Methodenartikel

Het meten van de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen met behulp van klik chemie

DOI:

10.3791/59930

⸱

30 oktober 2019

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proliferatie is een essentieel onderdeel van cellulaire functie, en een gemeenschappelijke uitlezen gebruikt om te beoordelen van de potentiële toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen. Het meten van de proliferatie is daarom een vaak gebruikte assay in celbiologie. Hier presenteren we een eenvoudige, veelzijdige methode voor het meten van de proliferatie die kan worden gebruikt in aanhandige en niet-aanhantende cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen van een cel om te vermenigvuldigen is een integraal onderdeel van de normale functie van de meeste cellen, en disregulatie van proliferatie is de kern van vele ziekteprocessen. Om deze redenen, het meten van de proliferatie is een gemeenschappelijk instrument gebruikt om te beoordelen van de functie van de cel. Celproliferatie kan eenvoudig worden gemeten door te tellen; Dit is echter een indirecte manier om de proliferatie te meten. Een veelgebruikte manier van het direct opsporen van cellen die zich voorbereiden op te splitsen is door toevoeging van gelabelde nucleoside analogen. Deze omvatten de radioactieve nucleoside analoge 3H-thymidine plus niet-radioactieve nucleoside analogen zoals 5-broom-2 ' deoxyuridine (Brdu) en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU). De integratie van EdU wordt gedetecteerd doorklik chemie, die verschillende voordelen heeft in vergelijking met BrdU. In dit verslag bieden we een protocol voor het meten van de proliferatie door de integratie van EdU. Dit protocol bevat opties voor verschillende uitlezingen, samen met de voor-en nadelen van elk. We bespreken ook plaatsen waar het protocol kan worden geoptimaliseerd of gewijzigd om te voldoen aan de specifieke behoeften van het geplande experiment. Ten slotte raken we aan de manieren waarop dit basisprotocol kan worden aangepast voor het meten van andere celmetabolieten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proliferatie is een essentieel onderdeel van cellulaire functie1,2. Beheersing van proliferatie beïnvloedt normale processen zoals ontwikkeling en pathologische processen zoals kanker en hart-en vaatziekten. Hyperkunststof groei van vasculaire gladde spiercellen, bijvoorbeeld, wordt beschouwd als een voorloper van atherosclerose3. Veranderingen in celproliferatie worden ook gebruikt om de potentiële toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen te beoordelen. Gezien de wijdverbreide impact, is het meten van de proliferatie een pijlers van veel op cel biologie gebaseerde laboratoria.

Celproliferatie kan worden gemeten door eenvoudigweg cellen te tellen als de celpopulatie van belang vrij snel verdeelt. Voor langzamere groeicellen kunnen celtellingen minder gevoelig zijn. Proliferatie wordt vaak gemeten door opneming van gelabelde nucleoside analogen. Hoewel de gouden standaard 3H-thymidine-integratie is, komen veel laboratoria weg van deze methode gezien de beschikbaarheid van nieuwere, niet-radioactieve alternatieven. Deze omvatten cytoplasmische fluorescerende kleurstoffen, detectie van celcyclus geassocieerde eiwitten, en opname van niet-radioactieve nucleoside analogen zoals 5-broom-2 ' deoxyuridine (BrdU) en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.

Cytoplasmische kleurstoffen, zoals carboxyfluoresceïne DIACETAAT succinimidyl Ester (CFSE), detectie van proliferatie omdat de intensiteit van de kleurstof helften elke keer dat de cel verdeelt5. Deze techniek wordt vaak gebruikt in flow cytometrie voor niet-aanhandige cellen. Het is niet veel gebruikt voor aanhandige cellen, maar met de nieuwe generatie van beeldvormings plaat lezers kan dit veranderen. Detectie van celcyclus geassocieerde eiwitten door middel van op antilichamen gebaseerde technieken (Flowcytometrie, immunohistochemie, enz.) wordt vaak gebruikt voor weefsels of niet-aanhangend cellen. Deze cellen/weefsels moeten voorafgaand aan de kleuring worden vast en permeabiliseerd. Nucleoside analogen BrdU en EdU zijn vergelijkbaar in benadering van 3H-thymidine, maar zonder het ongemak van radioactiviteit. De opname van BrdU wordt gedetecteerd door anti-BrdU-antilichamen en daarom moeten de cellen voorafgaand aan de kleuring worden bevestigd en permeabiliseerd. Bovendien moeten de cellen met DNase worden behandeld om de BrdU epitope bloot te leggen.

