Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

Samenvatting

Dit protocol toont de gelijktijdige detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), levende cellen en dode cellen in levende primaire culturen van muisoculaire oppervlaktecellen. 2',7'-Dichloorfluoresceindiacetaat, propidiumjodide en Hoechst-vlekken worden gebruikt om respectievelijk de ROS-, dode cellen en levende cellen te beoordelen, gevolgd door beeldvorming en analyse.

Samenvatting

Het oculaire oppervlak wordt onderworpen aan regelmatige slijtage als gevolg van verschillende omgevingsfactoren. Blootstelling aan UV-C-straling vormt een gevaar voor de gezondheid op het werk. Hier tonen we de blootstelling van primaire stamcellen van het oogoppervlak van de muis aan UV-C-straling. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) vorming is de uitlezing van de omvang van oxidatieve stress / schade. In een experimentele in vitro omgeving is het ook essentieel om het percentage dode cellen te beoordelen dat wordt gegenereerd als gevolg van oxidatieve stress. In dit artikel zullen we de 2',7'-Dichloorfluoresceindiacetaat (DCFDA) kleuring van UV-C blootgestelde muis primaire oculaire oppervlakte stamcellen en hun kwantificering op basis van de fluorescerende beelden van DCFDA vlekken. DCFDA kleuring komt direct overeen met ros generatie. We tonen ook de kwantificering van dode en levende cellen door gelijktijdige kleuring met respectievelijk propidiumjodide (PI) en Hoechst 3332 en het percentage DCFDA (ROS-positieve) en PI-positieve cellen.

Inleiding

Het oculaire oppervlak (OS) is een functionele eenheid voornamelijk samengesteld uit de buitenste laag en klierepithelia van hoornvlies, lachrymale klier, meibomian klier, bindvlies, een deel van de ooglid marges en innervations die transduce signalen¹. De transparante koepelvormige hoornvlieslaag richt licht op het netvlies. Dit avasculaire weefsel bestaat uit cellulaire componenten zoals epitheelcellen, keratocyten en endotheelcellen en acellulaire componenten zoals collageen en glycosaminoglycans². Het gebied wordt afgevoerd door tranen die ook de meeste voedingsstoffen leveren. De anatomische positie van het OS dwingt het om in direct contact met de externe omgeving te zijn, vaak bloot stellen aan verschillende harde componenten zoals fel licht, microben, stofdeeltjes en chemicaliën. Deze factor predisponeert het OS voor lichamelijkletsel en maakt het gevoelig voor verschillende ziekten.

Oxidatieve stress wordt veroorzaakt door het gebrek aan evenwicht tussen de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de endogene anti-oxidantafmechanismen³. ROS worden ingedeeld in reactieve moleculen en vrije radicalen, die beide afkomstig zijn van moleculaire zuurstof (O₂) door mitochondriale oxidatieve fosforylatie⁴. De eerste groep bestaat uit niet-radicale soorten zoals waterstofperoxide (H₂O_2),singlet zuurstof (¹O₂) en de laatste omvat soorten zoals superoxide anionen (O₂^-), en hydroxyl radicalen^(•OH), onder anderen. Deze moleculen zijn bijproducten van normale cellulaire processen en hun rollen zijn betrokken bij belangrijke fysiologische functies zoals signaaltransductie, genexpressie en hostdefense⁵. Een verbeterde productie van ROS is bekend te worden gegenereerd in reactie op factoren zoals pathogene invasie, xenobiotica, en blootstelling aan ultraviolette (UV) straling⁴. Deze overproductie van ROS resulteert in oxidatieve stress die leidt tot de schade van moleculen zoals nucleïnezuren, eiwitten en lipiden⁶.

Natuurlijk zonlicht, de meest overheersende bron van UV-straling, bestaat uit UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) en UV-C (290-200 nm)⁷. Een omgekeerde correlatie tussen de golflengte en spectrale energieën is gemeld. Hoewel natuurlijke UV-C-straling door de atmosfeer wordt geabsorbeerd, stoten kunstmatige bronnen zoals kwiklampen en lasinstrumenten uit en vormen daarom een beroepsrisico. Symptomen van blootstelling aan de ogen zijn fotokeratitis en photokeratoconjunctivitis⁸. Productie van ROS is een van de belangrijkste mechanismen van het toebrengen van UV-geïnduceerde cellulaire schade⁹. In de huidige studie tonen we de detectie van ROS aan met behulp van de 2',7'-Dichloordihydrofluorescelaat (DCFDA) kleuringsmethode in de primaire oculaire oppervlaktecellen/stamcellen van de muis die zijn blootgesteld aan UV-C. De groene fluorescentie werd vastgelegd met behulp van fluorescerende microscopie. Cellen werden tegengekleurd met twee kleurstoffen, Hoechst 33342 en rode propidiumjodide, om de levende en dode cellen te bevlekken, respectievelijk.

