Methodenartikel

Meten van interacties tussen fluorescentie sondes en lignine in plantendelen door sFLIM op basis van inheemse Autofluorescentie

DOI:

10.3791/59925

⸱

2 januari 2020

 ,  ,  , 
1PICT Platform, Université de Reims Champagne-Ardenne, 2Fractionation of AgroResources and Environment (FARE) Laboratory, INRA, Université de Reims Champagne-Ardenne, 3Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, Université de Lille

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een originele Setup met een combinatie van spectrale en fluorescentie levensduur metingen om Förster Resonance Energy Transfer (FRET) te evalueren tussen de op Rhodamine gebaseerde fluorescentie sondes en lignine Polymer rechtstreeks in dikke plantendelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In lignocellulosische biomassa (LB) wordt de activiteit van enzymen beperkt door het verschijnen van niet-specifieke interacties met lignine tijdens het hydrolyseproces, dat enzymen ver van hun substraat handhaaft. Karakteriseren van deze complexe interacties is dus een uitdaging in complexe substraten zoals LB. De methode hier meet de moleculaire interacties tussen met fluorophore gelabelde moleculen en inheemse autofluorescerende lignine, die door Förster Resonance Energy Transfer (FRET) worden onthuld. In tegenstelling tot FRET metingen in levende cellen die twee exogene fluor Foren gebruiken, is FRET metingen in planten die lignine gebruiken niet triviaal vanwege de complexe auto fluorescentie. We hebben een originele pijpleiding voor acquisitie en analyse ontwikkeld met gecorreleerde observatie van twee complementaire eigenschappen van fluorescentie: fluorescentie-emissie en levensduur. sFLIM (spectrale en fluorescerende levensduur Imaging microscopie) biedt de kwantificering van deze interacties met hoge gevoeligheid, waardoor verschillende interactieniveaus tussen biomoleules en lignine worden onthuld.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hydrolyseren van lignocellulose in monomere suikers zoals glucose vereist enzymen. Het is bekend dat hun activiteit wordt beperkt door het vaststellen van niet-specifieke interacties tussen enzymen en lignine1,2, waarbijdeze laatste een hydrofoob polymeer is en een belangrijk bestanddeel van lignocellulose3. Daarom is het kwantitatief meten van dergelijke interacties direct op de cellulaire schaal een uitdaging die moet worden aangepakt om de enzym katalytische activiteit en de lignocellulose voorbehandeling4te optimaliseren.

Förster (of fluorescentie) Resonance Energy Transfer (fret)-meting is een methode om de interactie van biomoleculen in situ te beoordelen. Deze niet-radioatieve energie overdracht kan optreden tussen een donor en een acceptor de als ze aan verschillende voorwaarden voldoen. Het emissiespectrum van de donor moet ten minste gedeeltelijk overlappen met het bekrachtigings spectrum van de accepteurs. De keuze van fluoroforen is dus cruciaal voor dergelijke experimenten. Vervolgens neemt de overdrachts efficiëntie af met de zesde kracht van hun afstand5 en treedt alleen op als beide moleculen in de buurt zijn (meestal in het nanometer-bereik). Andere onvoorziene omstandigheden kunnen de overdrachts efficiëntie wijzigen, zoals dipool-dipool oriëntatie, maar worden verzacht als fluoroforen flexibiliteit hebben.

FRET kan worden gemeten met verschillende technieken en gedetailleerde beschrijvingen zijn te vinden in de literatuur6,7. In het kort, de belangrijkste methoden vertrouwen op: i) gesensibiliseerde emissie waarin de variatie van de acceptor emissie fluorescentie wordt gevolgd en levert voornamelijk kwalitatieve resultaten op; II) foto bleking acceptor waarbij de emissie van de donor fluorescentie wordt gemeten vóór en na acceptatie van foto bleken (in dit geval kunnen preciezere FRET schattingen worden bereikt, maar vereisen sterke Laser kracht toegepast op vaste monsters); en III) levenslange meting die afneemt voor de donor in aanwezigheid van de acceptor. Deze methode vereist specifieke instrumenten en maakt nauwkeurige en gevoelige interactie metingen tussen fluoroforen mogelijk. Gezien de fret meting tussen fluorescentie sondes en lignocellulose, is het grootste probleem dat lignocellulose geen enkele goed gekarakteriseerde fluorophore is: het heeft een sterke inheemse en spectraal-brede autofluorescentie, voornamelijk afkomstig van lignine, en afhankelijk van biomassa soorten8,9.

