Methodenartikel

Een robuuste polymerase kettingreactie op basis van Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide herhalingen in fragiele X mentale retardatie-1 gen

DOI:

10.3791/59963

⸱

16 september 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een nauwkeurige en robuuste polymerase kettinggebaseerde assay test voor het kwantificeren van Cytosine-guanine-guanine trinucleotide herhalingen in het fragiele X mentale retardatie-1 gen vergemakkelijkt de moleculaire diagnose en screening van fragiel X-syndroom en fragiele X-gerelateerde aandoeningen met kortere turn-around tijd en investering in apparatuur.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fragiel X-syndroom (FXS) en geassocieerde aandoeningen worden veroorzaakt door uitbreiding van de Cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide REPEAT in de 5 ' onvertaalde regio (UTR) van de fragiele X Mental Retardation-1 (FMR1) Gene Promoter. Conventioneel, capillaire elektroforese fragment analyse op een genetische analysator wordt gebruikt voor de dimensionering van de CGG herhalingen van FMR1, maar extra Southern blot analyse is vereist voor exacte meting wanneer het herhalingsnummer hoger is dan 200. Hier presenteren we een accurate en robuuste polymerase kettingreactie (PCR)-gebaseerde methode voor de kwantificering van de CGG-herhalingen van FMR1. De eerste stap van deze test is de PCR-versterking van de herhalings sequenties in de 5 ' UTR van de FMR1 -promotor met behulp van een fragiele X PCR-Kit, gevolgd door zuivering van de PCR-producten en fragment dimensionering op een microfluïdisch capillair elektroforese-instrument, en latere interpretatie van het aantal CGG herhalingen door te verwijzen naar normen met bekende herhalingen met behulp van de analyse software. Deze PCR-gebaseerde test is reproduceerbaar en kan het volledige bereik van CGG-herhalingen van FMR1 -promotors identificeren, waaronder die met een herhaald aantal van meer dan 200 (geclassificeerd als volledige mutatie), 55 tot 200 (premutatie), 46 tot 54 (intermediair) en 10 tot 45 (normaal). Het is een kosteneffectieve methode die de classificatie van de FXS en fragiele X-geassocieerde aandoeningen met robuustheid en snelle rapportage tijd vergemakkelijkt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fragiele X syndroom (FXS) en fragiele X geassocieerde aandoeningen, bijvoorbeeld tremor en ataxie syndroom (FX-TAS), en primaire ovariële insufficiëntie (FX-POI) worden voornamelijk veroorzaakt door Cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide herhalings uitbreiding in de 5 ' onvertaalde regio (UTR) van het fragiele X Mental Retardation-1 (FMR1) gen op xq 27,31,2. De FMR1 gecodeerd eiwit (FMRP) is een poly ribosome-geassocieerde RNA-bindende proteïne dat functioneert in neuronale ontwikkeling en synaptische plasticiteit door het reguleren van alternatieve splicing, stabiliteit, en dendritische transport van mRNA of modulerende synthese van partiële postsynaptische eiwitten3,4,5,6,7.

De dynamische variatie met een CGG herhalings grootte van > 200 wordt beschreven als volledige mutatie, die de afwijkende hypermethylatie en daaropvolgende transcriptionele uitschakeling van de FMR1 Promoter8induceert. De resulterende afwezigheid of het ontbreken van het FMRP-eiwit verstoort de normale neuronale ontwikkeling en veroorzaakt FXS9, gekenmerkt door verschillende klinische symptomen, waaronder matige tot ernstige verstandelijke handicap, ontwikkelingsachterstand, hyperactieve gedragingen, slechte contacten en autistische manifestaties10,11,12. De presentatie bij vrouwelijke FXS-patiënten is over het algemeen mildere dan die bij mannen. De CGG herhalings grootte variërend van 55 tot 200 en 45 tot 54 zijn geclassificeerd als premutatie en tussenliggende status, respectievelijk. Vanwege de hoge mate van instabiliteit, breidt de CGG-herhalings grootte in een premutatie of intermediair allel vermoedelijk uit wanneer ze worden overgebracht van ouders naar nakomelingen13,14. Zo zijn dragers met premutatie allelen met een hoog risico op het krijgen van kinderen getroffen met FXS vanwege de herhaalde expansie, en in sommige gevallen kunnen intermediaire allelen hun herhalings grootte uitbreiden tot het volledige mutatie bereik van twee generaties15, 16. Bovendien geven mannetjes met premutatie ook een verhoogd risico op het ontwikkelen van Late-onset FX-tas17,18,19, terwijl premutatie vrouwtjes voorbestemd zijn voor zowel FX-tas als FX-POI20, 21,22. Onlangs is gemeld dat autistische spectrum stoornissen met vertraging in de ontwikkeling en problemen in sociaal gedrag worden gepresenteerd bij kinderen met premutatie FMR1 allelen23,24.

