In deze studie presenteren we een protocol voor cortisol extractie uit de Fin en kaakbeen van steursoorten. De cortisol spiegels van Fin en Jawbone werden verder onderzocht door twee wasoplosmiddelen te vergelijken, gevolgd door ELISA-assays. Deze studie bestuurde de haalbaarheid van Jawbone cortisol als een nieuwe stress-indicator.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cortisol extractie van Sturgeon Fin en Jawbone matrices
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De doelstellingen van deze studie waren het ontwikkelen van een techniek voor de extractie van cortisol uit Sturgeon vinnen met behulp van twee afwasmiddelen (water en isopropanol) en kwantificeren eventuele verschillen in fin cortisol niveaus tussen drie belangrijkste steursoorten. Vinnen werden geoogst uit 19 opgeofferde Sturgeons waaronder zeven Beluga (Huso huso), zeven Siberische (Acipenser baerii), en vijf sevruga (a. stellatus). De Sturgeons werden opgevoed in Iraanse boerderijen voor 2 jaar (2017-2018), en cortisol extractie analyse werd uitgevoerd in Zuid-Korea (januari-februari 2019). JAWBONES van vijf H. Huso werden ook gebruikt voor cortisol extractie. Gegevens zijn geanalyseerd met behulp van de algemene lineaire model (GLM)-procedure in de SAS-omgeving. De intra-en inter-assay coëfficiënten van variatie waren respectievelijk 14,15 en 7,70. Kort, de cortisol extractietechniek betrokken wassen van de monsters (300 ± 10 mg) met 3 mL oplosmiddel (ultrapuur water en isopropanol) tweemaal, rotatie bij 80 rpm voor 2,5 min, lucht drogen de gewassen monsters bij kamertemperatuur (22-28 °C) gedurende 7 dagen, verder drogen de monsters met een kraal klopper bij 50 Hz gedurende 32 min en malen ze in poedervorm, waarbij 1,5 mL methanol wordt toegepast op het gedroogde poeder (75 ± 5 mg) en langzame rotatie (40 rpm) gedurende 18 uur bij kamertemperatuur met Continu mengen. Na extractie werden monsters gecentrifugeerd (9.500 x g gedurende 10 min) en 1 ml supernatant werd overgebracht naar een nieuwe microcentrifuge buis (1,5 ml), geïnineerd bij 38 °c om de methanol te verdampen en geanalyseerd via enzym-gebonden immunosorptie test (Elisa) . Er werden geen verschillen waargenomen in fin cortisol niveaus tussen soorten of in Fin en Jawbone cortisol niveaus tussen wasmiddelen. De resultaten van deze studie tonen aan dat de Sturgeon Jawbone matrix een veelbelovende alternatieve stress indicator is voor solide matrices.
Inleiding
Cortisol is een betrouwbare indicator van dierlijke stress. Cortisol extractie biedt een geldig kader voor onderzoekers om te controleren van stress niveaus en algemene patronen in stressoren. Bijvoorbeeld, eerdere studies hebben methodologische validatie van haar cortisol metingen uitgevoerd met behulp van verschillende methoden bij de mens1,2, apen3,4, vee5, schapen6, en goudvis7,8. Bij vissoorten is aangetoond dat cortisol metingen in matrices zoals schubben, huid slijm, ontlasting en bloed9 informatie geven over de gezondheid van de vissen. Wanneer bloedafname problematisch is of weegschalen ontbreken, zijn alternatieve matrices voor cortisol extractie nodig. In vissen, alternatieve matrices kan de Kaakbeen bevatten, een harde weefsel vergelijkbaar met de menselijke tand10.