De oprichting van EdU wordt gedetecteerd doorklik chemie, waarin alkyn en natriumazide groepen "Klik" samen in de aanwezigheid van katalytisch koper. Beide groepen kunnen dienen als het biosynthetisch opgenomen molecuul of detectie molecuul4. In de handel verkrijgbare nucleoside-analogen hebben de alkyn-groep bijgevoegd. Voor proliferatie assays, daarom, de alkyn Gefunctionaliseerde Nucleoside analoog wordt gedetecteerd door een natriumazide geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstof of andere marker. De oprichting van EdU heeft verschillende voordelen ten opzichte van BrdU. Ten eerste, omdat alkyn-en natriumazide-groepen niet in zoogdiercellen worden aangetroffen, is deze interactie zeer specifiek met een lage achtergrond6. Omdat beide groepen klein zijn, hoeven cellen geen DNA denaturatie te ondergaan om de Nucleoside analoog bloot te leggen zoals vereist voor BrdU7. Tot slot, klik chemie is zeer veelzijdig, en kan worden gebruikt voor de metabole labeling van DNA, RNA, eiwitten, vetzuren, en koolhydraten8,9,10,11. Als het metabosch gelabelde doel van belang is op het celoppervlak, kunnen levende cellen worden gelabeld12. Bovendien kunnen cellen verder worden verwerkt voor immunofluorescentie kleuring met antilichamen.

Het volgende protocol beschrijft het gebruik van EdU-integratie en klik op chemie om proliferatie in menselijke vasculaire gladde spiercellen te meten (Figuur 1). We tonen drie verschillende manieren waarop de integratie van EdU kan worden gemeten, representatieve resultaten van elk, en hun voor-en nadelen. Het meten van proliferatie via Klik chemie is vooral handig voor aanhangend, langzamer groeiende cellen. Daarnaast is de morfologie van de cel goed onderhouden en kan ook op antilichamen gebaseerde vlekken worden uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. detectie van EdU met fluorescerende label

  1. Stock oplossingen
    1. Bereid een 5 mM EdU-stamoplossing voor door 12,5 mg EdU toe te voegen aan 10 mL dubbel gedestilleerd H2O.
    2. Bereid de etiketteringsoplossing componenten: 200 mM tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA) (100 mg in 1,15 mL H2o), 100 mm CuSO4 (15,95 mg in 1 ml h2o; vers maken), 10 mm Cy3 picolyl-azide (1 mg in 95,3 ml h2o , opgeslagen in 5 μL aliquots bij-20 °C) en 1 M Natriumascorbaat (200 mg in 1 mL H2O; vers maken).
    3. Bereid de resazurin stockoplossing voor met een concentratie van 0,15 mg/mL. Filter steriliseren en bewaar 1 mL aliquots bij 4 °C.
      Opmerking: Picolyl natriumazide is beschikbaar geconjugeerd aan verschillende Fluors, Biotine en mierikswortelperoxidase (HRP).
  2. Etiket vasculaire gladde spiercellen (VSMC) met EdU.
    Opmerking: menselijke Vsmc's werden geïsoleerd van de iliacale slagaders via uitgroei van explanted stukjes weefsel. Wanneer geteeld in serum vrije media met insuline, transferrin, selenium deze cellen Express VSMC markers smoothelin, gladde spier myosin zware keten (SM-MHC) en SMC αactin13.
    1. Plaat vasculaire gladde spiercellen op 2 x 104/ml in dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM) in een 96 goed plaat.
      Opmerking: cellen worden geteeld op 37 ° c in gladde spieren celmedia met 2% foetaal runderserum.
    2. Optionele Laat enkele uren om te overnachten voor hechting. Voeg aan elke put 20 μL resazurin voorraad toe. Incuberen bij 37 °C gedurende 3 uur. Lees het fluorescentie signaal in een plaat lezer (560ex, 594em). Vervang media door Fresh DMEM.
      Opmerking: deze stap is optioneel. Resazurin wordt gebruikt om celaantallen te normaliseren en rekening te brengen voor goed-tot-goed variabiliteit in plating14.
    3. Voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) 30 ng/mL toe aan 3 − 6 putjes per behandeling aan het begin van de kweekperiode en inincuberen voor 72 h.
    4. Verdun 5 mM EdU-kolf tot 1 mM. Voeg 2 μL toe aan elk goed (eindconcentratie 20 μM) voor de laatste 24 uur van de cultuur periode van 72 uur. Voeg EdU niet toe aan één set replicaten. Deze putten zullen worden gebruikt om de achtergrond fluorescentie/luminescentie te bepalen.
      Opmerking: de duur van de cultuur en labeling met EdU is geoptimaliseerd voor gladde spiercellen, maar moet mogelijk per celtype worden gewijzigd.
  3. Corrigeer cellen in Paraformaldehyde (PFA).
    1. Verwijder media en voeg 150 μL van 4% PFA (in PBS) per goed toe gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder PFA en voeg 150 μL van 1% polyethyleenglycol tert-octylfenyl ether (TX-100) (in water) per put gedurende 30 min bij kamertemperatuur toe.
    3. Verwijder TX-100 door drie keer te wassen met PBS.
      Let op: PFA is giftig, voorzichtig behandelen.
      Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Vaste cellen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 °C.
  4. Detecteer opgenomen EdU.
    1. Maak een etiketteringsoplossing (10 mL per 96 boorput, met behulp van Inner 60 Wells) vlak voor gebruik door het toevoegen van reagentia uit stamoplossingen in de volgende volgorde: THPTA 20 μL, CuSO4 20 μl, Cy3 picolyl natriumazide 5 μl, na ascorbaat 100 ΜL naar PBS voor een totaal volume van 10 ml.
    2. Verwijder PBS uit Wells en voeg 150 μL etiketteringsoplossing toe aan elk putje. Inincuberen 30 min bij 37 °C. Om alle kernen te detecteren, Voeg 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) toe aan elk goed. Lees op een fluorescentie plaat lezer (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) of afbeelding op een microscoop.
      Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Vaste en gekleurde cellen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 °C en op een later tijdstip worden afgebeeld.