Om te bepalen van de exacte CGG REPEAT grootte is van groot belang voor de classificatie en voorspelling van de FXS en fragiele X-geassocieerde aandoeningen25,26. Historisch gezien is de CGG herhalings regiospecifieke polymerase kettingreactie (PCR) met fragment dimensionering plus Southern blot analyse de gouden standaard voor moleculaire profilering van de FMR1 CGG REPEAT27. Traditionele specifieke PCR is echter minder gevoelig voor grote premutaties met meer dan 100 tot 130 herhalingen en is niet in staat om volledige mutaties te versterken27,28. Bovendien kan capillaire elektroforese op een traditionele genetische analysator voor herhaalde dimensionering FMR1 PCR-producten niet detecteren met meer dan 200 CGG-herhalingen. De Southern blot-analyse maakt differentiatie mogelijk van een breder scala aan herhalings grootte, van normale tot volledige mutatie herhalings nummers, en is op grote schaal gebruikt voor het bevestigen van volledige mutaties (bij mannetjes) en het differentiëren van heterozygoot allelen met een volledige mutatie uit blijkbaar homozygoot allelen met normale herhaalde maten (bij vrouwtjes). De resolutie voor het kwantificeren van de herhalingen is echter beperkt. Nog belangrijker is dat deze stapsgewijze teststrategie arbeidsintensieve, tijdrovende en kosten ineffectief is.

Hier presenteren we een accurate en robuuste PCR-gebaseerde methode voor de kwantificering van de CGG herhalingen van FMR1. De eerste stap van deze test is de PCR-versterking van de herhalings sequenties in de 5 ' UTR van de FMR1 Promoter met behulp van de FRAGIELE X PCR Kit. De PCR-producten worden gezuiverd en fragment dimensionering wordt uitgevoerd op een microfluïdisch capillair elektroforese instrument, en de daaropvolgende interpretatie van het aantal CGG herhalingen met behulp van de analyse software door te verwijzen naar normen met bekende herhalingen op basis van de de reden dat de lengte van het PCR-fragment recht evenredig is aan het aantal CGG-herhalingen. Het PCR-systeem omvat reagentia die de versterking van het zeer GC-rijke trinucleotide herhalingsgebied vergemakkelijken. Deze PCR-gebaseerde test is reproduceerbaar en kan alle bereiken van CGG-herhalingen van FMR1 -promotors identificeren. Dit is een kosteneffectieve methode die een brede toepassing kan vinden in de moleculaire diagnostiek en screening van FXS en fragiele X-gerelateerde aandoeningen met minder turn-around tijd en investeringen in apparatuur en dus kan worden gebruikt in een breder spectrum van klinische Laboratoria.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethische goedkeuring werd verleend door de joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East cluster klinisch onderzoek ethiek Commissie (referentienummer: 2013,055)

