Methodenartikel

NMR-based activiteit assays voor het bepalen van samengestelde remming, IC50 waarden, artefactuele activiteit, en de hele cel activiteit van nucleoside Ribohydrolases

DOI:

10.3791/59928

⸱

30 juni 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMR-based activiteit assays zijn ontwikkeld om te identificeren en te karakteriseren remmers van twee nucleoside ribohydrolase enzymen. De protocollen worden verstrekt voor aanvankelijke samenstellings analyses bij 500 μM en 250 μM, dosis-reactie analyses voor het bepalen van IC50 waarden, detergent tegen het scherm analyses, sprong-verdunnings tegen het scherm analyses, en analyses in de gehele cellen van E. coli .

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMR-spectroscopie wordt vaak gebruikt voor de identificatie en karakterisering van enzym remmers in Drug Discovery, met name in de context van fragment screening. NMR-based activiteit assays zijn bij uitstek geschikt om te werken bij de hogere concentraties van teststoffen die nodig zijn om deze zwakkere remmers te detecteren. Het dynamisch bereik en de chemische verschuivings dispersie in een NMR-experiment kunnen gemakkelijk resonanties van substraat, product en test verbindingen oplossen. Dit contrasteert met spectrofotometrische assays, waarin read-out interferentie problemen vaak voortkomen uit verbindingen met overlappende UV-VIS absorptie profielen. Bovendien aangezien zij verslaggever enzymen ontbreken, zijn de enig-enzym NMR-analyses niet naar voren gebogen aan gekoppelde-assay valse positieven. Dit attribuut maakt ze nuttig als orthogonale assays, een aanvulling op de traditionele high throughput screeningtests en Benchtop triage assays. De gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor aanvankelijke samenstellings analyses bij 500 μM en 250 μM, dosis-reactie analyses voor het bepalen van IC50 waarden, detergent tegen het scherm analyses, sprong-verdunnings tegen het scherm analyses, en analyses in de gehele cellen van E. coli . De methoden worden aangetoond met behulp van twee nucleoside ribohydrolase enzymen. Het gebruik van 1H NMR wordt getoond voor het purine enzym, terwijl 19F NMR wordt getoond voor het pyrimidine enzym. De protocollen zijn over het algemeen van toepassing op elk enzym waar substraat en product resonanties kunnen worden waargenomen en onderscheiden door NMR spectroscopie. Om het nuttigst in de context van drugontdekking te zijn, zou de definitieve concentratie van substraat niet meer dan 2-3x zijn Km waarde moeten zijn. De keus van NMR experiment hangt van de enzym reactie en de beschikbare substraten evenals de beschikbare NMR instrumentatie af.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kern magnetische resonantie (NMR) de spectroscopie is goed-gevestigd voor het kenmerken van en het controleren van enzymreacties1,2. Verschillen in chemische verschuivingen en koppelings patronen worden gebruikt om substraat en product resonanties te onderscheiden, en relatieve resonantie intensiteiten worden gebruikt om het percentage van de reactie te kwantificeren. Zowel de consumptie van substraat als de creatie van het product worden direct waargenomen in het NMR-spectrum. Dit contrasteert met spectrofotometrie of de spectroscopie van de fluorescentie, waarin de reactietijd cursus door een verandering in absorptie wordt vermeld toe te schrijven aan sommige chemische soorten die worden verbruikt of worden gecreërd. Net als bij de andere methoden kan NMR worden gebruikt om enzymreacties te bestuderen als functie van temperatuur, pH of andere oplossings omstandigheden, en de effecten van remmers kunnen worden bepaald.

Meer recentelijk, NMR-based enzymactiviteit assays zijn aangetoond voor fragment screening3,4. NMR-gebaseerde assays zijn bij uitstek geschikt om te werken bij de hogere concentraties van test verbindingen (vaak zo hoog als 1 mM) die nodig zijn om deze zwakkere remmers te detecteren. Het dynamisch bereik en de chemische verschuivings dispersie in het NMR-experiment kunnen gemakkelijk resonanties van substraat, product en test verbindingen oplossen. Dit vergelijkt gunstig aan spectrofotometrische analyses waar read-out interferentie problemen vaak voortkomen uit verbindingen met overlappende UV-VIS absorptie profielen. Bovendien aangezien zij verslaggever enzymen ontbreken, zijn de enig-enzym NMR-analyses niet naar voren gebogen aan gekoppelde-assay valse positieven. Dit voordeel maakt ze nuttig als orthogonale assays, een aanvulling op de traditionele high throughput screeningtests en Benchtop triage assays5.

