegevensset, klikt u op het mappictogram, dit is een verzameling van de gegevensset. Selecteer het batchbestand met de voorbeelden, waaronder de barcode splitter op gegevens. Voer in Trim vanaf het begin tot aan deze positie 5in. In is invoergegevensset in FASTQ-formaat? Voer Jain. Klik op uitvoeren. De uitvoering kan enkele minuten duren.

9. uitlijning van leesbewerkingen op microRNAs

  1. Navigeer in Galaxy naar Genomics Analysis > RNA-Seq ≫ zeilvis transcriptie kwantificering11.
  2. Voor de vraag Selecteer een referentie transcriptome uit uw geschiedenis of gebruik een ingebouwde index? Selecteer gebruik een van de geschiedenis. Voer het geüploade bestand mousehairpins. FA uit de vervolgkeuzelijst in. Klik in het bestand FASTA/Q op het mappictogram om een DataSet-verzameling te gebruiken en selecteer het bestand met Trim bij verzameling. Klik op uitvoeren. De uitvoering kan enkele minuten duren.
  3. Klik in het tabblad geschiedenis aan de rechterkant op Sailfish on Collection... dit is een lijst met 19 items. Klik op elk afzonderlijk bestand en klik op het schijfpictogram om op te slaan op de lokale computer. Afzonderlijk gedownloade bestanden moeten eerst worden gedecomprimeerd. Ze moeten mogelijk ook opnieuw worden opgeslagen met de extensie. txt voor het importeren in een spreadsheet.
  4. Open elk werkbladbestand in en geef de kolom Numlees opnieuw een naam aan de behandelings voorwaarde. Voeg de kolommen samen om een matrix van microRNAs te genereren in de eerste kolom en lees aantallen per voorwaarde in volgende kolommen.
  5. Als u voor elke behandelings voorwaarde differentieel uitgedrukt Microrna's wilt berekenen, gebruikt u het bestand met onbewerkte microRNA-Lees tellingen als invoer voor Programma's zoals DESeq212. DESeq2 is aanwezig in Galaxy in de Genomics analyse > RNA-seq > tab DESeq2 .
  6. Onbewerkte leesbewerkingen converteren naar genormaliseerde microRNA lezen tellingen. Tellingen worden genormaliseerd naar de diepte van de bibliotheek volgorde van de bibliotheek via de volgende berekening: [(onbewerkte Lees-/totaal-microRNA-leesbewerkingen) * (1.000.000 – aantal Microrna's geteld) + 1].
    Opmerking: deze berekening biedt een genormaliseerde leesbewerkingen per miljoen (RPM) toegewezen Microrna's die kunnen worden vergeleken tussen gegevenssets en biologische omstandigheden. De uitvoer is een door tabs gescheiden bestand. Sailfish biedt een TPM -uitvoerkolom, hoewel deze waarde wordt genormaliseerd door microRNA haarspeld lengte, die in deze context niet nodig is.
  7. Indien relevant, herhaalt u de uitlijning met aangepaste invoer reeksen (bijvoorbeeld een vector) om leesbewerkingen te identificeren die worden gekoppeld aan geleverde constructies, zoals shRNAs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematische voorstelling van stappen bij de voorbereiding van bibliotheken
Een algemene schematische voorstelling van kleine RNA-extractie,-sequencing en-uitlijning wordt beschreven in Figuur 2.
Lever monsters van een mannelijke en een vrouwelijke muis werden verzameld en snap bevroren in vloeibare stikstof. Totaal RNA werd geëxtraheerd en geëvalueerd op kwaliteit en concentratie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks de identificatie van microRNAs meer dan 20 jaar geleden13, blijft het proces van microRNA-sequencing bewerkelijk en vereist gespecialiseerde apparatuur, waardoor laboratoria worden gehinderd om routinematig in-House protocollen14te hanteren. Andere technieken kunnen gelijktijdig Microrna's evalueren, zoals microRNA micro arrays en Multiplexed expressie panelen; deze benaderingen zijn echter beperkt omdat ze alleen de microRNAs in hun testset kwantificeren. Hierdoor ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de leden van de laboratoria van Andrew Fire en Mark Kay bedanken voor hun begeleiding en suggesties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 bp DNA ladderNEBN3231
19:1 bis-acrylamideMillipore SigmaA9926
25 bp DNA step ladderPromegaG4511
Acid phenol/chloroformThermoFisherAM9720
Acrylamide RNA loading dyeThermoFisherR0641
Ammonium persulfate (APS)Biorad161-0700
Bioanalyzer instrumentAgilentG2991AAVoor het beoordelen van RNA-kwaliteit en -concentratie
ChloroformFisher ScientificC298-500
Ethanol (100%)SigmaE7023
Gel Loading Buffer IIThermoFisherAM8547
GlycoBlueThermoFisherAM9516Blauwe kleur helpt bij het visualiseren van de pellet
HClSigma320331
KOHSigmaP5958
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cmGenesee45-109
miRVana microRNA isolation kitThermoFisherAM1560
miSeq systemIlluminaSY-410-1003Voor het genereren van kleine RNA-sequencing data
NaClFisher ScientificS271-500
Nusieve low-melting agaroseLonza50081
Parafilm (laboratorium afdichtingsfolie)Millipore SigmaP7793
Poly-ethylene glycol 8000NEBinbegrepen bij M0204
ProtoScript II First strand cDNA Synthesis KitNEBE6560S
QIAquick Gel Extraction kitQiagen28704
Qubit FluorometerThermoFisherQ33226Voor het kwantificeren van DNA-concentratie
Qubit RNA HS Assay kitThermoFisherQ32855
Razor BladesFisher Scientific12640
Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubesFisher Scientific02-681-331
T4 RNA ligase 1NEBM0204
T4 RNA Ligase 2, truncated K227QNEBM0351S
TapeStationAgilentG2939BAVoor het beoordelen van RNA-kwaliteit en -concentratie
Taq DNA PolymeraseNEBM0273X
TEMEDBiorad161-0800
Tris Base pH 7.5Sigma10708976001
Tris-buffered EDTASigmaT9285
TrizolThermoFisher15596026
UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)Invitrogen15585-011
Universal miRNA cloning linkerNEBS1315S
UreaSigmaU5378

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  2. Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
  3. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
  4. Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
  5. Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
  6. Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
  7. Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321(2018).
  8. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
  9. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
  10. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
  11. Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
  12. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  13. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  14. Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
  15. Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
  16. Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
  17. Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118(2018).
  18. Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331(2018).
  19. Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
  20. Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352(2015).
  21. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141(2011).
  22. Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969(2011).
  23. Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
  24. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
  25. Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72(2011).
  26. Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
  27. Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MicroRNA isolatieRNA sequencinggelzuiveringadaptorligatiereverse transcriptiePCR amplificatieagarosegelzuiveringbioinformatica analysesequentie alignmentdifferenti le expressie

Gerelateerde artikelen