De gepresenteerde methode combineert de kwantitatieve analyse van DNA Double-strand Breaks (DSBs), celcyclus verdeling en apoptosis om de celcycluspecifieke evaluatie van de inductie en reparatie van DSB mogelijk te maken, evenals de gevolgen van herstel fouten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De gepresenteerde methode of licht gewijzigde versies zijn bedacht om specifieke behandelings responsen en bijwerkingen van verschillende anti-kankerbehandelingen te bestuderen, zoals gebruikt in de klinische oncologie. Het maakt een kwantitatieve en longitudinale analyse van de DNA-schade reactie mogelijk na genotoxische stress, zoals geïnduceerd door radiotherapie en een veelheid aan anti-kanker drugs. De methode dekt alle stadia van de DNA-schade reactie, het verstrekken van eindpunten voor inductie en reparatie van DNA dubbel strand Breaks (DSBs), arrestatie van de celcyclus en celdood door Apoptosis in geval van herstel falen. Het combineren van deze metingen geeft informatie over de celcyclus afhankelijke behandelingseffecten en maakt zo een grondige studie mogelijk van de wisselwerking tussen cellulaire proliferatie en het omgaan met DNA-beschadiging. Aangezien het effect van veel kankertherapieën, waaronder chemotherapeutische middelen en ioniserende straling, beperkt is tot of sterk varieert naargelang de specifieke celcyclus fasen, vertrouwen correlatieve analyses op een robuuste en haalbare methode om de behandelingseffecten te beoordelen op het DNA in een celcyclus-specifieke manier. Dit is niet mogelijk met assays met één eindpunt en een belangrijk voordeel van de gepresenteerde methode. De methode is niet beperkt tot een bepaalde cellijn en is grondig getest in een veelheid van tumor en normale weefsel cellijnen. Het kan op grote schaal worden toegepast als een uitgebreide genotoxiciteitstest op vele gebieden van oncologie naast radio-oncologie, waaronder milieueffectbeoordeling, geneesmiddelen screening en evaluatie van genetische instabiliteit in tumorcellen.
Inleiding
Het doel van oncologie is om kankercellen te doden of te deactiveren zonder de normale cellen te schaden. Veel therapieën induceren direct of indirect genotoxische stress in kankercellen, maar ook bij sommige zich uitstrekken in normale cellen. Chemotherapie of gerichte geneesmiddelen worden vaak gecombineerd met radiotherapie om de radio gevoeligheid van de bestraalde tumor1,2,3,4,5te verbeteren, wat een reductie van de stralingsdosis om normale weefselbeschadiging te minimaliseren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. voorbereiding
-
Bereid ≥ 1 x 105 cellen/monster in elk type kweek vaartuig als uitgangsmateriaal.
- Bijvoorbeeld, het uitvoeren van een tijd-cursus experiment na blootstelling van U87 multiform glioblastoom cellen aan ioniserende straling: irradiate sub-confluente U87 cellen in T25 kolven in triplicaten voor elk tijdspunt. Kies vroege tijd-punten (15 min tot 8 h na bestraling) om de kinetiek van DSB Repair (γH2AX niveau) en late tijdpunten (24 h tot 96 h) te volgen om de resterende DSB-niveaus te beoordelen, celcyclus effecten en apoptosis.
Opmerking: Het protocol is niet beperkt tot bestralings exper....
- Bijvoorbeeld, het uitvoeren van een tijd-cursus experiment na blootstelling van U87 multiform glioblastoom cellen aan ioniserende straling: irradiate sub-confluente U87 cellen in T25 kolven in triplicaten voor elk tijdspunt. Kies vroege tijd-punten (15 min tot 8 h na bestraling) om de kinetiek van DSB Repair (γH2AX niveau) en late tijdpunten (24 h tot 96 h) te volgen om de resterende DSB-niveaus te beoordelen, celcyclus effecten en apoptosis.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Humane U87 of LN229 multiform glioblastoom cellen werden bestraald met 4 GY foon of koolstofionstraling. Celcyclus-specifieke γH2AX niveaus en apoptosis werden gemeten op verschillende tijdstippen tot 48 uur na bestraling met behulp van de hier gepresenteerde Flow cytometrische methode (Figuur 3). In beide cellijnen induceerde koolstofionen hogere γH2AX piek niveaus die langzamer daalden en bleven significant verhoogd bij 24 tot 48 h vergeleken met fotopstraling bij dezelfde fysieke dosis (<.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De aanbevolen methode is eenvoudig te gebruiken en biedt een snelle, nauwkeurige en reproduceerbare meting van de DNA-schade respons inclusief dubbele-strand break (DSB) inductie en reparatie, celcyclus effecten en apoptotische celdood. De combinatie van deze eindpunten biedt een vollediger beeld van hun onderlinge relaties dan individuele assays. De methode kan op grote schaal worden toegepast als een uitgebreide genotoxiciteitstest op het gebied van stralings biologie, therapie en bescherming, en meer in het algemeen i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken het flow Cytometry Facility team van het Duitse kanker onderzoekscentrum (DKFZ) voor hun steun.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1,000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1,000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Los op in water bij 200 µg/mL en bewaar aliquots bij -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Verdun 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Verdun 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | Voor cytometer reiniging routine na meting |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | Voor cytometer reiniging routine na meting |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Los op in water tot 1x concentratie |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine celkweek materiaal voor de voorbeeldcellijn gebruikt in het protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine celkweek materiaal voor de voorbeeldcellijn gebruikt in het protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online bestellen | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Inbedmedium voor optionele bereiding van microscopische preparaten van gekleurde monsters |
| Folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | Optioneel medicijn voor apoptose positieve controle |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Bereid verse 4,5% oplossing. Verdun in PBS door te verwarmen tot 80 °C met langzaam roeren onder de afzuigkap. Bedek de flacon met aluminiumfolie om warmteverlies te voorkomen. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en pas het eindvolume aan. Laat de oplossing door een cellulosefilter passeren. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Verdun 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | Optioneel medicijn voor apoptose positieve controle |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine celkweek materiaal voor de voorbeeldcellijn gebruikt in het protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine celkweek materiaal voor de voorbeeldcellijn gebruikt in het protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Voorbeeldcellijn gebruikt in het protocol |
Referenties
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122(2006).
- Oertel, S., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