In ons onderzoekslaboratorium worden NMR-based activiteit assays gebruikt voor het identificeren en evalueren van inhibitoren van Trichomonas vaginais nucleoside ribohydrolases. De T. vaginais parasiet veroorzaakt de meest voorkomende niet-virale seksueel overdraagbare aandoening6. Toenemende weerstand tegen bestaande therapieën7 is het besturen van de behoefte aan nieuwe, mechanisme-gebaseerde behandelingen, met essentiële nucleoside Salvage pathway enzymen die Prime doelen8. NMR-based activiteit assays zijn ontwikkeld voor zowel pyrimidine-en purine-specifieke enzymen, Uridine nucleoside ribohydrolase (UNH)9, en adenosine/Guanosine voorkeur nucleoside RIBOHYDROLASE (AGNH)10. De reacties die door deze twee enzymen worden gekatalyseert, worden weergegeven in Figuur 1. De NMR-assays worden gebruikt om fragment bibliotheken voor chemische uitgangspunten te screenen, te bepalen IC50 waarden, en onkruid uit aggregatie-based of covalente bindende remmers11. De zelfde analyses worden ook vertaald om enzymactiviteit in gehele cellen12te beoordelen.

De gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor aanvankelijke samenstellings analyses bij 500 μM en 250 μM, dosis-reactie analyses voor het bepalen van IC50 waarden, detergent tegen het scherm analyses, sprong-verdunnings tegen het scherm analyses, en analyses in de gehele cellen van E. coli . De protocollen zijn over het algemeen van toepassing op elk enzym waarin substraat en product resonanties kunnen worden waargenomen en onderscheiden door NMR spectroscopie. Drie veronderstellingen zijn gemaakt voor eenvoud. Eerst wordt het substraat niet gespecificeerd. Voor NMR-gebaseerde activiteit assays om nuttig te zijn, de uiteindelijke concentratie van substraat mag niet meer dan 2-3x de Km waarde4. In de getoonde voorbeelden, de uiteindelijke concentraties van adenosine en 5-fluorouridine zijn 100 μM (km = 54 μM) en 50 μm (km = 15 μm), respectievelijk. In de protocollen komt het bereiken van deze concentraties overeen met 12 l van 5 mM adenosine of 12 l van 2,5 mM 5-fluorouridine.

Ten tweede, de hoeveelheid enzym die in de protocollen, 5 l, is gekozen om te corresponderen met het bedrag dat nodig is om te resulteren in ongeveer 75% conversie van substraat naar product in 30 min. Deze hoeveelheid vertegenwoordigt meestal een grote verdunning van een gezuiverd enzym voorraad, en de verdunning moet vooraf worden vastgesteld voor elk enzym. Gezuiverd AGNH en UNH enzym voorraadoplossingen worden opgeslagen bij-80 °C in fracties die genoeg enzym voor verscheidene duizend reacties verstrekken. Zo, de verdunningsfactor idealiter alleen moet worden bepaald of gevalideerd om de paar maanden. Ten derde is het specifieke 1D NMR-experiment niet gespecificeerd. In de representatieve resultaten wordt 1H NMR getoond voor AGNH10 en 19F NMR wordt getoond voor UNH9, met het NMR-experiment beschreven in de overeenkomstige referenties. De keus van NMR experiment hangt van de enzym reactie en de beschikbare substraten evenals de beschikbare NMR instrumentatie af. Ten slotte moet worden opgemerkt dat de experimentele aanpak beschreven niet voldoet aan de strikte eisen van kwantitatieve NMR (qNMR)13,14. In het protocol wordt een procent reactie bepaald aan de hand van de relatieve veranderingen in intensiteit van dezelfde resonantie in elk spectrum, in plaats van door absolute concentraties te bepalen. Deze aanpak elimineert de noodzaak voor data-acquisitie en verwerking van wijzigingen, alsmede interne of externe normen, die nodig zijn voor qNMR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. initiële test samengestelde assays bij 500 μM en 250 μM