De ontwikkeling van nieuwe matrices en gevalideerde technieken om de stress niveaus van vissen te bepalen, is van bijzonder belang voor de kaviaar industrie, waar Sturgeon langdurige blootstelling aan omgevingsstress factoren11kan ervaren. Het geslacht van steur kan niet worden bepaald voor de leeftijd van 2 jaar en Steur heeft geen weegschaal. Omdat cortisol zich geleidelijk ophoveert in solide matrices tijdens de groeifase2,7,12, op lange termijn cortisol accumulatie gegevens van harde matrices zoals vinnen en kaak beenderen kunnen geven inzicht in stress niveaus in verschillende groeistadia. In tegenstelling, bloed cortisol niveaus bieden een momentopname van stress niveaus op het moment van de dood en kan niet nauwkeurig vertegenwoordigen stress tijdens de lange termijn fokken voorwaarden13,14. Met toenemende concurrentie op de kaviaar markt zijn nieuwe benaderingen ter verbetering van de stress voorwaarden voor de productie van gezondere eieren onder steursoorten tijdens langdurig fokken (8-12 jaar of langer) een steeds belangrijker onderzoeksgebied. Vanwege de hoge kosten van steur, geoogste monsters zijn zeer kostbaar ($ 8000-15000 per volwassen vis afhankelijk van de soorten en groeistadium), een beperkende factor voor onderzoeksprojecten. De ontwikkeling van een geschikte techniek voor cortisol extractie van steur vinnen en kaak beenderen zou echter nuttig kunnen worden toegepast zowel op viskwekerijen als in wilde vis om de kwaliteit en de oogst van steur eieren te verbeteren voor zowel consumptie-als Instandhouding.
Naast het verstrekken van betrouwbare resultaten6, is de selectie van een geschikte cortisol extractietechniek van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat andere verbindingen die in de matrix aanwezig zijn tijdens de monstervoorbereiding, de output niet verloochend, wat kan leiden tot inconsistente resultaten. Het is even belangrijk om te bepalen of fin en Jawbone cortisol niveaus worden beïnvloed door hormoonspiegels in het omringende water. Heimbürge et al.15 suggereerde dat een aantal factoren cortisol niveaus kan beïnvloeden, waaronder leeftijd, geslacht, zwangerschap, seizoen, kleur12, en lichaams regio waaruit cortisol wordt geëxtraheerd16. Echter, weinig informatie is beschikbaar over de effecten van het wassen van oplosmiddelen op cortisol extractie in vis lichaam matrices8, en geen op deze effecten in Sturgeon, met uitzondering van steur eieren17.
Hoewel het analyseren van Baseline cortisol niveaus van de vinnen en kaak beenderen van Sturgeon vereist dat de vissen worden geëeuthaniliseerd, brengt deze aanpak niet de invasieve technieken met zich mee die nodig zijn voor bloed bemonstering in levende Steur. Fin en Jawbone monsters zijn gemakkelijk verzameld, en extractie uit deze weefsels kan snel worden uitgevoerd. Evenzo, hormoon extractie en analyse zijn eenvoudig en vereisen weinig gespecialiseerde apparatuur.
In deze studie presenteren we een nieuwe en gemakkelijk toegepaste techniek voor de extractie, het wassen en de bepaling van cortisol uit visvinnen en kaak beenderen, met als doel te bepalen of de cortisol spiegels gemeten vanuit deze matrices betrouwbaar kunnen worden gebruikt als stress Indicatoren. De voordelen van deze techniek zijn een eenvoudige en niet-invasieve8 -benadering, minder data variatie en betrouwbare output1,6,8,17; de techniek is van toepassing op vissoorten zonder schubben zoals Steur. De techniek vereist het slachten van de vis, de selectie van geschikte wasmiddelen2,4, het correct slijpen van monsters3,5, professionele immuunsorptie test (Elisa) toepassing5,7, en uitgebreide kennis van de opneming van cortisol bronnen in vaste matrices6.
We hebben twee verschillende reinigingsmiddelen (ultrapuur water en isopropanol) toegepast om basale cortisol niveaus te verkrijgen in vinnen van drie steursoorten: Beluga (Huso huso), Siberische (Acipenser baerii), en sevruga (a. stellatus ), onder de normale milieuomstandigheden voor elke soort. JAWBONES van H. Huso werden ook gebruikt om stress in Sturgeon te evalueren. Dit is de eerste studie voor het meten van cortisol niveaus in Sturgeon JAWBONES. De resultaten van deze studie zullen vergelijkende cortisol gegevens verstrekken voor steursoorten in de vroege groeifase (~ 1 jaar) voorafgaand aan Geslachtsbepaling.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De volgende experimentele procedures en methoden werden goedgekeurd door de dierenwelzijns-en ethische autoriteit van de Kangwon National University, Chuncheon, Republiek Korea.
