Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59962

⸱

31 juli 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol om een gen knock-out in de extracellulaire amastigote van Trypanosoma cruzi te introduceren, met behulp van het crispr/Cas9-systeem. De groei fenotype kan worden opgevolgd door de celtelling van de Axenische amastigote cultuur of door proliferatie van intracellulaire amastigotes na de invasie van de cel van de host.

Samenvatting

Trypanosoma cruzi is een pathogene protozoeen parasiet die de ziekte van Chagas voornamelijk in Latijns-Amerika veroorzaakt. Om een nieuwe drug target tegen T. cruzite identificeren, is het belangrijk om de essentialiteit van het doel gen in de zoogdier fase van de parasiet, de amastigote, te valideren. Amastigotes van T. cruzi repliceren in de host-cel; het is dus moeilijk om een knock-out experiment uit te voeren zonder door andere ontwikkelingsstadia te gaan. Onlangs rapporteerde onze groep een groei voorwaarde waarin de amastigote axenisch tot 10 dagen kan repliceren zonder zijn amastigote-achtige eigenschappen te verliezen. Door deze temporale Axenische amastigote cultuur te gebruiken, introduceerden we met succes Grna's rechtstreeks in het Cas9-uitdrukken van amastigote om genknockouts te veroorzaken en hun fenotypes uitsluitend in de amastigote fase te analyseren. In dit rapport beschrijven we een gedetailleerd protocol om in vitro afgeleide extracellulaire amastigotes te produceren en om de Axenische-cultuur te gebruiken in een CRISPR/Cas9-gemedieerd knock-outexperiment. De groei fenotype van uitblust amastigotes kan worden geëvalueerd hetzij door celtellingen van de Axenische-cultuur, of door replicatie van intracellulaire amastigote na de invasie van de cel van de host. Deze methode omzeilt de parasiet stage differentiatie normaal betrokken bij het produceren van een transgene of een knock-out amastigote. Het gebruik van de temporale Axenische amastigote cultuur heeft het potentieel om de experimentele vrijheid van stage-specifieke studies in T. cruzi uit te breiden.

Inleiding

Trypanosoma cruzi is de veroorzaker van de ziekte van Chagas, die overwegend in Latijns-Amerika1voorkomt. T. cruzi heeft kenmerkende levenscyclus stadia tussen een insecten vector en een zoogdier gastheer2. T. cruzi repliceert als een epimastigote in de hepatopancreas van een bloedzuigende triatomine bug en onderscheidt zich in een infectieuze metacyclische trypomastigote in zijn achterhand voordat het wordt afgezet op een menselijke of dierlijke gastheer. Zodra de trypomastigote door de bijt plaats of door een slijmvlies in het gastlichaam komt, valt de parasiet in een holecel en transformeert in een flagella-loze ronde vorm genaamd een amastigote. De amastigote repliceert binnen de ontvangende cel en maakt uiteindelijk onderscheid in trypomastigote, die uit de ontvangende cel uitbarst en de bloedstroom binnenkomt om een andere hostcel te infecteren.

Aangezien momenteel beschikbare chemotherapeutische middelen, benznidazol en Nifurtimox, nadelige bijwerkingen veroorzaken en niet effectief in de chronische fase van de ziekte3, het is van groot belang om te identificeren van de nieuwe drug doelen tegen T. cruzi. In de afgelopen jaren is het CRISPR/Cas9 systeem uitgegroeid tot een krachtig instrument om genen knock-out effectief uit te voeren in T. cruzi, hetzij door transfectie van afzonderlijke of enkelvoudige plasmide (s) die Grna en Cas94bevatten, door stabiele expressie van Cas9 en daaropvolgende introductie van grna5,6,7 of transcriptie sjabloon van grna8, of door elektroporation van het voorgevormde grna/Cas9 RNP complex7,9. Deze technologische vooruitgang is zeer verwacht te versnellen van de drug target onderzoek in de ziekte van Chagas.