  1. Bereid substraat en testverbinding voor reacties.
    1. Bereid voorraad oplossingen van substraat (adenosine of 5-fluorouridine) in water en 50 mM test compound in deuterated dimethyl sulfoxide (DMSO). Refereer naar de introductie sectie voor concentraties van substraat oplossing voor gebruik.
    2. Voeg 12 l van substraat (adenosine of 5-fluorouridine) toe aan elk van de vier 1,5 mL microfuge buizen, 1 – 4.
    3. Voeg 6 l van deuterated DMSO toe aan buizen 1 (0 min controle) en 4 (30 min controle). Voeg 6 l van de teststof toe aan Tube 2. Voeg 3 l van de teststof en 3 l deuterated DMSO toe aan Tube 3.
  2. Bereid voldoende reactie stockoplossing.
    Nota: de voorraadoplossing is voor vijf reacties die elk 517 l van buffer, 60 l van deuterium oxyde, en 5 l van enzym oplossing (AGNH of UNH) bevatten. Refereer naar de introductie sectie voor concentraties van enzym oplossing voor gebruik.
    1. Voeg 2,59 mL reactiebuffer (50 mM kaliumfosfaat, 0,3 M KCl, pH 6,5) toe aan een conische buis van 15 mL. Voeg 300 l van deuterium oxide toe aan de conische buis. Voeg 25 l enzym oplossing (AGNH of UNH) toe aan de kegel.
    2. Omkeren de kegelvormige buis tweemaal om te mengen.
  3. Gelijktijdig te initiëren en te doven de 0 min controle reactie. Breng 582 l van de reactie voorraadoplossing over naar een schone microfuge buis. Voeg 10 l van 1,5 M HCl toe aan deze microfuge Tube. Breng de gecombineerde 592 l naar microfuge Tube 1. Aspireren en afzien van het monster tweemaal in een langzame, maar weloverwogen mode.
  4. Initiëren en uitvoeren van de resterende drie reacties in gespreide mode. Op tijd 0 min, overdracht 582 l van de reactie voorraadoplossing aan microfuge buis 2. Aspireren en afzien van het monster tweemaal in een langzame, maar weloverwogen mode. Herhaal met 30 s intervallen voor microfuge buizen 3 en 4. Wacht 30 minuten.
  5. De reacties te doven. Op tijd 30 min, voeg 10 l van 1,5 M HCl toe aan microfuge 2. Herhaal met 30 s intervallen voor microfuge buizen 3 en 4. Overdracht 600 l van de oplossing van elke microfuge naar NMR buizen.
  6. Verkrijgen van een 1D NMR-spectrum op elk monster. De gegevens verwerken om de juiste phasing en platte basislijnen te garanderen.
  7. Bereken de procentuele omzetting van substraat voor controle spectra.
    1. Overlay de spectra voor 0 min en 30 min controles. Schaal het substraat signaal in de 0 min controle om de 30 min controle wedstrijd. Let op dit percentage.
    2. Bereken de procent conversie als (100-percentage bepaald in stap 1.7.1).
  8. Bereken het percentage omzetting van substraat voor reacties die test samenstelling bevatten.
    1. Overlay Spectra voor de 0 min controle en eerste reactie met de 500 μM test compound. Schaal het substraat signaal in de 0 min controle om het spectrum met test compound wedstrijd. Let op dit percentage. Bereken procent conversie als (100-percentage bepaald).
    2. Herhaal dit voor de tweede reactie met de 250 μM test compound.
  9. Bereken de procentuele reactie en het percentage remming voor elke test samengestelde concentratie.
    1. Bereken de procentuele reactie als (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Bereken de procentuele remming als (100-percentage bepaald in stap 1.9.1).