In dit artikel stellen we een nieuwe en originele procedure voor die is aangepast aan secties van hout/plantaardige monsters. Deze sFLIM gebaseerde methode opent de weg naar kwantitatieve FRET metingen tussen fluorescentie sondes en lignine in inheemse lignocellulose samples.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. monstervoorbereiding

Opmerking: de opeenvolgende stappen voor het voorbereiden van de monsters worden beschreven in Figuur 1.

  1. Plant aardige monstervoorbereiding
    1. Van houten stammen of fragmenten, knip 1 cm lange monsters met scheermesjes zonder hun structuur te beschadigen.
    2. Insluiten van monsters in polyethyleen glycol (PEG) medium, door dippen ze in opeenvolgende oplossingen van toenemende PEG concentratie verdund in water tot 100% PEG bereiken.
      1. Plaats het monster onder vacuüm om water te verwijderen.
      2. Voorzichtig roeren van monsters in 30% v/v PEG voor 24 h.
      3. Voorzichtig roeren van monsters in 50% v/v PEG voor 24 h.
      4. Voorzichtig roeren van monsters in 100% PEG voor 24 h bij 70 ° c (zuivere PEG is solide bij kamertemperatuur).
    3. Plaats de monsters in capsules bij 70 °C (op een hete plaat) en verlaag de temperatuur geleidelijk tot de kamertemperatuur is bereikt.
    4. Bereid zorgvuldig 30-60 μm dikte platte secties van deze PEG blokken met behulp van een microtoom en Disposables Blades.
    5. Verzamel en spoel secties in drie opeenvolgende baden van water gedurende 5 minuten om PEG uit de secties te verwijderen.
  2. Voorbereiding van de fluorescerende sonde
    1. Bereid bufferoplossing van 30 mM fosfaat bij pH 6,0.
    2. Weeg PEG Rhand dextran Rhodamine sonde poeder.
    3. Los sonde poeder op in de buffer met continu roeren in een glazen injectieflacon voor 1 uur in het donker bij een eindconcentratie van 0,1 g/L.
  3. Plant aardige monster kleuring
    1. Inbroed delen met 500 μL van de fluorescerende sonde (zie 1.2.3) voor 72 h (niet roeren) in een kunststof buis (niet meer dan 3 secties per buis) in het donker.
    2. Pick-up een sectie met een borstel, adsorbeerd de buffer met een schoon vel (Vermijd het drogen van de sectie), en Monteer vervolgens de geïnde secties tussen een afdekglas en een #1.5H coverslip.

2. fluorescentie levensduur en spectrale meetsysteem kalibratie

Opmerking: de volledige workflow voor sFLIM-meting wordt weergegeven in afbeelding 2.

  1. Bepaal de spectrale vensterbreedte van de sFLIM-detector.
    1. Zet ureum kristallen in een kweek doos met een glazen bodem van 0,17 μm.
    2. Plaats de kweek doos op een Microscoop-monsterhouder en selecteer de 20x-doelstelling.
    3. Selecteer een TI: sa-laser met een 900 nm golflengte en 2% stroom en schakel het scannen in.
    4. Verzamel het tweede harmonische signaal op de sFLIM detector.
      Opmerking: het tweede harmonische signaal wordt uitgezonden op exact de halve excitatie golflengte van 450 nm; Hoewel ogenblikkelijk, deze maatregel biedt ook de instrumentale respons functie van het systeem.
    5. Pas geleidelijk de laser excitatie golflengte van 900 tot 980 nm aan totdat het tweede harmonische signaal wordt opgevangen in het tweede spectrale kanaal (462,5 nm).
    6. Bepaal de spectrale venster lengte (12,5 nm).
    7. Als het spectrale bereik verschilt van wat wordt verwacht, oplossen door het volgende te doen.
      1. Stel de laser in op 910 nm.
      2. Verplaats de rooster positie met een scrollwieltje om het tweede harmonische signaal alleen op het eerste kanaal te meten (eerste kanaal grens).
      3. Stel de laser in op 935 nm.
      4. Verplaats de rooster positie met een scrollwieltje om het tweede harmonische signaal alleen op het eerste kanaal te meten (tweede kanaal grens).
  2. Kalibratie van de totale spectrometer kanalen
    1. Plaats de spiegel op de Microscoop.
    2. Selecteer de zichtbare continue Laser (458 nm, 1% vermogen).
    3. Verzamel het reflectie signaal op de sFLIM-detector en controleer of de fotonen in het juiste spectrale kanaal worden gemeten.
    4. Herhaal stap 2.2.2 en 2.2.3 met alle beschikbare continue lasers (514 nm, 561 nm en 633 nm).
    5. Als het spectrale kanaal afwijkt van wat wordt verwacht, verplaatst u de rooster positie met het scrollwieltje en herhaalt u de stappen 2,1 en 2,2.

