Chloroplasten zijn de organellen die planten definiëren1. Naast vele andere metabole, ontwikkelings- en signaalfuncties zijn chloroplasten verantwoordelijk voor fotosynthese – het proces waarbij zonenergie wordt benut om de cellulaire activiteiten van het leven aan te drijven. Daarom zijn chloroplasten essentieel, niet alleen voor planten maar ook voor de talloze ecosystemen die afhankelijk zijn van planten, en voor de landbouw. Chloroplasten bestaan uit duizenden verschillende eiwitten, waarvan de meeste kerngecodeerd zijn en geïmporteerd vanuit het cytosol voordat ze intern naar een van de duidelijk onderscheiden intraorganellaire compartimentenworden geleid 1. Om een vollediger begrip te krijgen van de ontwikkeling en functies van chloroplasten, en om biotechnologische strategieën mogelijk te maken waarbij chloroplastmanipulatie wordt toegepast en wereldwijde uitdagingen rond voedselzekerheid of bio-energie wordt aangepakt, zal het essentieel zijn om de targeting, lokalisatie en interacties van belangrijke chloroplasteiwitten te bepalen. Deze methodenverzameling beschrijft een reeks kritisch belangrijke en complementaire technieken die gebruikt kunnen worden om deze doelen te bereiken. De collectie richt zich vooral op de veelgebruikte modelplant Arabidopsis thaliana (thale kers), maar de methoden kunnen ook worden aangepast en toegepast op andere organismen.
De collectie bevat beschrijvingen van twee verschillende technieken voor het analyseren van de import van nucleus-gecodeerde eiwitten in chloroplasten over de dubbelmembraanomhulsel. Het artikel van Ling en Jarvis2 beschrijft een in vitro-methode waarbij geïsoleerde chloroplasten worden geïncubeerd met een radioactief gelabeld precursoreiwit. De mate waarin de chloroplasten het precursoreiwit opnemen, wordt bepaald door het monitoren van de verandering in eiwitgrootte die optreedt als gevolg van het splitsen van transitpeptide (targeting leader sequence), met behulp van SDS-PAGE en fosforbeelding. De gepresenteerde methode is een ontwikkeling van een benadering die al decennialang in vitro chloroplasteiwitimport bestudeert 3,4, en bevat extra stappen die het mogelijk maken de responsiviteit van de importmachine te beoordelen op stressomstandigheden die de plantervaart 5. Aan de andere kant beschrijft het artikel van Lee et al.6 een in vivo methode gebaseerd op de tijdelijke expressie van een chimerisch voorlopereiwit, dat een fluorescerend eiwitdomein draagt, in intacte cellen (protoplasten). In deze assay kan de mate van chloroplasteiwitimport op twee verschillende manieren worden gevolgd: door de lokalisatie en intensiteit van het fluorescentiesignaal te monitoren met behulp van fluorescentiemicroscopie; en door de verandering in eiwitgrootte te analyseren die optreedt als gevolg van het splitsen van transitpeptiden met behulp van immunoblotting. Deze twee methoden zijn zeer complementair en kunnen overtuigende resultaten opleveren wanneer ze samen in parallel5 worden gebruikt.
Zodra een eiwit via de envelop in de chloroplast is geïmporteerd en het transitpeptide is verwijderd, kan het ofwel zijn definitieve conformatie krijgen in het stroma (het belangrijkste interne watercompartiment van het organel), of een van de verschillende interne sorteerroutesinschakelen 1. Als locatie van de zeer overvloedige fotosynthetische complexen zijn de thylakoïde membranen een belangrijke bestemming voor dergelijke interne sortering; In feite omvat het targeten van thylakoïde eiwitten meerdere, mechanistisch verschillende routes. Het artikel van Asher et al.7 beschrijft een reeks in vitro methoden die het mogelijk maken verschillende thylakoïde eiwittranslocatieroutes te bestuderen. Deze methoden omvatten de incubatie van geïsoleerde thylakoïden met radioactief gelabeld precursor-eiwit en in sommige gevallen een geconcentreerd stromaal extract. De mate waarin het eiwit door de thylakoïden wordt opgenomen, wordt gemonitord door het beoordelen van de splijting van het doelsignaal en de bescherming van het eiwit tegen exogeen aangebrachte thermolysineprotease, met behulp van SDS-PAGE en fosforbeelding. Natuurlijk zijn de thylakoïden niet het enige subcompartiment van de chloroplast, en het is vaak wenselijk om ook andere compartimenten te kunnen beoordelen. In dit opzicht is het artikel van Bouchnak et al.8 bijzonder belangrijk, omdat het methoden beschrijft voor de subfractie van chloroplasten om zeer zuivere monsters te produceren die overeenkomen met de membranen, het stroma en de thylakoïden. Eenmaal voorbereid kunnen deze fracties worden geanalyseerd met immunoblotting en/of massaspectrometrie, om zo een schat aan informatie te verkrijgen over de suborganellaire lokalisatie van chloroplasteiwitten9.
Met betrekking tot de analyse van eiwit-eiwitinteracties en multiproteïnecomplexassemblages worden in de verzameling twee verschillende methodologieën beschreven. Het artikel van Shanmugabalaji et al.10 presenteert een methode voor de affiniteitszuivering van chloroplast-multiproteïnecomplexen. Deze techniek omvat de analyse van transgene planten die een component van het complexe van belang uitdrukken die is ontworpen om een affiniteitstag te dragen (de zogenaamde tandem affiniteitszuiveringstag, of TAP-tag). Het vermogen van deze tag om sterk te binden aan een anders inerte matrix wordt benut als onderdeel van de zuiveringsstrategie. De gepresenteerde methode richt zich specifiek op de zuivering van de chloroplast-eiwitimportmachine (dit omvat multiproteïnecomplexen genaamd TOC en TIC die in de enveloppemembranen1 zijn ingebed), maar in principe kan het worden aangepast om andere multiproteïne-assemblages te bestuderen die in chloroplasten11 voorkomen. Het artikel van Rantala et al.12 beschrijft een complementaire benadering van complexe karakterisering gebaseerd op elektroforese onder inheemse omstandigheden. De techniek, zoals hier gepresenteerd, omvat het bevrijden van fotosynthetische complexen uit gezuiverde thylakoïden met behulp van mild, niet-ionisch detergent, gevolgd door hun scheiding met blue native (BN)-PAGE. Primaire resolutie van de complexen kan worden gevolgd door een tweede dimensie van elektroforese onder denatureringsomstandigheden, wat visualisatie van de individuele componenten van elk complex in de eerste dimensie mogelijk maakt. Net als bij de TAP-methode kan deze native PAGE-benadering met succes worden aangepast om andere eiwitcomplexen binnen het organel13,14 te bestuderen. Met beide benaderingen kunnen de gezuiverde complexen op verschillende manieren worden geanalyseerd, waaronder immunoblotting en massaspectrometrie.
Samen presenteren de artikelen in deze verzameling methoden een krachtige set complementaire technieken die, samen met bestaande bronnen 15,16, kunnen worden ingezet om ons begrip van diverse aspecten van chloroplastbiogenese en -functie aanzienlijk te verbeteren, met name die nauw verbonden met het organellaire proteoom. Omdat chloroplasten verantwoordelijk zijn voor het grootste deel van de terrestrische fotosynthetische primaire productie en bovendien vitale rollen spelen in de reacties van planten op het milieu (inclusief zowel biotische als abiotische stress), zullen deze opmerkelijke organellen onvermijdelijk jarenlang een belangrijk aandachtspunt blijven van fundamenteel en toegepast onderzoek wereldwijd.