2. detectie van EdU met luminescentie

  1. Voltooi de secties 1.1 – 1.3.
  2. Bereid tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Polysorbaat 20 (TBST).
  3. Blok putten.
    1. Voeg 150 μL blokkerende buffer (tabel met materialen) toe aan elk goed en inbroed gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder de blokkeerbuffer en was driemaal met 200 μL PBS.
  4. Detecteer opgenomen EdU.
    1. Maak etiketteringsoplossing zoals aangegeven in stap 1.4.1, vervangen Biotine picolyl natriumazide voor Cy3 picolyl natriumazide.
    2. Wasputten vijf maal met 200 μL TBST, met schudden, 3 min per wasbeurt.
    3. Quench endogene peroxiasen met 150 μL 0,3% H2O2 gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder H2O2 en was vijf maal met 200 μL TBST, met 3 minuten schudden per wasbeurt.
    5. Verdun streptavidine-mierikswortelperoxidase (SA-HRP; 1:200) in TBST en voeg 50 μL toe aan elk goed. Incuberen 1 uur bij kamertemperatuur.
    6. Was vijf maal met 200 μL TBST, met schudden, 3 min per wasbeurt.
    7. Voeg aan elk goed 50 μL chemiluminescentie-enzym-gebonden immunosorbens assay (ELISA) substraat (tabel van materialen) toe.
    8. Lees onmiddellijk in de plaat lezer die de luminescentie kan detecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In Figuur 2tonen we de uitkomsten van drie verschillende experimenten die de proliferatie van VSMC in reactie op pdgf meten. Na het kweken van de cellen in Media geformuleerd voor Smc's, hebben we het experiment uitgevoerd in serum vrije DMEM, om mogelijke effecten van serum of groeifactoren op proliferatie te elimineren. In Figuur 2a vergelijken we resultaten, van hetzelfde experiment, met behulp van een fluorescerende VS luminescente uitlezen. Om deze platen t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De integratie van EdU is een eenvoudige en ongecompliceerde manier om celproliferatie te meten; het is vooral handig voor het aanhechting van cellen13. Ons protocol maakt gebruik van gladde spiercellen, maar het is van toepassing op elke aanhandige cel (epitheliale, endotheel, enz.). Hoewel het protocol niet ingewikkeld is, is het een cruciale stap om de etiketteringsoplossing te maken-de ingrediënten moeten in de aangegeven volgorde worden toegevoegd. Bovendien, zoals chemiluminescentie Western b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Katie Carroll voor technische assistentie. We danken ook Dr. David cool en het Proteomics Analyselaboratorium voor instructie over en het leveren van de Cytation Imaging Plate Reader. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Wright State Foundation (aan L.E.W.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-Ethynyl-2'-deoxyuridineCarbosynthNE08701
biotin picolyl azideClick Chemistry Tools1167-5
CuSO4Fisher ScientificC1297-100G
Cy3 picolyl azideClick Chemistry Tools1178-1
Cytation Plate ReaderBiotek
EVOS MicroscopeThermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solutionSigma-Aldrich216763
Na ascorbateSigma-Aldrich11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready ProbesInvitrogenR37606DAPI nucleaire kleurstelling
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000blocking buffer
ParaformaldehydeElectron Microscopy Services15710
PBSFisher ScientificSH3002802
Sodium ChlorideSigma Life ScienceS3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase ConjugateLife TechnologiesS911
Super Signal ELISA FemtoThermo ScientificPI137075ELISA substraat
Synergy Plate ReaderBiotek
THPTAClick Chemistry Tools1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)Fisher ScientificBP153-500
Triton X 100Bio-Rad1610407
Tween 20Fisher ScientificBP337-100

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
  2. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  3. Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
  4. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
  6. Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
  7. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
  8. Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
  9. Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
  10. Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
  11. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  12. Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
  13. Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
  14. Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
  15. Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
  16. Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
  17. Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
  18. Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EdU proliferatieanalysedetectie via click chemiefluorescentie uitlezingluminescentie uitlezingplatelet derived growth factorfixatie met paraformaldehydepermeabilisatie met TX 100imaging plate readerhandmatige celtelling

Gerelateerde artikelen