Om verder te gaan met de ontwikkeling van geneesmiddelen, is het cruciaal om de essentialiteit van het doel gen of de werkzaamheid van kandidaatstoffen in de amastigote van T. cruzite valideren, omdat het de replicatie fase van de parasiet is in de zoogdier gastheer. Echter, dit is een uitdagende taak, omdat amastigotes kan niet rechtstreeks worden gemanipuleerd als gevolg van de aanwezigheid van een obstructieve host-cel. In Leishmania, een nauw verwante protozoa parasiet tot T. cruzi, een Axenische amastigote kweekmethode werd ontwikkeld en is gebruikt in drug screening testen10,11,12, 13. Hoewel er enkele discrepanties in gevoeligheid voor verbindingen tussen Axenische amastigotes en intracellulaire amastigotes14, het vermogen om de Axenische cultuur te handhaven niettemin biedt waardevolle experimentele instrumenten om te bestuderen van de basis biologie van de klinisch relevante fase van Leishmania15,16. In het geval van T. cruzi, literaturen met betrekking tot de aanwezigheid van natuurlijk voorkomende extracellulaire amastigotes (EA)17 en in vitro productie van EA17,18,19 dateren uit decennia geleden. Daarnaast is het bekend dat EA een besmettelijke capaciteit heeft20, zij het minder dan die van trypomastigote, en het mechanisme van amastigote gastheer invasie is in de afgelopen jaren opgehelderd (beoordeeld door Bonfim-Melo et al.21). Echter, in tegenstelling tot Leishmania, was EA niet gebruikt als een experimenteel hulpmiddel in T. cruzi, vooral omdat EA werd beschouwd als een verplicht intracellulaire parasiet, en dus niet werd beschouwd als "replicatieve vorm" in een praktische Zin.

Onlangs heeft onze fractie voorgesteld om EA van T. cruzi te gebruiken als een temporale Axenische-cultuur22. Amastigotes van T. cruzi tulahuen stam kan repliceren vrij van gastheer cellen in verlicht medium bij 37 ° c voor maximaal 10 dagen zonder ernstige verslechtering of verlies van amastigote-achtige eigenschappen. Tijdens de host-vrije groeiperiode werd EA met succes gebruikt voor exogene genexpressie door conventionele elektroporation, drug titratie assay met trypanocidale verbindingen, en CRISPR/Cas9-gemedieerde Knockout, gevolgd door groei fenotype monitoring. In dit rapport beschrijven we het gedetailleerde protocol om in vitro afgeleide EA te produceren en om de Axenische amastigote in Knockout-experimenten te gebruiken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Een overzicht van de gehele experimentele stroming wordt afgebeeld in Figuur 1.

figure-protocol-1
Afbeelding 1: overzicht van het knock-outexperiment met EA. Weefselkweek-afgeleide trypomastigoten worden geoogst en gedifferentieerd in EA. grna wordt omgezet in Cas9-uitdrukken van amastigotes door middel van elektroporation, en groei fenotype van de knockout amastigote wordt geëvalueerd hetzij door Axenische replicatie of door intracellulaire replicatie na invasie van host-cel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