1. PCR-versterking

  1. Verwijder vóór het starten de PCR-buffer mix, monster verdunningsmiddel en DNA-monsters (zowel test-als referentie-DNA) (Zie de tabel met materialen) van de-20 °c vriezer en bewaar ze gedurende 20 – 30 minuten op kamertemperatuur om te controleren of alle reagentia en DNA volledig ontdooid zijn. Vortex en draai kort voor gebruik.
  2. Meet de concentratie van de DNA-monsters met behulp van een spectrofotometer (Zie tabel met materialen). De DNA-concentratie moet 25 ng/μL zijn; verdunnen met monster verdunningsmiddel naar de juiste concentratie indien nodig.
    Opmerking: Het DNA moet worden geëxtraheerd en gezuiverd om storende stoffen, zoals eiwitten en hoge zoutconcentraties, te verwijderen. Niet-gedegradeerd, kwalitatief hoogwaardig DNA moet worden gebruikt voor volgende PCR-amplificatie en-analyse (A260/A280:1.8 – 2.0 en A260/A230: > 1.0).
  3. Label putten van een PCR-plaat of 0,2 mL PCR-buizen om referentie-en geteste DNA-monsters te identificeren.
  4. Bereken het aantal PCR-reacties dat nodig is voor de test monsters, 2 referentiemonsters en een negatief controlemonster. Bereid de PCR-Master mix voor door toevoeging van 15 μL PCR-buffer mengsel, 2,6 μL monster verdunningsmiddel en 0,4 μL polymerase voor elke reactie.
    Opmerking: Een negatieve controle met behulp van verdunningsmiddel is essentieel om de PCR-prestaties te bewaken. Bereid de PCR-Master Mix bij kamertemperatuur, Pipetteer niet op ijs. De PCR-buffer mix is visceus. Meng de buis en draai kort vóór gebruik.
  5. Vortex de PCR-Master mix van stap 1,4 voor 10 – 20 s en draai naar beneden. Doseer langzaam 18 μL van het mengsel in elke put of buis.
  6. Vortex en draai de DNA-samples om. Pipetteer 2 μL van elk DNA in de juiste put of buis voor een laatste PCR-volume van 20 μL. Meng door 5 keer op en neer te pipetteren.
    Opmerking: De totale hoeveelheid DNA per reactie moet 50 – 100 ng zijn. DNA-bedragen groter dan 150 ng per 20 μL PCR-reactie kunnen resulteren in een slechte versterking van grote herhaalde allelen. Voor lagere geconcentreerde Dna's kan de hoeveelheid monster verdunningsmiddel in de PCR-Master mix worden vervangen door een DNA-oplossing.
  7. Sluit de plaat af met zelfklevende sealer of met buis doppen.
  8. Plaats de verzegelde PCR-plaat of-buizen in de thermische cycler met verwarmde deksel. Voer het programma uit met de volgende instellingen: 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 25 cycli denaturering bij 98 °C voor 35 s, gloeien bij 59 °C voor 35 s en verlenging bij 72 °C gedurende 4 minuten; een laatste stap bij 72 °C gedurende 10 min. Houd de PCR-producten bij 4 °C in de cycler tot de verwijdering voor verdere verwerking.
  9. Na PCR-amplificatie worden de producten onmiddellijk gezuiverd en geanalyseerd, of gedurende een nacht op + 2 tot + 8 °C bewaard. Als alternatief kan het product tot 30 dagen worden bewaard bij-30 tot-16 °C.

2. zuivering van de PCR-producten

  1. Verwarm de couveuse Shaker voor op 65 °C.
  2. Voeg voor elke PCR-reactie 80 μL 1x TE buffer (Zie de tabel met materialen) toe aan de 20 μL van elk PCR-product uit rubriek 1.
  3. Breng het monster mengsel over in een PCR-opschoon plaat (Zie tabel met materialen) met behulp van een meerkanaalspipet.
  4. Houd de plaat onbedekt en plaats deze in de incubator, en incureren bij 65 ° c terwijl het schudden bij 1.200 rpm gedurende 10 minuten.
  5. Stel na incubatie het vacuüm instrument in op 250 mbar (of 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 in Hg) en zuig de oplossing door het filter 15 min. putten mogen geen vloeistof resterend hebben.
  6. Koel de incubator Shaker af tot 25 °C.
  7. Schakel na de eerste aspiratie het vacuüm uit en voeg 50 μL 1x TE buffer aan elke put toe. Niet mengen. Aspirate de oplossing voor 10 min met behulp van de vacuüm-instellingen in stap 2,5.
  8. Droog de bodem van het filter plaatje door het stevig op een stapel papieren handdoeken te drukken.
  9. Voeg 20 μL 1x TE buffer toe aan het midden van elke put. Plaats de plaat in de incubator en bebroed bij 25 °C terwijl u gedurende 5 minuten met 1.200 tpm schudt.
  10. Breng na incubatie > 15 μL van elk gezuiverd PCR-DNA van stap 2,9 over naar een nieuwe 96-well PCR-plaat. Het gezuiverde DNA kan direct worden geanalyseerd, of als alternatief kan worden opgeslagen bij-30 tot-16 °C tot dat nodig is.