Protocol

Het experiment werd uitgevoerd op primaire oculaire cellen/ stamcellen afgeleid van het Zwitserse albino muisoog. Het gebruik van dieren voor het oogsten van de ogen voor dit experiment werd goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor het ethisch onderzoek van dieren, Yenepoya (geacht universiteit) (IEAC-goedkeuringsnummer, 6a/19.10.2016).

1. Voorbereidingen van reagentia

OPMERKING: De afleiding van primaire cellen/stamcellen van het oogoppervlak van de muis valt buiten het bereik van dit protocol. Daarom tonen we de UV-C blootstellingdoses, reagensvoorbereiding voor de beoordeling van ROS, levende en dode cellen en hun kwantificering. Raadpleeg tabel 1 voor de respectieve volumes van de reagentia (10% foetaal runderserum, DCFDA, Hoechst en propidiumjodidestockoplossingen die moeten worden toegevoegd voor het verkrijgen van de uiteindelijke kleuroplossing).

1. Bereid een voorraadoplossing van 10 mM DCFDA door 25 mg DCFDA poeder op te lossen in 5,13 mL DMSO. Aliquot 250 μL elk in amberkleurige 1,5 mL buizen en op te slaan op -20 °C.
2. Bereid een voorraadoplossing van 10 mg/mL (16,23 mM oplossing) Hoechst 33342 door het oplossen van de volledige inhoud van de 25 mg flacon in 2,5 mL gedeïoniseerd water. Maak aliquots van 100 μL in amberkleurige microcentrifugebuizen en bewaar maximaal 6 maanden bij 2-6 °C. Voor opslag op langere termijn, opslaan op -20 °C.
3. Bereid een voorraadoplossing van 1 mg/mL propidiumjodide in gedeïoniseerd water, aliquot 1 mL elk in amberkleurige 1,5 mL buizen, en op te slaan op 4 °C.

2. Celbeplating en UV-C-bestraling

1. Voor het platen, scheiden van de muis primaire oculaire oppervlaktecellen geïsoleerd in ons laboratorium (ongepubliceerde resultaten; dergelijke cellen zijn een mengsel van hoornvlies epitheel, stromal cellen en keratocyten) met behulp van een zachte cel dissociatie middel(Tabel van materialen).
2. Plaat 0,2 x 10⁶ muis primaire oculaire oppervlaktecellen in 35 mm 0,2% kelder membraan matrix gecoate celcultuur gerechten in 2,5 mL van complete media. Incubeer 's nachts bij 37 °C in een 5% CO₂ en bevochtigde couveuse.
   OPMERKING: Volledige media voor het kweken van primaire cellen van het oogoppervlak van de muis bestaat uit DMEM hoge glucose met 20% FBS, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% niet-essentieel aminozuur (NEAA), 1% natriumpyruvaat en 0,1% β-mercaptoethanol.
3. Voordat u de cellen blootstelt aan verschillende doses UV-C, gooi u het maximale mediavolume weg en laat u slechts een dunne laag media (~ 500 μL) in contact met de cellen houden, net genoeg om ze te bedekken.
4. Neem de gerechten één voor één mee naar de UV-C bron/kamer (de onderste kamer van een hybridisatieoven/UV-kruislinker; Materiaaltabel). Plaats de schotel in de kamer en verwijder het deksel van de schotel. De open dekselpositie van de schotel zorgt ervoor dat de cellen de maximale UV-C-dosis krijgen tijdens de UV-C-blootstelling.
5. Stel de cellen bloot aan verschillende kwaliteiten/doses UV-C: 1 J/m², 100J/m², 1.000 J/m² en 10.000 J/m².
6. Vervang na de UV-C-belichting het deksel van elk van de gerechten onmiddellijk en haal ze uit de UV-C-bronkamer.
7. Breng elk van de gerechten naar de laminaire luchtstroom kap en vul elk van de gerechten met 2 mL verse complete media.
8. Incubeer de cellen 3 uur in een 37 °C CO₂ incubator. Drie uur incubatie na UV-C blootstelling is optimaal te visualiseren en kwantificeren van de vroege effecten.

3. Voorbereiding van levende celkleuringsmedia

1. Bereid de vlekken media vers tijdens de laatste 15 min van de 3 uur cel incubatie na UV-C blootstelling.
2. Verwarm 10 mL van de kleuringsmedia met 10% FBS-DMEM aangevuld met 1% Pen-Strep tot 37 °C.
3. Voeg 5 μL van 10 mM DCFDA toe; 5 μL van 10 mg/mL Hoechst-oplossing en 200 μL van 1 mg/mL propidiumjodide. De uiteindelijke concentraties van DCFDA, Hoechst en PI zijn respectievelijk 5 μM, 5 μg/mL en 20 μg/mL in de 10 mL aan kleuringsmedia.