1. preparaten voor de parasiet cultuur

  1. Tulahuen-stam van Trypanosoma cruzi wordt in dit verslag gebruikt. Handhaaf epimastigotes van T. cruzi in verlicht medium (10% FCS, Zie aanvullende tabel 1). Sluit de dop stevig en bewaar de kweek kolf op 28 °C.
  2. Genereer een transgene stam van T. cruzi die de Cas9 endonuclease herbergt. Voorbeelden van de expressie plasmiden die Cas9 Codeer volgorde en G418 (neor) selectie marker bevatten, kunnen gevonden worden in Lander et al.4 en Peng et al.5
    1. Transfect het bovenstaande plasmide in epimastigote door elektroporation, met behulp van de kit vermeld in de tabel van de materialen. Voor 1 cuvette, spin 2 x 107 cellen, gooi de supernatant, en respenderen met 100 μL van electroporatie buffer met de meegeleverde supplement oplossing.
      Opmerking: De electroporatie buffer kan worden vervangen door em buffer24 (3:1 mengsel van cytomix25 en fosfaat-sucrose buffer).
    2. Voeg 20-40 μg plasmide toe en breng het mengsel over in een 2 mm spleet elektroporation kuvette. Breng de puls aan met een elektroporation apparaat (Zie tabel met materialen) met behulp van het X-14 programma26.
    3. Breng de inhoud van de Cuvette in een T-25-kolf met 5 mL verlicht medium (10% FCS). Incuberen de kolf bij 28 °C gedurende 24 uur.
    4. Voeg G418 toe aan een eindconcentratie van 250 μg/mL en ga verder met incubatie bij 28 °C. Het duurt ongeveer 1 week om de niet-getransfunde epimastigotes te doden. Zodra de G418-resistente populatie begint te herstellen, doorgang van de cultuur een of twee keer per week om verzadiging te voorkomen en de dode cellen te verdunnen. Het opzetten van een stabiele cellijn duurt meestal in totaal 4 weken.
      Opmerking: Indien de constitutieve uitdrukking van Cas9 een last is voor de cel5, maak dan de uitdrukking specifiek voor de amastigote fase door de 3 '-UTR van het amastin gen onmiddellijk stroomafwaarts van de Cas9 open reading frame27te vervoegen. De gedetailleerde beschrijving van de amastigote-specifieke Cas9 expressie plasmide kan worden gevonden in Takagi et al.22
  3. Stel een gastheer-parasiet co-cultuur van Cas9-uitdrukken T. cruzi en zoogdieren gastheer cellen. Gebruik in dit rapport 3T3-Swiss albino fibroblast Cell als gastheer.
    1. Differentieer T. cruzi epimastigotes in metacyclische trypomastigotes. Bepaal de celdichtheid van de epimastigote cultuur met behulp van een hemocytometer en verzamel 5 x 107 cellen door centrifugeren gedurende 15 minuten bij 2.100 x g. Gooi de supernatant weg en regeer de cellen met 10 mL RPMI-medium. Incuberen de parasiet bij 28 °C gedurende 1 week28.
    2. Verzamel metacyclische trypomastigoten in rpmi-medium. Kantel de kolf voorzichtig en Pipet de oplossing uit zonder de parasieten te storen die aan het bodemoppervlak zijn gehecht. Breng het medium over naar een conische buis en centrifugeer 15 minuten bij 2.100 x g. Gooi het supernatant weg en regeer de parasiet met 5 mL DMEM (10% FCS).
      Opmerking: De parasiet populatie is een mengsel van metacyclische trypomastigotes, epimastigotes, en sommige tussenliggende vormen. Hoewel het niet nodig is, u trypomastigote isoleren door DEAE ionenwisselingschromatografie29. Als alternatief kunnen epimastigotes worden geëlimineerd door de parasieten met een actief serum te bebroed om ze te onderwerpen aan lysis30.
    3. Zaad 3T3-Zwitserse albino fibroblast cel tot 60-70% confluency, of ongeveer 1,7-2,0 x 106 cellen in 5 ml DMEM (10% FCS) in de T-25 cultuur kolf. Verwijder het groeimedium en breng de parasiet mengsel van stap 1.3.2. Incuberen gedurende 24 uur bij 37 °C onder 5% CO2 in een bevoficeerde incubator om een infectie op te zetten.
    4. Verwijder de parasieten die buiten de host 3T3 cellen blijven door twee keer de co-cultuur te wassen met DMEM (10% FCS).
    5. Zodra de co-cultuur verzadigd is, passage amastigote-geïnfecteerde gastheer cellen door trypsinisatie. Aspireren het medium en spoel de cultuur één keer met PBS. Breng 1 mL van 0,05% trypsine-oplossing aan om het hele cultuur oppervlak te bedekken en inbroed enkele minuten bij kamertemperatuur totdat de bijgevoegde hostcellen losraken. Maak de cellen los van het oppervlak van de kolf door 3 mL DMEM (10% FCS) over de cellen te spoelen.
    6. Breng losgekoppelde hostcellen over in een conische buis en Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 x g. Zuig de supernatant op en hervat de cellen met 3 mL verse DMEM (10% FCS). Deze stap helpt om resterende epimastigotes te elimineren. Breng alles over in een schone T-75 kolf met 9 mL DMEM (10% FCS). Ga verder met kweken totdat trypomastigote wordt vrijgelaten in de cultuur supernatant.
    7. Behoud de co-cultuur door twee keer per week trypsinisatie te door te voeren. Zodra 70-80% van de ontvangende populatie besmet raken, Voeg regelmatig niet-geïnfecteerde host 3T3 cellen toe aan de ratio van 5:1 (carryover: Fresh), om verslechtering van de cultuur te voorkomen. Trypomastigote egresses continu als de balans tussen de gastheer cellen en T. cruzi correct wordt gehandhaafd.