2. bepaling van IC50 waarden

  1. Bereid substraat en testverbinding voor reacties.
    1. Bereid voorraad oplossingen van substraat (adenosine of 5-fluorouridine) in water en 10 mM test compound in deuterated DMSO. Refereer naar de introductie sectie voor concentraties van substraat oplossing voor gebruik.
  2. Bereid seriële verdunningen van 10 mM test Compound (in deuterated DMSO).
    1. Voeg 36 l deuterated DMSO toe aan vijf 1,5 mL microfuge buizen, 1 – 5.
    2. Voeg 12 l 10 mM test compound toe aan Tube 1 en tik licht om te mengen. Test compound is nu 2,5 mM.
    3. Breng 12 l van Tube 1 naar Tube 2 en tik licht om te mengen. Test compound is nu 0,63 mM. Breng 12 l van Tube 2 naar Tube 3 en tik licht om te mengen. Test compound is nu 0,16 mM. Breng 12 l van Tube 3 naar Tube 4 en tik licht om te mengen. Test compound is nu 0,04 mM. Breng 12 l van Tube 4 naar Tube 5 en tik licht om te mengen. Test compound is nu 0,01 mM.
  3. Bereid 14 1,5 mL microfuge tubes voor op reacties.
    1. Voeg 12 l van substraat (adenosine of 5-fluorouridine) toe aan elk van 14 1,5 mL microfuge buizen, 1-14.
    2. Voeg 12 l van deuterated DMSO toe aan buizen 1 (0 min controle) en 14 (30 min controle).
    3. Voeg 12 l van 10 mM teststof toe aan buizen 2 en 3. Voeg 12 l van 2,5 mM test compound toe aan tubes 4 en 5. Voeg 12 l van 0,63 mM teststof toe aan buizen 6 en 7. Voeg 12 l van 0,16 mM teststof toe aan buizen 8 en 9. Voeg 12 l van 0,04 mM teststof toe aan de buizen 10 en 11. Voeg 12 l van 0,01 mM teststof toe aan buizen 12 en 13.
  4. Bereid voldoende reactie stockoplossing voor om 15 reacties uit te voeren die 511 l buffer, 60 l van deuterium oxide bevatten, en 5 l van enzym oplossing (AGNH of UNH) elk. Refereer naar de introductie sectie voor concentraties van enzym oplossing voor gebruik.
    1. Voeg 7,67 mL reactiebuffer (50 mM kaliumfosfaat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) toe aan een conische buis van 15 mL. Voeg 900 l van deuterium oxide toe aan de conische buis. Voeg 75 l van enzym oplossing (AGNH of UNH) toe aan de kegel.
    2. Omkeren de kegelvormige buis 2x te mengen.
  5. Volg de stappen van de stappen 1.3 – 1.9 tot (met behulp van 576 l van reactie Stock Solution) om het percentage reactie voor elke test samengestelde concentratie te bepalen.
  6. Bereken IC50 waarde met behulp van GraphPad prisma.
    1. Een gegevenstabel maken die het logboek van de samenstellings concentraties van de reactie test correleert (200 μM, 50 μM, 12,5 μM, 3,13 μM, 0,78 μM, 0,20 μM) met percenten reactie (twee waarden elk).
    2. Gebruik een niet-lineaire curve fit om de IC50 -waarde en de standaardfout te bepalen.