1. fin collectie
- Leg de steur voorzichtig vast met behulp van een net om letsel en stress te minimaliseren.
- Spoel de vis voorzichtig met vers water en veeg het lichaamsoppervlak af met een absorberend doekje voorafgaand aan euthanasie.
- Raak het hoofd van de vis met behulp van een plastic hamer zodanig dat de vis is verdoofd of verliest bewustzijn. Verwijder de kop met een mes.
- Meet het lichaamsgewicht (g) en de lengte (cm).
- Verzamel na euthanasie fin-monsters door zo dicht mogelijk bij het lichaam te snijden met gesteriliseerde chirurgische schaar.
Opmerking: voor elke vis moeten individuele, niet-gerecycleerde, absorberende handdoeken worden gebruikt. Beschrijvende statistieken voor de in deze studie gebruikte soorten waren als volgt: Beluga Sturgeon (H. Huso): leeftijd = 18 ± 2,1 maanden, lichaamsgewicht = 2.700 ± 300 g, en lichaamslengte = 55 ± 5 cm; Siberische steur (A. baerii): leeftijd = 9,6 ± 2,4 maanden, lichaamsgewicht = 1.750 ± 250 g, en lichaamslengte = 45 ± 5 cm; sevruga Sturgeon (a. stellatus): leeftijd = 14 ± 1,3 maanden, lichaamsgewicht = 1.000 ± 100 g, en lichaamslengte = 65 ± 5 cm.
2. fin voorbereiding voor cortisol extractie
- Plaats de vinnen monsters (één monster per weefsel: ~ 3 g) op laboratorium weegpapier (107 mm × 210 mm) en droog bij kamertemperatuur gedurende een paar dagen tot het droog is.
- Wikkel monsters in vellen aluminiumfolie, plaats in gelabelde plastic zakken en breng over naar het laboratorium.
- Bewaar monsters in een koelkast voor verder gebruik, waaronder wassen, cortisol extractie, drogen en ELISA-analyse (Figuur 2).
3. fin cortisol analyse
- Kalibreer de digitale analytische Weegschaal (nauwkeurigheid: 0,0001) en weeg 300 ± 10 mg samples af met weegpapier op de schaal pan.
- Was de monsters.
- Breng elk monster over in een conische polypropyleen buis van 15 liter. Voeg aan elke buis 3 mL isopropanol toe met een éénkanaals Pipet van 5.000 μL.
- Draai de buizen bij 80 rpm gedurende 2,5 min om cortisol uit te spoelen en eventuele externe verontreinigingen te verwijderen. Herhaal deze procedure tweemaal.
- Lucht-droog de gewassen monsters bij kamertemperatuur (22-28 °C) gedurende 7 dagen.
- Herhaal de wasprocedure met ultrapuur water als wasmiddel.
- Extract de Kaakbeen uit het lichaamsweefsel met behulp van bot-snijden Tang. Breng stappen 1.5-3.2.4 aan op de Jawbone monsters.
- Weeg (75 ± 5 mg) gedroogde vinnen of Jawbone monsters en grind met behulp van een kraal klopper bij 50 Hz voor 32 min.
- Lever 1,5 mL methanol in elke buis met poedervormige Vin of Jawbone met een pipet van 1000 μL. Plaats de monsters op een buis Rotator bij langzame rotatie (40 rpm) voor 18 uur bij kamertemperatuur om cortisol te extraheren met Continu mengen.
- Na cortisol extractie, centrifugeer de monsters bij 9.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel na centrifugeren de bovenste organische laag die cortisol (1 mL) bevat uit elk monster en plaats deze in een aparte micro centrifugebuis van 1,5 mL.
- Droog de monsters door incubatie bij 38 °C om de methanol te verdampen. Houd de geëxtraheerde cortisol monsters 's nachts onder een rook afzuigkap om methanol te laten verdrijven.
Opmerking: de cortisol-bevattende laag is meestal geelachtig van kleur.
- Droog de monsters door incubatie bij 38 °C om de methanol te verdampen. Houd de geëxtraheerde cortisol monsters 's nachts onder een rook afzuigkap om methanol te laten verdrijven.
4. fin cortisol detectie
- De gedroogde vinnen of Jawbone monsters ontdooien bij kamertemperatuur voor 1,5 uur voorafgaand aan het gebruik van de ELISA-kit.
- Voeg gedurende 15 minuten 400 μL fosfaatbuffer, Vortex en centrifuge toe bij 1.500 x g .
- Voer elk monster (25 μL) in tweevoud uit om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de assay te verbeteren. Verwijder alle gegevens buiten de standaard curve als uitschieters.
- Stel een microplaat lezer in op 450 nm, stel vervolgens in op μg dL-1 en lees de extinctie van de plaat.
- Gebruik de microplaat-software met een vier-parameter niet-lineaire regressie curve pasvorm. Converteren van de cortisol niveaus van de monsters verkregen uit de software in PG mg-1 met behulp van de volgende vergelijking:
F = 10.000 E (A/B) (C/D),
waarbij F = de eindwaarde van het fin cortisolgehalte in (PG mg-1), E = het volume (ml) van de test buffer dat wordt gebruikt om het gedroogde extract te reconstitueren, A = de concentratie (μg DL-1) die door de test uitgang wordt geleverd, B = het gewicht (mg) van de vin die aan extra C = het volume (mL) methanol dat aan de gepoederde Vin is toegevoegd, en D = het volume (mL) methanol dat uit het extract is teruggewonnen en vervolgens3is gedroogd.
- Gebruik de microplaat-software met een vier-parameter niet-lineaire regressie curve pasvorm. Converteren van de cortisol niveaus van de monsters verkregen uit de software in PG mg-1 met behulp van de volgende vergelijking:
5. statistische analyse
- Verdeel elk monster vóór de wasprocedure in twee submonsters en voer vervolgens in tweevoud tijdens de ELISA-testtest (2 × 2 = 4 observaties per monster) om de kracht van de test en de betrouwbaarheid van de resultaten te verbeteren.
- Vergelijk de effecten van de twee wasmiddelen en hun interacties door de procedure van het algemene lineaire model (GLM) in de SAS-Softwareomgeving toe te passen op de meetgegevens18.
- Test verschillen tussen middelen met behulp van de test van Tukey op een significantieniveau van p < 0,05. Accepteer 0,05 < p < 0,10 als bewijs van een tendens in plaats van als een significant verschil.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gepresenteerde fin cortisol extractietechniek werd ontwikkeld en bevestigd in deze studie met behulp van drie steursoorten. Cortisol niveaus verkregen met behulp van ultrapuur water en isopropanol als wasoplosmiddelen werden vergeleken (Figuur 2). Cortisol van H. Huso twee werd onderzocht om te bepalen of Sturgeon twee gebruikt zouden kunnen worden als een alternatieve matrix voor vinnen. De effecten van het wassen van oplosmiddel, steursoorten en...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Sturgeon wordt ook wel een "levend fossiel" genoemd omdat het in de afgelopen millennia weinig aanpassingen heeft vertoond. Het steur geslacht Acipenser bevat 27 soorten die kaviaar produceren; echter, drie soorten (Beluga, baerii en sevruga) produceren de meeste van de wereldwijde kaviaar levering. Sturgeon zijn kwetsbaar voor overbevissing en interferentie in hun natuurlijke habitat en zijn daarom meer bedreigd dan welke andere groep soorten dan ook. Sturgeon behoort tot de oudste groep levende gewervelde dier...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd uitgevoerd met de steun van het coöperatieve onderzoeksprogramma voor de landbouwwetenschappen & technologie ontwikkeling (projecttitel: Veeproductiviteitsveranderings analyse met klimaatverandering, Projectnr. PJ012771), beheer van plattelandsontwikkeling, Republiek Korea. Ook werd deze studie ondersteund door een subsidie (No. PJ01344604) van het diervoeding & Fysiologie team, National Institute of Animal Science, RDA, Seoul, Republiek Korea. De auteurs erkennen dankbaar de Perzische gebaar CEO Mohammad Hassan Salmanzadeh en zijn team, die vis van de drie steursoorten die in deze studie werden onderzocht.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
Referenties
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882(2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240(2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411(2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