3. fragment dimensionering van PCR-producten

  1. Laat voorafgaand aan het starten het DNA-kleurstof concentraat, de DNA-gel-matrix, de DNA-marker, de DNA-ladder en de gezuiverde DNA-monsters van stap 2 toe op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  2. Het priming station instellen.
    1. Vervang de spuit (Zie tabel van de materialen) bij gebruik van een nieuwe batch reagentia.
    2. Pas de basisplaat aan en laat de hendel van de spuit clip los en schuif deze omhoog naar de bovenste positie.
  3. Start de dimensioneringssoftware (Zie tabel met materialen) en bereid de gel-Dye mix voor.
  4. Vortex Dye concentraat voor 10 sec. en spin naar beneden. Voeg 25 μL van de kleurstof toe aan een gel matrix flacon. Vortex de gemengde oplossing goed en spin naar beneden.
    1. Breng de gel-Dye mix over naar een spin filter. Plaats het spin filter in een micro centrifuge en draai gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 1.500 x g ± 20%.
      Opmerking: Bescherm de oplossing met kleurstof uit licht en bewaar na gebruik bij 4 °C. De gel-Dye mix kan worden gebruikt voor ongeveer 15 chips eenmaal voorbereid. Laat de gel-Dye mix elke keer voor gebruik op kamertemperatuur gaan voor 30 minuten.
  5. Laad de gel-Dye mix.
    1. Plaats een nieuwe DNA-chip op het priming station. Voeg 9 μL gel-Dye mix toe aan de goed gemarkeerde met "G". Controleer of de zuiger op het 1 mL-merk is geplaatst en sluit vervolgens het priming-station.
    2. Druk de zuiger van de spuit naar beneden totdat deze door de clip wordt vastgehouden. Wacht exact 30 sec. en laat de clip los. Wacht 5 sec. en trek de zuiger langzaam terug naar de 1 mL positie.
    3. Open het priming station en voeg 9 μL gel-Dye mix toe aan de putten gemarkeerd met "G".
  6. Voeg 5 μL Marker toe aan de goed gemarkeerde met het ladder symbool en voeg ook 5 μL Marker toe aan elk van de 12 monster putten. Laat geen putjes leeg.
  7. Voeg 1 μL DNA ladder toe aan de goed gemarkeerde met het ladder symbool. Voeg 1 μL PCR-product (gebruikte putten) toe uit stap 3,1 of 1 μL ultrapuur water (ongebruikte putten) in elk van de 12 monster putten. Plaats de chip horizontaal in de adapter van Vortex mixer en Vortex gedurende 1 minuut bij de aangegeven instelling (2.400 rpm).
  8. Steek de chip in het instrument van de bioanalyzer en voer de chip in het instrument binnen 5 min.
  9. Nadat de test is voltooid, verwijdert u onmiddellijk de gebruikte chip uit het instrument.
  10. Voeg langzaam 350 μL gedeïoniseerd water toe aan een van de putjes van de elektrode reiniger. Open de deksel van de bioanalyzer en plaats de elektrode reiniger erin. Sluit de deksel en incuberen voor ongeveer 10 s. Open het deksel en verwijder de elektrode reiniger. Wacht nog eens 10 s om het water op de elektroden te laten verdampen en sluit vervolgens het deksel.

4. Analyseer de fragment Dimensionerings resultaten

Opmerking: De referentiemonsters moeten worden versterkt en geanalyseerd door dezelfde thermische cycler en bioanalyzer in dezelfde batch met de onbekende monsters.