2. differentiatie van Trypomastigotes in EA

  1. Op de dag voor dit experiment, verwijder het groeimedium van gastheer-parasiet co-cultuur en voeg verse DMEM (10% FCS) om weg te spoelen EA en trypomastigoten die al waren vrijgelaten uit de gastheer cellen in voorgaande dagen. Voor regelmatige experimenten zijn ten minste twee T-75 kolven van de confluente co-cultuur nodig.
  2. Verzamel cultuur supernatant in een conische buis om vers opgedoken trypomastigotes te oogsten. Controleer het monster onder een microscoop (10x of 20x objectief objectief) voor de kwaliteit. Als er vuil van de gastheer is, Centrifugeer het monster kort en breng het supernatant over in een nieuwe buis. Als er een significant aantal ea's, isoleren trypomastigoten door de volgende Swim-out procedure.
    1. Spin het mengsel van trypomastigoten en amastigotes gedurende 15 minuten bij 2.100 x g. Gooi het grootste deel van het supernatant weg en laat 0,5-1,0 mL medium in de buis.
      Opmerking: het volume verminderen is optioneel, maar het maakt de volgende stap gemakkelijker.
    2. Inbroed de pellet bij 37 ° c voor 1-2 h, waardoor actieve trypomastigoten uit de pellet kunnen zwemmen (Figuur 2).
    3. Breng het supernatant met trypomastigoten over in een micro centrifugebuis van 1,5 ml.
  3. Centrifugeer de conische buis gedurende 15 minuten bij 2.100 x g om trypomastigotes te verzamelen. Als de zwemout-procedure hierboven werd uitgevoerd, centrifugeer de buis van 1,5 mL gedurende 2 minuten bij 4.000 x g tot pellet de trypomastigote. Gooi het supernatant weg.
  4. Respendeer de pellet met 5 mL DMEM gebufferd met 20 mM MES (pH 5,0), aangevuld met 0,4% BSA19. Breng de parasiet over in een T-25-kweek kolf. Laat de dop los. De celdichtheid moet rond of onder 1 x 107 cellen/ml liggen, aangezien oververzadiging de kans op celdood verhoogt.
    Opmerking: De kleur van de DMEM moet geel zijn, niet oranje. Als de oorspronkelijke DMEM een hoge buffercapaciteit had, is 20 mM MES (pH 5,0) niet voldoende om de pH te verlagen. De pH van het medium moet in dat geval worden aangepast door toevoeging van HCl. Het zure medium kan worden bewaard bij 4 °C, maar niet langer dan 1 maand.
  5. Incuberen de kweek kolf bij 37 °C onder 5% CO2 in een bevoficeerde incubator. Rond 95% van de parasieten differentiëren in amastigotes na 24 uur.

3. elektroporation van EA

  1. Bereid gRNA voor elektroporation. Dit kan worden gedaan door in vitro transcriptie, of gewoon door de aankoop van synthetische RNA oligonucleotiden van een fabrikant. In dit rapport worden crRNA en tracrRNA van Integrated DNA Technologies, Inc. gebruikt.
  2. Centrifuge de cultuur van EAs gedurende 15 minuten bij 2.100 x g. Gooi supernatant weg.
  3. Respendeer de pellet met electroporatie buffer met de meegeleverde supplement oplossing voor de uiteindelijke celdichtheid van 1 x 108 cellen/ml.
    Opmerking: em-buffer veroorzaakt meer celsterf gevallen in vergelijking met de electroporatie buffer in de lijst van materialen; Dus, het is niet aanbevolen voor amastigote transfectie (aanvullend figuur 1).
  4. Aliquot 100 μL resuspendeerde parasieten (1 x 107 cellen) in 1,5 ml micro centrifugebuizen. Voeg 5-10 μg gRNA toe en meng zachtjes door pipetten.
  5. Breng het mengsel over in een 2 mm gap electroporatie kuvette. Breng de puls met de electroporatie apparaat, met behulp van X-14 programma.
  6. Breng de inhoud van de Cuvette in een T-25-kolf met 5 mL voorverwarmd verlicht medium (10% FCS). Laat het dopje los en incuberen de kolf bij 37 °C onder 5% CO2.
  7. Monitor de celgroei door voortzetting van Axenische kweek (sectie 4) of als intracellulaire amastigotes na infectie van de host-cel (rubriek 5).