3. monster fluorescentie karakterisering

  1. In een Spectrofluorimeter uitgerust met een accessoire voor de film houder (bijv. jasco FP-8500-instrument), plaatst u het monster van de plant sectie (niet geïnineerd met de fluorescerende sonde).
  2. Meet de fluorescentie-emissie meestal op het bereik van 300-600 nm terwijl het monster meestal op het bereik 250-550 nm opwindend is.
  3. Plot de intensiteit van de fluorescentie versus excitatie en emissie golflengten om een 3D-fluorescentie kaart te tekenen.
  4. Bepaal het maximale excitatie-/emissiegebied van het waarnemingspunt.

4. spectrale FRET meting

  1. Automatische fluorescentie kalibratie
    1. Selecteer de doelstelling 20x (NA: 0,8).
    2. Zet de Two-photon Laser excitatie op 750 nm.
    3. Plaats het gedeelte tarwestro (WS) alleen tussen de glijbaan en de dekglaasje.
    4. Pas de volgende parameters toe in de software. Overschakelen naar de Lambda-modus. Selecteer de spectrale detector ChS met een 9,7 nm-resolutie. Selecteer het spectrale bereik tussen 420 en 722 nm.
    5. De afbeelding te verwerven.
    6. Bepaal de emissie piek van de donor (470 nm met deze instelling).
  2. Kalibratie van acceptor
    1. Plaats op Rhodamine gebaseerde fluorescentie sondes in een kweek doos met een glazen bodem van 0,17 μm.
    2. Verkrijg de afbeelding met dezelfde instelling.
    3. Bepaal de emissie piek van de acceptor (570 nm met deze instelling).
  3. Bepaal het spectrale bereik met het maximale "WS alone"-signaal en geen acceptor-signaal als de donor alleen emissie voor sFLIM metingen (460-490 nm met deze instelling).
  4. Monster meting
    1. Plaats de bevlekt plant sectie tussen de glijbaan en de dekglaasje.
    2. Verkrijg de afbeelding met dezelfde instelling.
    3. Sla het LSM-bestand op.
    4. Kwalitatief associëren een sterke FRET gebeurtenis met een afname van de emissie piek van de donor in vergelijking met de "WS alleen sample" en een toename van de acceptor emissie piek in vergelijking met de Rhodamine monster.

5. sFLIM metingen

Opmerking: voor de sFLIM Setup, het systeem gebruikt is een tijddomein sFLIM Setup zoals eerder beschreven10. Een rechtopstaande Microscoop en verschillende tijdsgecorreleerde enkelvoudige fotortelkaarten en confocale Microscoop fabrikanten kunnen worden gebruikt en het protocol moet dienovereenkomstig worden aangepast.

