Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol om een gen knock-out in de extracellulaire amastigote van Trypanosoma cruzi te introduceren, met behulp van het crispr/Cas9-systeem. De groei fenotype kan worden opgevolgd door de celtelling van de Axenische amastigote cultuur of door proliferatie van intracellulaire amastigotes na de invasie van de cel van de host.

Samenvatting

Trypanosoma cruzi is een pathogene protozoeen parasiet die de ziekte van Chagas voornamelijk in Latijns-Amerika veroorzaakt. Om een nieuwe drug target tegen T. cruzite identificeren, is het belangrijk om de essentialiteit van het doel gen in de zoogdier fase van de parasiet, de amastigote, te valideren. Amastigotes van T. cruzi repliceren in de host-cel; het is dus moeilijk om een knock-out experiment uit te voeren zonder door andere ontwikkelingsstadia te gaan. Onlangs rapporteerde onze groep een groei voorwaarde waarin de amastigote axenisch tot 10 dagen kan repliceren zonder zijn amastigote-achtige eigenschappen te verliezen. Door deze temporale Axenische amastigote cultuur te gebruiken, introduceerden we met succes Grna's rechtstreeks in het Cas9-uitdrukken van amastigote om genknockouts te veroorzaken en hun fenotypes uitsluitend in de amastigote fase te analyseren. In dit rapport beschrijven we een gedetailleerd protocol om in vitro afgeleide extracellulaire amastigotes te produceren en om de Axenische-cultuur te gebruiken in een CRISPR/Cas9-gemedieerd knock-outexperiment. De groei fenotype van uitblust amastigotes kan worden geëvalueerd hetzij door celtellingen van de Axenische-cultuur, of door replicatie van intracellulaire amastigote na de invasie van de cel van de host. Deze methode omzeilt de parasiet stage differentiatie normaal betrokken bij het produceren van een transgene of een knock-out amastigote. Het gebruik van de temporale Axenische amastigote cultuur heeft het potentieel om de experimentele vrijheid van stage-specifieke studies in T. cruzi uit te breiden.

Inleiding

Trypanosoma cruzi is de veroorzaker van de ziekte van Chagas, die overwegend in Latijns-Amerika¹voorkomt. T. cruzi heeft kenmerkende levenscyclus stadia tussen een insecten vector en een zoogdier gastheer². T. cruzi repliceert als een epimastigote in de hepatopancreas van een bloedzuigende triatomine bug en onderscheidt zich in een infectieuze metacyclische trypomastigote in zijn achterhand voordat het wordt afgezet op een menselijke of dierlijke gastheer. Zodra de trypomastigote door de bijt plaats of door een slijmvlies in het gastlichaam komt, valt de parasiet in een holecel en transformeert....

Protocol

Opmerking: Een overzicht van de gehele experimentele stroming wordt afgebeeld in Figuur 1.

Afbeelding 1: overzicht van het knock-outexperiment met EA. Weefselkweek-afgeleide trypomastigoten worden geoogst en gedifferentieerd in EA. grna wordt omgezet in Cas9-uitdrukken van amastigotes door middel van elektroporation, en groei fenotype van de knockout amastigote wordt geëvalueerd hetzij door Axenische replicatie of door intracel....

Resultaten

Isolatie van trypomastigoten door de Swim-out procedure

Om verse trypomastigoten te oogsten van contaminerende oude ea's door Swim-out procedure, moeten celpellets ten minste voor 1 h worden geïnineerd. incuberen van de pellets voor meer dan 2 h niet significant verhogen het aantal trypomastigoten zwemmen in de oplossing ( Figuur 2b). In dit specifieke experiment was het percentage trypomastigote in het oorspronkelijke mengsel 38%, en het percenta.......

Discussie

We hebben aangetoond dat de Axenische-cultuur van T. cruzi amastigotes kan worden gebruikt in crispr/Cas9-gemedieerde Gene Knockout, door grna rechtstreeks te elektroporeren in Cas9-UITDRUKKEN van EA. Op deze manier kan de essentialiteit van het doel gen specifiek in amastigote stadium worden geëvalueerd zonder door andere ontwikkelingsstadia te gaan.

Een ander gunstig aspect van amastigote transfectie is het gemak bij het testen van een groot aantal doel genen. Zodra de co-cultuur va.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
20% formaline oplossing	FUJIFILM Wako Pure Chemical	068-03863	fixatie van cellen
25 cm2 dubbele afdichtingsdop kweekkolf	AGC Techno Glass	3100-025
75 cm2 dubbele afdichtingsdop kweekkolf	AGC Techno Glass	3110-075
All-in One Fluorescerend Microscoop	Keyence	BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (voor Controle)	IDT	op maat gemaakt	doelsequentie = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (voor TcCGM1)	IDT	op maat gemaakt	doelsequentie = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (voor TcPAR1)	IDT	op maat gemaakt	doelsequentie = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA	IDT	1072532	om te annealeren met crRNA
Amaxa Nucleofector apparaat	LONZA	AAN-1001	elektroporatie
Basic Parasite Nucleofector Kit 2	LONZA	VMI-1021	elektroporatie
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	component van het medium voor in vitro amastigogenese
Burker-Turk wegwerp hemocytometers	Watson	177-212C	celtelling
Coster 12-wells Clear TC-Behandelde Meerdere Well Platen	Corning	3513
DMEM	FUJIFILM Wako Pure Chemical	044-29765	kweekmedium
Fetaal bovien serum, Gedefinieerd	Hyclone	SH30070.03	voor gebruik verwarmen om inactief te maken
G-418 Sulfaat Oplossing	FUJIFILM Wako Pure Chemical	077-06433	selectie van transformant
Hemine chloride	Sigma-Aldrich	H-5533	component van LIT medium
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	kleuring van kernen
Liver infusie bouillon, Difco	Becton Dickinson	226920	component van LIT medium
MES	FUJIFILM Wako Pure Chemical	349-01623	component van het medium voor in vitro amastigogenese
PBS (–)	FUJIFILM Wako Pure Chemical	166-23555
Propidium Jodide	Sigma-Aldrich	P4864-10ML	kleuring van dode cellen
RPMI 1646	Sigma-Aldrich	R8758	medium voor metacyclogenesis