4. monitoring van de groei van Knockout cellen als Axenic Amastigotes

  1. Ea's vestigen zich aan de onderkant van het kweekmedium, dus schud de kolf voorzichtig om ze in de oplossing te hervatten. Het reinigen van het oppervlak van de kolf door pipetteren helpt, omdat sommige cellen aan de kolf worden gehecht.
  2. Meng 1 μL propidium jodide (PI)-oplossing (20 μg/mL) met 20 μL amastigote-cultuur.
    Opmerking: Laat de kweek kolf niet langer dan nodig buiten de incubator. Temperatuur is een van de factoren die het mogelijk maakt Axenische proliferatie22.
  3. Breng het monster op hemocytometer aan en observeer onder een fluorescentiemicroscoop. PI is bedoeld om het celmembraan te beschadigen, maar is uitgesloten van levende cellen. Tel het aantal levensvatbare amastigotes die niet worden gekleurd door PI (ex/em 570 nm/602 nm).

5. monitoring van de groei van Knockout cellen als intracellulaire Amastigotes

  1. Seed host 3T3 cellen in een 12-put plaat met DMEM (10% FCS). Pas de celdichtheid aan tot 70-80% confluency, of ongeveer 3 x 105 cellen per put.
    Opmerking: Aangezien amastigotes niet motiel zijn, het grootste deel van het groei oppervlak bedekt door de gastheer cellen verbetert de efficiëntie van de infectie.
  2. Verzamel Knockout amastigotes uit stap 3,6 door centrifugeren een dag na elektroporation. Gooi de supernatant weg en regeer de parasiet met 2 mL DMEM (10% FCS).
  3. Verwijder medium uit de celcultuur van de host en pas geresuspendeerde amastigotes toe. Een veelheid van infecties moet 20 of hoger zijn. Incuberen de plaat bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende 2 dagen om amastigotes in staat te stellen een infectie te veroorzaken.
    Opmerking: Infectie periode kan 1 dag, afhankelijk van het doel.
  4. Weggewassen EAs bleef tweemaal buiten de hostcellen met DMEM (10% FCS).
  5. Voeg verse DMEM (10% FCS) toe aan de co-cultuur van de gastheer-parasiet en ga verder met de incubatietijd bij 37 °C voor nog 2 dagen.
  6. Om te evalueren infectie efficiëntie, visualiseer kernen van de gastheer cellen en intracellulaire amastigote.
    Opmerking:     kernen worden meestal overlapt met verzadigde co-cultuur. Het opnieuw plateren van cellen bij lagere celdichtheid (zoals 1:5 verdunning) voorafgaand aan fixatie en kleuring helpt om kernen gemakkelijker te tellen.
    1. Verwijder het kweekmedium en breng 1 mL 10% formaline oplossing aan in PBS om de cellen te fixeren. Incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Vervang de formaline-oplossing door 1 mL PBS met 1 μg/mL Hoechst 33342 en 0,1% Triton X-100. Incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder de Hoechst-oplossing en spoel de cellen één keer met PBS. Voeg 1 mL verse PBS toe.
  7. Observeer onder fluorescentiemicroscoop en Identificeer host celkernen die geassocieerd zijn met kleinere parasiet kernen (Figuur 4). Host cellen die meer dan 2 amastigotes bevatten moeten worden beschouwd als besmet, niet te bevatten niet-productieve initiële infectie of ongewassen EAs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Isolatie van trypomastigoten door de Swim-out procedure