  1. Schakel het systeem naar de sFLIM-modus.
    1. Stel de confocale Microscoop in zoals beschreven in 4.1.1 en 4.1.2.
    2. Schakel over naar de niet-Gedescande modus in de software om fluorescerende fotonen naar de sFLIM-detector te sturen.
    3. Stel de sflim-acquisitie in op de modus inschakelen om foton te laten tellen op de SPC150.
    4. Selecteer 30 s tijdverzameling op SPC150.
    5. Controleer of de CFD tussen 1 x 105 en 1 x 106ligt.
      Let op: Zorg ervoor dat het aantal fotonen gemeten op de TCSPC-kaart altijd minder is dan 1% van de laser excitatie frequentie (in deze opstelling is de laser excitatie frequentie 80 MHz en kan de Detectiesnelheid niet hoger zijn dan 800 kHz in elke pixel om een stapel effect11te voorkomen).
  2. Plaats de installatie sectie "WS alone" tussen de glijbaan en de Afdeklijst.
    1. Stel de software in op continue modus om de laser scan toe te staan.
    2. Kies het meetgebied op het voorbeeld.
    3. Klik op Start op de SPC150.
    4. Sla het SDT-bestand op.
    5. Herhaal het proces voor ten minste 10 monsters per aandoening.
  3. Plaats de bevlekt plant sectie tussen de glijbaan en de dekglaasje.
    1. Herhaal stap 5.2.1-5.2.5.

6. sFLIM-analyse

  1. Selecteer sFLIM gegevens verkregen bestand op "WS alone" en importeer ze naar de SPCImage software met behulp van bestand | Importeren.
  2. Selecteer passende parameters.
    1. Van optie | Model, selecteer onvolledige multi-exponentials: 12,5 NS.
    2. Van optie | Voorkeurenselecteert u instrumentaal antwoord automatisch berekenen.
    3. Selecteer in het rechter menu van het hoofdpaneel het 2 exponentiële pasvorm model:
      figure-protocol-1
  3. Pas voor elk kanaal het aanpassings model toe en sla de fitte parameters op in een spreadsheet (a1, a2, t1, t2).
  4. Bereken voor vergelijking tussen kanalen en experimenten de gemiddelde fluorescentie levensduur in een spreadsheet (Tm):
    figure-protocol-2
  5. Bereken de gemiddelde levensduur voor alle monsters (ten minste 10) in alle kanalen.
    1. Analyseer Tm op donor kanalen (van kanaal 1 tot 3:460-490 nm) en bepaal het toegewezen kanaal (kanaal 2 overeenkomend met 467,5-480 nm) dat het hoogste foton-getal weergeeft en overeenkomt met de maximale emissie van lignine. Waarden uit kanaal 2 moeten worden gebruikt in stap 6,7.
  6. Selecteer sFLIM gegevens verkregen bestand op gekleurd WS en importeer ze naar de SPCImage-software.
    1. Herhaal stap 6.1-6.4.
  7. Bereken de fret efficiency Efret voor de donor in het vorige geselecteerde kanaal WS alone (tMD) en van gekleurd plant monster (tMDA):
    figure-protocol-3
  8. Vergelijk sFLIM en Efret waarden tussen de WS en het monster.
    1. Overweeg een positieve Efret die gepaard gaat met een homogene levensduur afname tussen WS en het te analyseren monster als fret Event (Zie representatieve resultaten en werken van spriet et al.12 en Terryn et al.10 voor details).
    2. Overweeg een levenslange afname verdeeld anders te wijten aan een mix van fret en lignine verdichting niveau en niet interpreteren als moleculaire interacties.
    3. Overweeg geen levenslange modificatie als een afwezigheid van meetbaar FRET signaal, maar niet als een gebrek aan interactie met lignine

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de sFLIM-capaciteit te demonstreren om moleculaire interacties tussen lignine en fluorescently-gelabelde moleculen te ontleden, gebruikten we eerst drie verschillende monsters (Figuur 3): inheemse tarwestro (WS), inheemse tarwestro geïnineerd met Peg gelabeld met RHODAMINE (PR10), en inheemse tarwestro met dextran gelabeld met RHODAMINE (DR10). PR10 is bekend om te interageren met lignine terwijl DR10 wordt verondersteld te zijn inert13,14,15. sFLIM Curves (Figuur 3, boven) tonen enkele wijzigingen die kunnen worden bereikt tussen het referentiemonster (WS) en twee interactie cases (DR10 en PR10). Inderdaad, men kan eerst gemakkelijk de fluorescentie toename opmerken in spectrale gebieden die overeenstemmen met de Rhodamine-emissie Range. Zorgvuldige observatie van de drie eerste kanaal fotonen verval curves onthult ook een sterkere buiging voor DR10 dan voor PR10. Na het monteren van de foton Decay curves en het berekenen van elk kanaal gemiddelde fluorescentie levensduur, wordt de fret Signature duidelijker (Figuur 3, onderkant). Inderdaad, terwijl de fluorescentie levensduur ook toeneemt en afneemt langs het fluorescentie spectrum voor het WS-monster, wordt een duidelijke FRET Signature waargenomen voor zowel PR10 als DR10 met: 1) een constante levenslange waarde in de donor-only emissie kanaal (3 eerste kanalen, in blauw); en 2) een toenemende fluorescentie levensduur in het spectrale kanaal, overeenkomend met een toenemende bijdrage van de hoge levenslange donor fluorophore.