  1. Nadat de bioanalyzer-uitvoering is voltooid, exporteert u de piek gegevens van elke uitvoering als een CSV-tabel bestand voor volgende analyse.
  2. Start de analyse software en open het geëxporteerde. CSV-piek tabel bestand uit stap 4,1.
  3. Controleer via het tabblad menu van QC de regressielijn die is aangebracht op de vier punten (weergegeven als blauwe diamanten op het perceel) uit de twee referentiemonsters. De R2 -waarde van de regressielijn moet > 0,98 (typische waarden overschrijden 0,999).
  4. Controleer via het menu tabblad resultaten de herhalings grootte van elk monster waarvan de fragment lengte (s) automatisch wordt uitgezet tegen de standaard curve van de lineaire regressie die is afgeleid van de referentiemonsters. De software biedt ook de classificatie van elk monster volgens verschillende richtlijnen.
  5. Via de exporteren menu tabblad, exporteert u het resultaatrapport voor elk voorbeeld met de herhalings nummers en diagnostische classificatie, evenals een samenvatting van de voorbeeld informatie en het QC-rapport voor elke uitvoering.
    Opmerking: Analyse software maakt het gebruik van aangepaste classificatie richtlijnen, zoals American College of Medical Genetics (ACMG) of klinische moleculaire genetica Society/European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG) richtsnoeren, evenals vooraf gedefinieerde classificatie Criteria.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dimensionerings resultaten van het vrouwelijke referentiemonster van de premutatie (NA20240, herhalings grootten van 30 en 80) en het vrouwelijke referentiemonster voor de volledige Mutatie (NA20239, herhalings grootten van 20 en 200) worden respectievelijk weergegeven in Figuur 1a en Figuur 1b. Meestal zijn twee markerings pieken (lagere marker 50 basis paren [BP] en bovenste marker 10.380 BP) opgenomen in het fragment grootte profiel. Er is meestal een prim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FXS is de tweede meest voorkomende oorzaak van verstandelijke beperking na trisomie 21, die bijna de helft van de X-gebonden mentale retardatie30, die ongeveer 1 bij 4.000 mannetjes en 1 in 8.000 vrouwtjes kan treffen. Nog belangrijker is dat bijna 1 op de 250 – 1000 vrouwtjes een premutatie dragen, en deze frequentie is 1 in 250 – 1600 bij mannetjes26,31,32,33. Omdat he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van het NSFC Emergency Management project (Grant No. 81741004), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), het belangrijkste onderzoeksplan van de provinciale wetenschap en technologiestichting van Guangxi ( Grant No. AB16380219), de China postdoctoral Science Foundation subsidie (Grant No. 2018M630993), en de Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridgeAgilentBenodigdheden voor het apparaat van de 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixerAgilentBenodigdheden voor het apparaat van de 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert softwareAgilentBenodigdheden voor het apparaat van de 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chipsAgilentBenodigdheden voor het apparaat van de 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kitAgilent5067-1506Voor fragmentgroottebepaling
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (gele dop)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalogusnummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (groene dop)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalogusnummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalogusnummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blauwe dop)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalogusnummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (rode dop)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalogusnummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalogusnummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentBenodigdheden van Agilent DNA 7500 kit (catalogusnummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: SyringeAgilentBenodigdheden van Agilent DNA 7500 kit (catalogusnummer: 5067-1506)
Chip priming stationAgilent5065-4401Benodigdheden voor het apparaat van de 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum ManifoldMerck MilliporeMSVMHTS00Vacuum instrument voor Filter plate vacuum Manifold voor PCR product zuivering
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopperMerck MilliporeXX2004718Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pumpMerck MilliporeWP6122050Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vesselMerck MilliporeXX1004705Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010Voor PCR-amplificatie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16(2009).
  6. Ascano, M. Jr, et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100(2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fragile X Mental Retardation 1 GeneCGG Trinucleotide Repeat QuantificationPolymerase Chain Reaction AssayMicrofluidic Capillary ElectrophoresisFragile X Syndrome DiagnosisPremutation Full Mutation ClassificationPCR Product PurificationFragment Size AnalysisDNA Sample PreparationGenetic Analyzer Sizing

Gerelateerde artikelen