4. DCFDA-kleuring van uv-c-blootgestelde primaire oogcellen van de muis

1. Na 3 uur incubatie van UV-C blootgestelde primaire oogcellen van de muis bij verschillende doses, zuigt de media aan uit de 35 mm gerechten.
2. Vul met 2 mL vers bereide DCFDA kleuring sing media aan elk van de gerechten zachtjes vanaf de zijkanten.
3. Incubeer de cellen met de kleuringsmedia gedurende 15 min in het donker in een 37 °C CO₂ incubator voor levend-cel vlekken.

5. Bezichtiging van DCFDA (ROS), Hoechst en PI bevlekte cellen

1. Gooi na de incubatietijd de kleuringsmedia weg.
2. Voeg verse complete media toe aan de cellen en observeer de cellen onder een omgekeerde fluorescerende microscoop/celimager(Tabel van materialen). Fotografeer de gewenste velden: helderveld, blauwe fluorescentie, rode fluorescentie, groene fluorescentie.
   OPMERKING: De blauwe fluorescerende gekleurde cellen zijn de kernen, de groene fluorescentie is voor ROS genererende cellen en de rode fluorescentie geeft de PI positieve dode cellen aan.

6. Kwantificering van gekleurde cellen (Hoechst-Blue, PI-Dead en Green-ROS) met behulp van beeldvormingstechnieken

1. Exporteer de beelden die onder de omgekeerde fluorescerende microscoop/celimager zijn vastgelegd naar ImageJ voor kwantificering.
2. Open elk van de beelden een voor een, met behulp van elk kanaal (dat wil zeggen, blauw (Nuclei / Hoechst), groen (ROS), rood (Dead / PI positief)) achtereenvolgens, voor het tellen. Ga van de onbelichte besturing en ga achtereenvolgens naar 1, 100, 1.000 en 10.000 J/m^-2.
3. Tel de cellen met behulp van de cel teltool gemarkeerd als een kruis in het softwaremenu voor elk van de velden [blauw positief (Hoechst positief; kernen), rood positief (PI positief; dode cellen); groen positief (ROS)] in elk van de beelden die overeenkomen met elk van de Behandelingen.
4. Tel door op elk van de specifieke signalen in elk van de velden te klikken. Als u bijvoorbeeld op de blauw/Hoechst bevlekte kernen klikt, geeft het totale aantal kernen in een bepaald veld.
5. Bereken de resultaten als het percentage celsterfte door UV-schade (aantal PI-positieve cellen x 100 gedeeld door het aantal Hoechst positieve cellen) en het percentage ROS-productie door UV-schade (aantal DCFDA-positieve cellen x 100 gedeeld door het aantal Hoechst-positieve cellen).

Resultaten

DCFDA is een kleurloze kleurstof die een chemisch gereduceerde vorm van fluorescein gebruikt als een indicator voor het opsporen van ROS in cellen. Deze kleurstof wordt gevangen in cellen en is gemakkelijk geoxideerd tot fluorescerende dichloordihydrofluoresceine (DCF), die een groene fluorescentie uitzendt. Deze fluorescentie kan worden gedetecteerd met behulp van fluorescerende microscopie. De cellen kunnen als volgt worden gevisualiseerd en gecorreleerd met ROS-accumulatie: i) levende cellen zonder ROS zenden hoge bla...

Discussie

De DCFDA kleuring methode hier beschreven maakt de visualisatie van ROS in de muis primaire oculaire levende cellen behandeld met UV-C straling. Een voordeel van deze kleuringsmethode is dat het ook de onderzoekers in staat stelt om de onmiddellijke effecten van UV-C (3 uur na UVC-blootstelling) op de levende cellen en hun gelijktijdige opsomming voor het percentage ROS-positieve, evenals dode cellen te bestuderen. Bovendien, als de kleuring methode wordt gebruikt op de levende cellen, kunnen de cellen verder worden geïn...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is een fluorogene sonde en is permeabel voor cellen. Het wordt gebruikt voor de kwantificering van reactieve zuurstofsoorten.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Steriele schalen voor het kweken van de cellen.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Het meest gebruikte celkweekmedium, bevat 4500 mg/L glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	Een van de belangrijkste componenten van celkweekmedium. Het biedt groeifactoren, aminozuren, eiwitten, vetoplosbare vitaminen zoals A, D, E en K, koolhydraten, lipiden, hormonen, mineralen en sporenelementen.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Wordt gebruikt als supplement en als alternatief voor L-glutamine. Het helpt bij het verbeteren van celviabiliteit en groei.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridisatie oven/UV kruisverbindingsapparatuur
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst-kleurstof is doorlaatbaar voor zowel levende als dode cellen. Het bindt zich aan dubbelstrengs DNA, ongeacht of de cel dood of levend is.
Matrigel	Corning		Basale membraanmatrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Wordt gebruikt als supplement om de celgroei en -viabiliteit te verhogen.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicilline en streptomycine worden gebruikt om bacteriële besmetting in kweek te voorkomen.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorecente kleurstof die alleen doorlaatbaar is voor dode cellen. Het bindt zich aan DNA en helpt bij het onderscheid tussen levende en dode cellen.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Zacht celdissociatiemiddel
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad