Methodenartikel

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

DOI:

10.3791/59916

⸱

29 augustus 2019

 , 
1Graduate School of Horticulture, Chiba University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bloeiende planten hebben een uniek seksueel reproductie systeem dat ' dubbele bevruchting ' wordt genoemd, waarbij elk van de spermacellen nauwkeurig met een eicel of een centrale cel smelt. Zo vinden er bijna gelijktijdig twee onafhankelijke bevruchting gebeurtenissen plaats. De bevruchte eicel en de centrale cel ontwikkelen respectievelijk zygote en endosperm. Daarom is nauwkeurige controle van dubbele bevruchting essentieel voor de daaruit voortvloeiende ontwikkeling van zaaizaad. Dubbele bemesting treedt op in de vrouwelijke gametofyt (embryo SAC), die diep verborgen is en bedekt is met dikke ovalen en Eier weefsels. Deze stamper weefsel constructie maakt observatie en analyse van dubbele bevruchting heel moeilijk en heeft de huidige situatie gecreëerd waarin veel vragen over het mechanisme van dubbele bevruchting onbeantwoord blijven. Voor de functionele evaluatie van een potentiële kandidaat voor bevruchting regulator is fenotypische analyse van bemesting belangrijk. Om te oordelen over de voltooiing van de bevruchting in Arabidopsis thaliana, de vormen van fluorescentie signalen labelen van sperma kernen worden gebruikt als indicatoren. Een zaadcel die niet bevruchten wordt, wordt aangegeven door een gecondenseerd fluorescentie signaal buiten de vrouwelijke gameten, terwijl een zaadcel die met succes bemesten wordt aangegeven door een gedegecondenseerd signaal als gevolg van karyogamie met de Nucleus van de vrouwelijke gameten. De hier beschreven methode biedt een hulpmiddel om de succesvolle of mislukte bevruchting onder in vivo condities te bepalen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bloeiende planten produceren zaden door dubbele bevruchting, een proces dat rechtstreeks wordt beheerst door interacties tussen eiwitten gelokaliseerd op gameten plasma membraan1,2. Bloeiende plant mannelijke gameten, een paar spermacellen, Ontwikkelen in pollen. Een pollen buis die groeit na bestuiving levert een paar spermacellen aan vrouwelijke gameten, een eicel en een centrale cel, die in een embryo-zak ontwikkelen. Nadat de mannelijke en vrouwelijke gameten elkaar ontmoeten, bevorderen eiwitten op het gameten-oppervlak herkenning, gehechtheid en fusie om dubbele bevruchting te voltooien. In eerdere studies werden de mannelijke gameten membraan eiwitten generatieve celspecifieke 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 en gameten uitgedrukt 2 (GEX2)5 geïdentificeerd als bevruchting regulatoren die betrokken zijn bij gameten fusie en bijlage, respectievelijk. Onlangs identificeerden we een mannelijk gameten-specifiek membraan proteïne, DUF679 DOMAIN membraan PROTEIN 9 (DMP9), als een bemesting regulator die betrokken is bij gameten interactie. We constateerden dat een afname van DMP9 expressie resulteert in significante remming van de bemesting van eicellen tijdens dubbele bevruchting in a. thaliana6.

