Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Summary

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4⁺ primaire T-cellen weergegeven.

Abstract

De signalering en functie van een cel worden bepaald door de dynamische structuren en interacties van de oppervlaktereceptoren. Om de structuur-functie relatie van deze receptoren in situ echt te begrijpen, moeten we ze visualiseren en volgen op het levende celoppervlak met voldoende spatiotemporale resolutie. Hier laten we zien hoe we recent ontwikkelde Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) kunnen gebruiken om T-celreceptoren (CDR's) vierdimensionaal (4D, ruimte en tijd) te beelden in het levende celmembraan. T-cellen zijn een van de belangrijkste effectorcellen van het adaptieve immuunsysteem, en hier gebruikten we T-cellen als voorbeeld om aan te tonen dat de signalering en functie van deze cellen worden aangedreven door de dynamiek en interacties van de CVR's. LLSM zorgt voor 4D-beeldvorming met een ongekende spatiotemporale resolutie. Deze microscopietechniek kan daarom over het algemeen worden toegepast op een breed scala aan oppervlakte- of intracellulaire moleculen van verschillende cellen in de biologie.

Introduction

De precieze dynamiek van moleculen die in realtime op het driedimensionale celoppervlak worden verhandeld en verspreiden, is een raadsel om op te lossen. Microscopie is altijd een evenwicht geweest tussen snelheid, gevoeligheid en resolutie; als een of twee worden gemaximaliseerd, wordt de derde geminimaliseerd. Daarom, als gevolg van de kleine omvang en immense snelheid waarmee oppervlaktereceptoren bewegen, is het volgen van hun dynamiek een grote technologische uitdaging gebleven op het gebied van celbiologie. Bijvoorbeeld, veel studies zijn uitgevoerd met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie^1,

Protocol

5C. C7 TCR-transgene RAG2 knock-out muizen in B10. Een achtergrond werden gebruikt in deze studie volgens een protocol goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Chicago.

1. T-cellen oogsten en activeren

OPMERKING: Dit deel van het protocol is gebaseerd op eerdere protocollen. Zie citaten voor meer details^20,21.

1. Euthanaseren een 10-12 week oude 5C. C7 transgene muis van beide geslachten (~20-25 g) volgens het goedgekeurde IACUC-protocol (d.w.z. CO_2-kamer gevolgd door cervicale dislocatie).<....

Results

Hier beschrijven we de isolatie, voorbereiding en beeldvorming van primaire muis 5C. C7 T cellen met behulp van een rooster lichtplaat microscoop. Tijdens sectie 3 is het noodzakelijk om de microscoop correct uit te lijnen en dagelijks PSF te verzamelen om de gegevens na het verzamelen te deconvolveen. In figuur 2tonen we de juiste uitlijningsbeelden die te zien zijn bij het uitlijnen van de microscoop. Figuur 2A en figuur 2.......

Discussion

Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor het gebruik van CD4⁺ T-cellen geïsoleerd van 5C. C7 transgene muizen op het gebruikte LLSM-instrument, en daarom moeten andere celsystemen en LLSM's mogelijk anders worden geoptimaliseerd. Dit protocol toont echter de kracht van 4D-beeldvorming, omdat het kan worden gebruikt om de dynamiek van een oppervlaktereceptor op een hele cel te kwantificeren met de minste vervorming in fysiologische omstandigheden. Daarom zijn er veel mogelijke toekomstige toepassinge.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309659	For T cell harvest
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	For T cell culture
5 mm round coverslips	World Precision Instruments	502040	For Imaging
70um Sterile Cell Strainer	Corning	7201431	For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody	BioLegend	109215	For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS)	X&Y Cell Culture	FBS-500	For T cell culture
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	F6377	For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres	Thermo Fisher Scientific	F8810	For microscope alignment
Imaris	Bitplane	N/A	Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope	3i	N/A	Microscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	21083027	For Imaging
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-081	For T cell culture
LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	Custom Synthesis	For T cell harvest
Penacillin/Streptamycin	Life Technologies	15140122_3683884612	For T cell culture
Poly-L-Lysine	Phenix Research Products	P8920-100ML	For Imaging
RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4300-54	For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	For T cell culture
RPMI 1640 Medium	Corning	MT10040CV	For T cell culture
Slidebook	3i	N/A	LLSM imaging software
Surgical Dissection Tools	Nova-Tech International	DSET10	For T cell harvest
T-25 Flasks	Eppendorf	2231710126	For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits	Thermo Fisher Scientific	44685	For preparing Fab