3. detergent tegen het scherm analyses bij 100 μM en 50 μM

  1. Bereid substraat en testverbinding voor reacties.
    1. Bereid voorraad oplossingen van substraat (adenosine of 5-fluorouridine) in water en 10 mM test compound in deuterated DMSO. Refereer naar de introductie sectie voor concentraties van substraat oplossing voor gebruik.
    2. Voeg 12 l van substraat (adenosine of 5-fluorouridine) toe aan elk van de acht 1,5 mL microfuge buizen, 1 – 8.
    3. Voeg 6 l deuterated DMSO toe aan buizen 1 en 5 (0 min bedieningselementen) en 4 en 8 (30 min. bedieningselementen). Voeg 6 l van de teststof toe aan de buizen 2 en 6. Voeg 3 l van de teststof en 3 l deuterated DMSO toe aan de buizen 3 en 7.
  2. Bereid voldoende reactie stockoplossing zonder reinigingsmiddel voor vijf reacties die 517 l van buffer, 60 l van deuterium oxide, en 5 l van enzym oplossing (AGNH of UNH) elk bevatten. Refereer naar de introductie sectie voor concentraties van enzym oplossing voor gebruik.
    1. Voeg 2,59 mL reactiebuffer (50 mM kaliumfosfaat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) toe aan een conische buis van 15 mL. Voeg 300 l van deuterium oxide toe aan de conische buis. Voeg 25 l enzym oplossing (AGNH of UNH) toe aan de kegel.
    2. Omkeren de kegelvormige buis 2x te mengen.
  3. Bereid voldoende reactie stockoplossing met 0,01% v/v Triton X-100 wasmiddel om vijf reacties die 517 l van buffer, 60 l van deuterium oxide, en 5 l van enzym oplossing (AGNH of UNH) bevatten elk lopen.
    1. Voeg 2 l van Triton X-100 detergent toe aan 20 mL reactiebuffer (50 mM kaliumfosfaat, 0,3 M KCl, pH = 6,5). Reinigingsoplossingen moeten binnen 1 dag gebruikt worden.
    2. Voeg 2,59 mL reactiebuffer met 0,01% Triton X-100 wasmiddel toe aan een conische buis van 15 mL. Voeg 300 l van deuterium oxide toe aan de conische buis. Voeg 25 l enzym oplossing (AGNH of UNH) toe aan de kegel.
    3. Omkeren de kegelvormige buis 2x te mengen.
  4. Voor buizen 1 – 4, met behulp van de reactie voorraad oplossing zonder wasmiddel, volg de stappen beschreven in stappen 1.3 – 1.9 om het percentage remming voor elke test samengestelde concentratie te bepalen.
  5. Voor buizen 5 – 8, met behulp van de reactie stockoplossing met 0,01% v/v Triton X-100 wasmiddel, volg de stappen beschreven in stappen 1.3 – 1.9 om het percentage remming voor elke test samengestelde concentratie te bepalen.

4. Jump-verdunnings teller scherm assays

  1. Bereid het substraat en de test verbindingen voor reacties
    1. Bereid voorraad oplossingen van substraat (adenosine of 5-fluorouridine) in water en 10 mM test compound in deuterated DMSO. Refereer naar de introductie sectie voor concentraties van substraat oplossing voor gebruik.
    2. Voeg 53,8 l reactiebuffer (50 mM kaliumfosfaat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) toe aan twee 1,5 mL microfuge buizen (elk), 1 en 2. Voeg 5 l van enzym (AGNH of UNH) toe aan buizen 1 en 2.
    3. Voeg 511 l reactiebuffer toe aan twee 1,5 mL microfuge buizen, 3 en 4 (elk). Voeg 60 l van deuterium oxide toe aan buizen 3 en 4. Voeg 5 l van enzym (AGNH of UNH) toe aan buizen 3 en 4.
    4. Voeg 1,2 l van deuterated DMSO toe aan Tube 1 (30 min controle). Voeg 1,2 l van de teststof toe aan Tube 2. Voeg 12 l van deuterated DMSO toe aan Tube 3 (30 min controle). Voeg 12 l van de teststof toe aan Tube 4. Incubeer voor 30 min.
  2. Bereid twee 1,5 mL microfuge buizen met verdunnings oplossing.
    1. Voeg 468 l reactiebuffer toe aan elk van de twee 1,5 mL microfuge buizen, 5 en 6. Voeg 60 l van deuterium oxide toe aan elke buis (5 en 6).
  3. Bereid vier 1,5 mL microfuge buizen voor de reacties.
    1. Voeg 12 l van substraat (adenosine of 5-fluorouridine) toe aan elk van de vier 1,5 mL microfuge buizen, 7 – 10.
  4. Voer sprong-verdunningen en initiëren van de reacties.
    1. Breng 528 l van de oplossing van Tube 5 naar Tube 1. Aspireren en afzien van het monster tweemaal in een langzame, maar weloverwogen mode. Overdracht 528 l van de oplossing van tube 6 naar Tube 2. Aspireren en afzien van het monster tweemaal in een langzame, maar weloverwogen mode.
    2. Op tijd 0 min, overdracht 588 l van oplossing van buis 1 aan buis 7. Aspireren en afzien van de steekproef 2x in een langzame maar weloverwogen manier. Met 30 s intervallen, overdracht 588 l van de oplossing van Tube 2 naar Tube 8, tube 3 naar Tube 9, en Tube 4 naar tube 10. Aspireren en afzien van het monster tweemaal in een langzame, maar weloverwogen mode. Wacht 30 minuten.
  5. Voor buizen 7 – 10, volg de stappen die in stappen 1.5 – 1.9 worden geschetst om de percenten remming voor elke test samenstellings concentratie te bepalen.