Zodra ondubbelzinnige FRET is vastgesteld, maakt vergelijking van de levensduur van lignine fluorescentie (kanaal 2) een kwantificering mogelijk van de levensduur afname tussen WS (0,47 NS), DR10 (0,42 NS) en PR10 (0,36 NS) en onthult zo moleculaire interacties tussen lignine en zowel PR10 als DR10 met een sterkere affiniteit voor PR10.

Om de relevantie van deze methode te illustreren om verschillende interactieniveaus te kwantificeren, kiezen we drie andere monsters, die de enzym toegankelijkheid nabootsen op behandelde plant monsters: zuurbehandelde WS (AWS), in combinatie met PR van twee contrasteerd molecuulgewichten van 5 kDa en 20 kDa (PR5 en PR20). Na zorgvuldige inspectie van sFLIM-handtekeningen wordt de levensduur van de lignine-fluorescentie geëxtraheerd (Figuur 4). Zoals eerder vermeld, kan lignine fluorescentie levensduur worden gewijzigd door zijn omgeving16,17. Na zure behandeling, de fluorescentie levensduur maatregelen in AWS (0,28 NS) wordt lager dan eerder gemeten voor WS (0,47 NS), die bevestigt de eis van de sFLIM procedure voor eenduidige interpretatie van de levensduur afname en de noodzaak van negatieve controles voor elke geteste toestand. Zoals verwacht, wordt een sterke levensduur afname waargenomen bij het toevoegen van PR aan de AWS terwijl het samenwerkt met de lignine. Bovendien is de interactie sterker met PR5 (0,14 NS) in vergelijking met PR20 (0,16 NS), die consistent is met hun hydrodynamische RADIUS-meting (respectievelijk 2,3 nm en 4,8 nm voor PR5 en PR20), waardoor verschillende sterische beperkingen en dus een hogere bereikbaarheid van PR5 tot lignine worden induceren.

Beide experimenten tonen de relevantie van deze methode voor het fijn beoordelen van lignine interacties met enzymen, afhankelijk van hun grootte en op plantaardige monsters voor behandeling.