Aangezien dubbele bevruchting optreedt in een embryo-zak, die is ingebed in een eicel die verder is verpakt met ovariumweefsel, is het moeilijk om de toestanden van dubbele bevruchting processen te observeren en te analyseren. Om deze reden zijn er nog steeds veel onduidelijke punten die een volledig begrip van het hele mechanisme van dubbele bevruchting controle belemmeren. De vaststelling van observatie technieken om het gedrag van gameten te traceren tijdens dubbele bevruchting onder in vivo omstandigheden is onmisbaar voor de functionele analyse van potentiële kandidaten voor bemesting regulatoren. Recente studies hebben markeringslijnen opgeleverd waar gameten subcellulaire structuren gelabeld zijn met fluorescerende eiwitten. In dit artikel tonen we een eenvoudig en snel protocol voor het observeren van dubbele bevruchting die heeft plaatsgevonden in een embryo-zak die is afgeleid van kunstmatig bestuikte stampers. Met behulp van sperma Cell Nucleus marker lijn HTR10-mRFP7, de bevruchting staat van elke vrouwelijke gameten kan worden gediscrimineerd op basis van sperma nucleaire signaal morfologie. Ons protocol gericht op een dergelijke morfologische verandering van de sperma kernen bij bevruchting kan efficiënt een voldoende hoeveelheid gegevens verkrijgen voor statistisch bewijs. Een DMP9-knockdown lijn met HTR10-mrfp achtergrond (DMP9KD/HTR10-mrfp) werd gebruikt als mannelijke planten om een enkele bevruchting patroon tonen. Het protocol is ook geschikt voor de functionele analyse van andere bemesting regulatoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. kunstmatige bestuiving

Opmerking: Voor aanvang van het proces is een paar No. 5 Tang nodig.

  1. Kweek a. thaliana (Col-0) bij 22 °c onder een 16-h licht/8-h donkere cyclus in een groei kamer.
    Opmerking: Snijd en verwijder de eerste ontwikkelde bloemsteel met een schaar ter bevordering van de ontwikkeling van de oksel toppen. Sterk groeiende planten (2-3 weken na het snijden van de eerste Steel; plant hoogte ongeveer 25 cm) zijn geschikt voor analyse.
  2. Om te emasculeren, verwijderen kelk (Figuur 1b), Petal(figuur 1c), en meeldraden (figuur 1d) van bloemknoppen in fase 118 (Figuur 1a) met behulp van No. 5 Tang. Bud met stukjes bloemblaadjes die bovenaan te zien is, is het beste.
    Opmerking: Gebruik een geschikte vrouwelijke gameten marker lijn. In dit protocol gebruikten we een wild type plant als de vrouwelijke ouder.
  3. Vijftien tot achttien uur na de emasculation, neem de meeldraad van een DMP9KD/HTR10-mrfp bloem in fase 138 door het filament met een tang te knijpen.
  4. Om te bestuiven, DEP het stigma van een schuimen meerdere malen zachtjes met een en Anther.

2. bereiding van de ovule voor observatie

Opmerking: De volgende items zijn vereist: een glaasje met dubbelzijdige tape, No. 5 Tang, een injectienaald van 27 G en een ontleed Microscoop.

  1. 7 tot 8 h na bestuiving (hap), verzamel de stamper en plaats deze op de dubbelzijdige tape, druk vervolgens zachtjes met een tang om de stamper op de tape te bevestigen (Figuur 2a, A ').
    Opmerking: De meeste zaadknoppen in een stamper krijgen ten minste één stuifmeel buis 10 hap9. Als beide of een van de spermacellen uit de eerste stuifmeel buis niet te bevruchten, een tweede pollen buis zou worden aangetrokken door de eicel als gevolg van de bevruchting herstel systeem10. Om de morfologie van de sperma kernen uit de eerste pollen buis te analyseren, wordt het aanbevolen om de eicel voorbereiding met 10 hap ten laatste te voltooien.
  2. Snijd de bovenste en onderste uiteinden van de eierstok met behulp van een injectienaald onder een ontleed Microscoop (Figuur 2b, B ').
  3. Spleet de eierstok aan beide zijden van de replum (figuur 2c, C ') door de punt van de injectienaald te bewegen.
    Opmerking: Steek de injectienaald ondiep om te voorkomen dat de eicel scheiden van het septum.
  4. Evert de eierstok met behulp van de injectienaald (figuur 2D, D ').
  5. Knijp in de basis van het septum waarop de eicellen zijn aangesloten en til deze voorzichtig op met een tang (figuur 2e).
  6. Breng de zaadknoppen over in een druppel water op een glaasje, en bedek zachtjes met een afdekglas voor observatie onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 2e, E ').