Om verse trypomastigoten te oogsten van contaminerende oude ea's door Swim-out procedure, moeten celpellets ten minste voor 1 h worden geïnineerd. incuberen van de pellets voor meer dan 2 h niet significant verhogen het aantal trypomastigoten zwemmen in de oplossing ( Figuur 2b). In dit specifieke experiment was het percentage trypomastigote in het oorspronkelijke mengsel 38%, en het percenta...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben aangetoond dat de Axenische-cultuur van T. cruzi amastigotes kan worden gebruikt in crispr/Cas9-gemedieerde Gene Knockout, door grna rechtstreeks te elektroporeren in Cas9-UITDRUKKEN van EA. Op deze manier kan de essentialiteit van het doel gen specifiek in amastigote stadium worden geëvalueerd zonder door andere ontwikkelingsstadia te gaan.

Een ander gunstig aspect van amastigote transfectie is het gemak bij het testen van een groot aantal doel genen. Zodra de co-cultuur va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflict te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd deels ondersteund door JSPS KAKENHI Grant nummer 18K15141 tot Y.T.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
20% formaline oplossingFUJIFILM Wako Pure Chemical068-03863fixatie van cellen
25 cm2 dubbele afdichtingsdop kweekkolfAGC Techno Glass3100-025
75 cm2 dubbele afdichtingsdop kweekkolfAGC Techno Glass3110-075
All-in One Fluorescerend MicroscoopKeyenceBZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (voor Controle)IDTop maat gemaaktdoelsequentie = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (voor TcCGM1)IDTop maat gemaaktdoelsequentie = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (voor TcPAR1)IDTop maat gemaaktdoelsequentie = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIDT1072532om te annealeren met crRNA
Amaxa Nucleofector apparaatLONZAAAN-1001elektroporatie
Basic Parasite Nucleofector Kit 2LONZAVMI-1021elektroporatie
BSASigma-AldrichA3294component van het medium voor in vitro amastigogenese
Burker-Turk wegwerp hemocytometersWatson177-212Cceltelling
Coster 12-wells Clear TC-Behandelde Meerdere Well PlatenCorning3513
DMEMFUJIFILM Wako Pure Chemical044-29765kweekmedium
Fetaal bovien serum, GedefinieerdHycloneSH30070.03voor gebruik verwarmen om inactief te maken
G-418 Sulfaat OplossingFUJIFILM Wako Pure Chemical077-06433selectie van transformant
Hemine chlorideSigma-AldrichH-5533component van LIT medium
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570kleuring van kernen
Liver infusie bouillon, DifcoBecton Dickinson226920component van LIT medium
MESFUJIFILM Wako Pure Chemical349-01623component van het medium voor in vitro amastigogenese
PBS (–)FUJIFILM Wako Pure Chemical166-23555
Propidium JodideSigma-AldrichP4864-10MLkleuring van dode cellen
RPMI 1646Sigma-AldrichR8758medium voor metacyclogenesis

Referenties

  1. World Health Organization. (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
  2. Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
  3. Apt, W. Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease. Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).
  4. Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. 6 (4), e01012(2015).
  5. Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi. mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).
  6. Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).
  7. Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants. International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).
  8. Costa, F. C. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388(2018).
  9. Soares Medeiros, L. C. High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins. mBio. 8 (6), (2017).
  10. Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An axenic amastigote system for drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).
  11. Bates, P. A. Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).
  12. Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds. Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).
  13. Nühs, A. Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).
  14. De Rycker, M. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  15. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  16. Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation. Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).
  17. Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).
  18. Pan, S. C. Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C. Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).
  19. Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH. Parasitology. 110 (05), 547(1995).
  20. Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).
  21. Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes. Frontiers in Microbiology. 9, 1341(2018).
  22. Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088(2019).
  23. Fernandes, J. F., Castellani, O. Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).
  24. Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).
  25. van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).
  26. Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection. Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).
  27. Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein. The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).
  28. Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere. 1 (2), (2016).
  29. Chao, D., Dusanic, D. G. Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography. Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).
  30. Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi. The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).
  31. Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 10, 370(2009).
  32. Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes. Scientific Reports. 8 (1), 7960(2018).
  33. Fu, Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  34. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  35. Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi. mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Amastigote kweekCRISPR Cas9 knock outaxene kweekelektroporatieguide RNAceltellinginfectie van gastheercellenfenotypeanalyse
Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.