figure-results-1
Figuur 1: verschillende voorbereidingsstappen van de monsters. Tarwestro (WS) (A) wordt eerst verkleind in grootte (B) om te worden ingebed in Peg-medium (C). Het blok wordt gesneden met behulp van een microtoom uitgerust met wegwerpmessen (D). Na het wassen worden de resulterende delen (E) geplaatst voor incubatie in Peg of dextran Tagged-Rhodamine Solution (F). Gelabelde secties zijn gemonteerd voor sFLIM metingen (G). Schaal staven zijn 2 cm (a), 1 cm (B en C), 200 μm (E en G). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: complete workflow van spectrale fret-based interacties metingen. De figuur geeft de Setup een combinatie van spectrale fluorescentie intensiteit en levenslange metingen. Spectrale fluorescentie beelden worden verkregen met een confocale Microscoop, en sequentieel fluorescentie levensduur voor elk spectrale bereik worden gemeten met de sFLIM-detector. Analyse van fozijn verval curven maakt nauwkeurige bepaling van de interacties tussen het monster en de moleculen van belang. Kalibraties moeten worden verwerkt om artefacten te voorkomen. Ten eerste moet de sFLIM-detector met een spectrometer worden gekalibreerd en moet de instrumentale respons functie worden gecontroleerd. Ten tweede moet het complexe autofluorescentie signaal voor elk monster nauwkeurig worden gekalibreerd om de fluorescentie levensduur in elk kanaal te bepalen vóór toevoeging van een acceptor molecuul. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: representatieve sFLIM-metingen. sFLIM Curves (bovenste paneel) werden verworven op inheemse tarwestro (WS), WS geïnfiltreerd met PEG gelabeld met Rhodamine (WS + PEG) en inheemse tarwestro met dextran gelabeld met Rhodamine (WS + DEX). Voor elk monster werden sFLIM-curves voorzien van een bi-exponentieel verval model en de gemiddelde fluorescentie levensduur werd berekend voor elk kanaal (onderste paneel). WS + PEG en WS + DEX samples tonen een afname van de fluorescentie levensduur in het kanaal overeenkomend met alleen autofluorescentie (drie eerste staven) geassocieerd met een levenslange toename van het kanaal overeenkomend met een gemengde emissie van autofluorescentie en Rhodamine. Dit gedrag is kenmerkend voor een FRET-event tussen de lignine-en Rhodamine-gelabelde moleculen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: fluorescentie levensduur analyse van het kanaal overeenkomend met lignine autofluorescentie. Na het valideren van een FRET-evenement op basis van sFLIM-signatuur, werd de gemiddelde fluorescentie levensduur gemeten op zuurbehandelde WS (AWS), in combinatie met PR5 of PR20 (respectievelijk 5 kDa en 20 kDa). Terwijl beide PR-samples een levenslange afname presenteren, wordt de kleinste gekenmerkt door een sterkere levenslange reductie, waardoor een sterkere moleculaire interactie met lignine wordt onthuld. De methode is dus gevoelig genoeg om te discrimineren tussen beide (gemiddelde waarde en standaardfout worden weergegeven, n > 10 per aandoening). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het correleren van fluorescentie levensduur en emissiespectrum metingen maakt het combineren van voordelen van beide methoden mogelijk. Inderdaad, spectrale metingen alleen gebrek aan gevoeligheid en blijven kwalitatief. Aan de andere kant is de levensduur van fluorescentie de methode van keuze voor traditionele kwantitatieve FRET-metingen, maar er werd aangetoond dat lignine-autofluorescentie kan variëren afhankelijk van lignine-samenstelling en omgeving16. Lignine interacties met een acceptor of lignine structurele veranderingen kunnen dus niet worden gediscrimineerd omdat ze beiden resulteren in een levenslange afname. Zoals aangetoond, biedt de ontwikkelde methode ondubbelzinnige, gevoelige en kwantitatieve meting van interacties tussen lignine en acceptor moleculen in planten secties. Zelfs als de verschillende stappen van de methode rigoureus zijn geoptimaliseerd, moet met name voorzichtigheid worden betracht voor de volgende punten.

Met betrekking tot de monsters is de kwaliteit van de installatie sectie van cruciaal belang om in-focus beeldvorming te waarborgen. De verschillende stappen voor het insluiten van PEG moeten strikt worden gevolgd. De laatste wasstap is essentieel om ervoor te zorgen dat er geen interferentie van PEG in de monsters overblijft. Bovendien moeten buffer concentratie en pH strikt identiek worden gehouden voor alle metingen, omdat elke verandering een sterke invloed kan hebben op fluorescentie eigenschappen.

Levenslange meting kan ook delicaat zijn. De fluorescentie levensduur van de donor kan instabiel zijn, bijvoorbeeld vanwege een hoge excitatie. In een dergelijk geval kan het probleem worden opgelost door de laser stroom te tunen en de zoom in te zoomen. Een andere bekende bron van artefacten in de tcspc-metingen is foton Pulse pile-up. TCSPC kan namelijk de snelheid van twee fotonen die tussen dezelfde twee laserpulsen worden uitgezonden, niet meten. Terwijl plantaardige monsters zijn sterk gestructureerd, de fluorescentie is niet homogeen en kan leiden tot een verborgen puls botsing effect. Hoewel het aantal fotonen per seconde onder de 1%-excitatie limiet blijft, kan het in sommige steekproef gebieden hoger zijn. Om te zorgen voor geen botsing experimenten, kan worden overwogen om de levensduur van de donor fluorescentie te meten bij een andere foonflux. Als de levensduur toeneemt terwijl de flux afneemt, is een botsing effect het wijzigen van metingen. Optimale lichtstroom wordt bereikt met de levenslange stabiliteit van de donor.