3. microscopie

Opmerking: In dit protocol gebruikten we een epifluorescentie Microscoop met een fluorescentie filter kubus (Zie tabel met materialen), een digitale camera en de bijbehorende software.

  1. Verkrijg afbeeldingen van zaadknoppen met sperma kernen gelabeld met mrfp met behulp van een 20x of 40x objectief lens en de uitgeruste digitale camera.
  2. Bevestig het aantal met mRFP gelabelde sperma kernen in een embryo-zak.
    Opmerking: Ovules met twee mRFP-gelabelde sperma kernen kunnen worden opgenomen in de populatiegrootte voor statistische analyse.
  3. Bevestig de vorm en de positie van elke met mRFP gelabelde sperma kern in een embryo SAC.
    Opmerking: Onmiddellijk na het vrijkomen van een pollen buis, zijn een paar gecondenseerde mRFP-gelabelde sperma kernen gelokaliseerd tussen het ei en de centrale cel. Een degecondenseerde mRFP-gelabelde sperma kern gedetecteerd aan de zijkant van chalazaal einde geeft bijvoorbeeld de bemesting van de centrale cel aan. Door gebruik te maken van een geschikte vrouwelijke gameten membraan marker lijn, zoals weergegeven in aanvullende Figuur 1, of de zaadcel ondergaat plasmogamie (na membraan fusie maar vóór karyogamie) kan duidelijk worden gecontroleerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ovules van een stamper bestuikte met DMP9KD/HTR10-mrfp werden verzameld op 7-8 hap en waargenomen.

De meeste zaadknoppen bevatten twee degecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kernen in de eicel (micropylar Side) en de centrale cel (charazal end Side) Nucleus posities (Figuur 3a), wat duidt op een geslaagde dubbele bevruchting. Bovendien werden zaadknoppen met een degecondenseerde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HTR10-mrfp labels vaderlijke chromatine (dat wil zeggen, visualiseert sperma celkernen), en de dynamiek in dubbele bevruchting is gemeld7. Onmiddellijk na het vrijkomen van een stuifmeel buis, HTR10-mRFP-gelabelde sperma kernen zijn nog steeds gecondenseerd. Echter, elk van de zaad kernen is gedegecondenseerd bij het samenvoegen met een bevruchte vrouwelijke gameten Nucleus op karyogamie drie tot vier uur na gameten membraan fusie7. Onbevruchte spermacellen blijven geconden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de Japan Society voor de promotie van Science KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) en door financiering van het strategisch prioriteits onderzoek promotieprogramma voor fytochemische planten moleculaire wetenschappen, Universiteit van Chiba (Japan).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BX51OlympusEpifluorescente microscoop
DekglasMatsunami glasC018181
DMP9KD/HTR10-mRFPArabidopsis thaliana, HTR10-mRFP achtergrond
Takahashi et al. (2018)6
Dubbelzijdig plakbandNichibanNW-15S15 mm breed
DP72OlympusDigitale camera
PincetVigorElke No. 5 pincet is beschikbaar
KweekkamerNihonikaLPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFPArabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) achtergrond
Ingouff et al. (2007)7
InjectienaaldTerumoNN-2719S27 G
GlijglasMatsunami glasS9443
SZX9OlympusDissectiemicroscoop
U-MRFPHQOlympusFluorescentie filter kubus (Excitatie: BP535-555, Emissi: BA570-625, Dichromatisch spiegel: DM565)
UPlanFL N 40xOlympusObjectieflens (NA 1.3), olie-immersie
UPlanSApo 20xOlympusObjectieflens (NA 0.75), droog

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
  2. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
  3. Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
  4. von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
  5. Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
  6. Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076(2018).
  7. Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
  8. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  9. Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).
  10. Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
  11. Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
  12. Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Arabidopsis thalianafluorescentiemicroscopiezaadknopanalysepollenbuisgroeikaryogamiebeoordelingembryozak imagingfertilisatiefenotypeHTR10 mRFP marker

Gerelateerde artikelen