5. samengestelde assays in de hele cellen van E. coli

  1. Bereid 10 mL 's nachts cultuur van E. coli op de dag voorafgaand aan experimenten.
  2. Bereid E. coli -cellen voor NMR-experimenten voor.
    1. Centrifugeer de cellen in 1 mL hoeveelheid gedurende 10 min bij 15.000 x g.
    2. Gooi de bovendrijvende en hersuspendeer elke hoeveelheid cellen in 1 mL reactiebuffer (50 mM kaliumfosfaat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) door vortexen.
  3. Volg de secties 1 of 2 voor de gewenste assay met de volgende wijzigingen:
    1. Vervang 280 l van de buffer in de reactie stockoplossing met 280 l van hersuspendeerde cellen.
    2. Vervang 5 l van enzym (AGNH of UNH) in de reactie voorraadoplossing met 5 l buffer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2 toont de resultaten voor het testen van twee verbindingen tegen AGNH met behulp van 1H NMR na deel 1. De enzym reactie is het gemakkelijkst waargenomen en gekwantificeerd door de verdwijning van adenosine singlet en verdubbelt resonanties op 8,48 ppm en 6,09 ppm, respectievelijk, en het uiterlijk van een adenine singlet resonantie op 8,33 ppm zoals waargenomen in de 30 min controle Spectrum. In aanwezigheid van 500 μM compound 1 wordt geen enkel product gevormd zoals blij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beschreven protocollen zijn over het algemeen toepasbaar op vele enzymen, op voorwaarde dat de substraten en/of producten oplosbare signalen in het NMR-spectrum hebben. Het is echter van cruciaal belang dat de concentratie van het substraat dicht bij de Km waarde en hoog genoeg om te worden gedetecteerd in een NMR-experiment binnen een redelijke termijn. Een substraatconcentratie niet hoger dan 2-3x de Km waarde is optimaal voor het opsporen van concurrerende, niet-concurrerende...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr Dean Brown voor het verstrekken van verbindingen van de AstraZeneca fragment Library en Dr David AGNH voor het verstrekken van de enzymen en UNH. Het onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd werd gesteund door het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten van de nationale instituten van gezondheid onder toekennings aantal R15AI128585 aan B. J. S. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële meningen van de nationale instituten van gezondheid. onderzoek werd ook ondersteund door een Horace G. McDonell Summer Research Fellowship uitgereikt aan S. N. M., een Lodewijks familie Fellowship uitgereikt aan J. A. G. en facultaire ontwikkelings beurzen en Frederick Bettelheim Research Award van Adelphi University naar B. J. S.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AGNHGezuiverd in-houseN/ATVAG_213720
UNHGezuiverd in-houseN/ATVAG_092730
AdenosineSigmaA9251
5-FluorouridineSigmaF5130
Dimethyl sulfoxide-D6Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D, 99.9%
Kaliumfosfaat monobasicumSigmaP0662
Kaliumfosfaat dibasicumSigmaP3786
KaliumchlorideSigmaP9541
DeuteriumoxideCambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99.9%
ZoutzuurFisher ChemicalA144212
Triton X-100SigmaX100
3-(Trimethylsilyl)propionzuur-2,2,3,3,-d4 natriumzout (TSP)Sigma269913D, 98%
2,2,2-Trifluorethanol-1,1-d2Sigma612197D, 99.5%
PipetGilsonF123602PIPETMAN Classic P1000
PipetGilsonF123601PIPETMAN Classic P200
PipetGilsonF123600PIPETMAN Classic P20
Microfuge buizenFisher Scientific05-408-129
Conische buizenCorning352099
MicrocentrifugeEppendorf5418
Vortex mixerFisher Scientific02215365
NMR buizenNorell502-7Of zoals passend voor de NMR
NMR spectrometerBrukerN/AAvanceIII500
Prism softwareGraphPadN/AVersie 5.04

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NMR activiteitsassaysenzymremmingIC50 bepalingdetergent counterscreenjump dilution assayproton NMRfluor NMRsubstraatconversie

Gerelateerde artikelen