Met betrekking tot sFLIM Decay Curve Analysis, raden we aan om te vertrouwen op elke individuele curve pasvorm om ervoor te zorgen dat het model nauwkeurig metingen beschrijft. Als dit niet het geval is, zorg er dan eerst voor dat geen van de eerder genoemde artefacten de gegevens hebben beschadigd. Vervolgens biedt stap 2.1.4 de instrumentale respons functie (IRF) van het systeem. Als IRF enkele anomalieën vertoont, optimaliseert u het optische pad om deze te minimaliseren. Een gemeten IRF voor montage tijdens stap 6,2 kan ook worden gebruikt. Tot slot kan de vrijheidsgraden van het model worden verhoogd tot een drie-exponentieel verval in stap 6,2. Het aantal fotonen dat nodig is voor de individuele levensduur en de bepaling van de proporties is echter hoog en daarom wordt het aanbevolen alleen te gebruiken om een stabielere gemiddelde levensduur te bereiken vanaf stap 6,4. Meer uitputtende informatie over FLIM, de karakterisering18, sflim en de toepassing ervan12 met name lignine10, kan worden gevonden in de literatuur.

Hoewel uitdagende, FRET meting in plantenweefsels met behulp van inheemse auto fluorescentie toont enkele voordelen. In vergelijking met FRET metingen uitgevoerd op levende weefsels waarin interactiestudies tussen biomoleules vaak vereist genetische manipulatie om intrinsieke fluorescerende markers uitdrukken, lignified plant weefsels zoals die hier gepresenteerd, bieden natuurlijke auto fluorescentie, en extrinsieke partner fluorescentie sondes kunnen gemakkelijk worden toegevoegd, waardoor veel tijd wordt bespaard. Echter, afhankelijk van de geanalyseerde plantensoorten en de mogelijke voor behandelingen die worden uitgevoerd, is het waarschijnlijk dat autofluorescentie wordt aangepast, zodat het zorgvuldig moet worden gekarakteriseerd en het gebruik van de als sondes mogelijk moet worden aangepast.

De sFLIM-methode moet worden toegepast op fluorescentie sondes zonder katalytische activiteit (PEG en dextran). In het kader van de installatie van lignocellulose hydrolyse kunnen interacties van enzymen in verschillende biomassa monsters worden uitgevoerd, wat mogelijk resulteert in de bepaling van de impact van lokalisatie (cellen en weefsels) op de interactie sterkte. De volgende optimalisatie stap is automatisering van de analyse stap. Inderdaad, met voldoende geanalyseerde gegevens, zou een machine learning-based analyseprocedure kunnen worden ingezet voor geautomatiseerde fenotype analyse, waardoor de mogelijkheid tot snelle screening van enzym-biomassa-efficiëntie zou toenemen. Bovendien vereist sFLIM geen fixatie van het monster en kan het gemakkelijk worden toegepast op dynamische enzym-lignine-interactiestudies. Een dergelijke unieke methode is waarschijnlijk het begeleiden van de enzym engineering strategie en biomassa voor behandeling om lignocellulose valorisatie te optimaliseren.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fanny Laurent (FARE) wordt hartelijk bedankt voor de voorbereiding van de figuren. De Onderzoeksfederatie FRABio (Universiteit van Lille, CNRS) wordt erkend voor het leveren van de technische omgeving die bevorderlijk is voor het bereiken van dit werk. De financiering werd verkregen van het Franse nationale onderzoeksbureau (LIGNOPROG project ANR-14-CE05-0026).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Confocal microscopeZEISSLSM 710 NLOvoor confocale beeldvorming
fijne borstelom secties te verzamelen
glas vialsvoor incubaties
hoge precisie microscoop dekglasjes 170+/-5µm n°1,5#Marienfeld0107032verkocht door Dutscher s.a in Frankrijk
Infrarood gepulseerde laserCOHERENTCHAMELEON VISIONVoor monsterexcitatie
Micropipet Research Plus monokanaal 20-200µLEppendorfmet bijbehorende tips
Micropipet Research Plus monokanaal 2-20µLEppendorfmet bijbehorende tips
Microscoopglaasjes ca. 76 x 26 mm geschuurde randen mat uiteindeThermo Fisher ScientificLR45D
microtoompmessen wegwerp (verpakking van 50)Agar ScientificT5024verkocht door Oxford Instruments in Frankrijk
mPEG-Rhodamine, 10 kDaCreative Peg WorksPSB-2263
mPEG-Rhodamine, 20 kDaCreative Peg WorksPSB-22642
mPEG-Rhodamine, 5 kDaCreative Peg WorksPSB-2264
nagellakvoor montage
pH meter five easy plusMettler toledoFEP20met elektrode
poly (ethyleen Glycol) gemiddeld mol. gewicht 1450Merck (sigma-Aldrich)P5402-1kgvoor monster inbedding
scheermesjes, eenzijdige messen, roestvrij staal, doos van 100Agar ScientificT586voor fragmentenvoorbereiding verkocht door Oxford Instruments in Frankrijk
roterende microtoomMicrom MicrotechHM 360
sFLim detectorBECKER-HICKLSPC 150voor levensduurverwerving
natriumdiwaterstoffosfaat dihydraat NaH2PO4, 2H2OMerck (sigma-Aldrich)71500voor bufferoplossing
natriumfosfaat dibasisch dihydraat Na2HPO4,2H2OMerck (sigma-Aldrich)30435-1kgvoor bufferoplossing, oude referentie, de nieuwe is 71643-1kg
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k DaMerck (sigma-Aldrich)R8881-100mg

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Inouye, H., et al. Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover. Scientific Reports. 4, 3756(2014).
  2. Li, X., Zheng, Y. Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects. Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).
  3. Vogel, J. Unique aspects of the grass cell wall. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).
  4. Lynd, L. R. The grand challenge of cellulosic biofuels. Nature Biotechnology. 35, 912(2017).
  5. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6, 103-110 (1995).
  6. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  7. Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Microscopy. 241 (2), 111-118 (2011).
  8. Herbaut, M., et al. Multimodal analysis of pretreated biomass species highlights generic markers of lignocellulose recalcitrance. Biotechnology for Biofuels. 11, 52(2018).
  9. Chabbert, B., et al. Fluorescence techniques can reveal cell wall organization and predict saccharification in pretreated wood biomass. Industrial Crops and Products. 123, 84-92 (2018).
  10. Terryn, C., Paës, G., Spriet, C. FRET-SLiM on native autofluorescence: a fast and reliable method to study interactions between fluorescent probes and lignin in plant cell wall. Plant Methods. 14 (1), 74(2018).
  11. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry. Kohen, E. , Academic Press. 99-117 (1989).
  12. Spriet, C., et al. Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells. Microscopy Research and Technique. 70 (2), 85-94 (2007).
  13. Donaldson, L. A., Newman, R. H., Vaidya, A. Nanoscale interactions of polyethylene glycol with thermo-mechanically pre-treated Pinus radiata biofuel substrate. Biotechnology and Bioengineering. 111 (4), 719-725 (2014).
  14. Herbaut, M., Zoghlami, A., Paës, G. Dynamical assessment of fluorescent probes mobility in poplar cell walls reveals nanopores govern saccharification. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 271(2018).
  15. Paës, G., Chabbert, B. Characterization of arabinoxylan / cellulose nanocrystals gels to investigate fluorescent probes mobility in bio-inspired models of plant secondary cell wall. Biomacromolecules. 13, 206-214 (2012).
  16. Donaldson, L. A., Radotic, K. Fluorescence lifetime imaging of lignin autofluorescence in normal and compression wood. Journal of Microscopy. 251 (2), 178-187 (2013).
  17. Auxenfans, T., Terryn, C., Paës, G. Seeing biomass recalcitrance through fluorescence. Scientific Reports. 7, 8838(2017).
  18. Waharte, F., Spriet, C., Héliot, L. Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein-protein interaction measurements in living cells. Cytometry A. 4, 299-306 (2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lignine interactiessFLIM imagingFRET analysefluorescentielevensduurspectrale imaginglignocellulosische biomassaenzyminteractiesPEG behandeling

Gerelateerde artikelen