Geautomatiseerde rat single-pellet bereiken met 3-dimensionale reconstructie van paw en Digit trajecten

Samenvatting

Knaagdier vaardige bereiken wordt vaak gebruikt om behendige vaardigheden te bestuderen, maar vereist veel tijd en moeite om de taak te implementeren en het gedrag te analyseren. We beschrijven een geautomatiseerde versie van bekwaam bereiken met bewegingsregistratie en driedimensionale reconstructie van REACH-trajecten.

Samenvatting

Knaagdier vaardige bereiken wordt vaak gebruikt om behendige vaardigheden te bestuderen, maar vereist veel tijd en moeite om de taak te implementeren en het gedrag te analyseren. Er zijn onlangs verschillende geautomatiseerde versies van bekwaam bereiken ontwikkeld. Hier beschrijven we een versie die automatisch pellets aan ratten presenteert tijdens het opnemen van high-definition video vanuit meerdere hoeken bij hoge frame rates (300 fps). De Paw en individuele cijfers worden bijgehouden met DeepLabCut, een machine learning-algoritme voor schatting van de markerless pose. Dit systeem kan ook worden gesynchroniseerd met fysiologische opnames, of worden gebruikt voor het triggeren van fysiologisch ingrijpen (bijv. elektrische of optische stimulatie).

Inleiding

Mensen zijn sterk afhankelijk van behendige vaardigheid, gedefinieerd als bewegingen die nauwkeurig gecoördineerde multi-joint en Digit bewegingen vereisen. Deze vaardigheden worden beïnvloed door een reeks gemeenschappelijke pathologieën van het centrale zenuwstelsel, waaronder structurele laesies (bijv. beroerte, tumor, demyelinerende laesies), neurodegeneratieve ziekte (bijv. de ziekte van Parkinson) en functionele afwijkingen van de motor circuits (bijv. dystonie). Inzicht in hoe behendigheid vaardigheden worden geleerd en uitgevoerd door centrale motorcircuits heeft daarom de potentie om de kwaliteit van leven voor een grote populatie te verbeteren. Bovendien is een dergelijk begrip waarschijnlijk het verbeteren van de motorische prestaties bij gezonde mensen door het optimaliseren van opleidings-en revalidatie strategieën.

Het ontleden van de neurale circuits die ten grondslag liggen aan de behendigheid van de mens wordt beperkt door technologische en ethische overwegingen, waardoor het gebruik van diermodellen noodzakelijk is. Niet-humane primaten worden vaak gebruikt om behendige ledemaat bewegingen te bestuderen, gezien de gelijkenis van hun motorsystemen en gedrags repertoire aan mensen¹. Echter, niet-menselijke primaten zijn duur met lange generatie tijden, het beperken van aantallen studie onderwerpen en genetische ingrepen. Bovendien, terwijl de neurowetenschappelijke Toolbox die van toepassing is op niet-menselijke primaten groter is dan voor mensen, zijn veel recente technologische ontwikkelingen ofwel niet beschikbaar of aanzienlijk beperkt in primaten.

Knaagdier vaardige bereiken is een complementaire benadering van het bestuderen van behendige motorische controle. Ratten en muizen kunnen worden getraind om een suiker pellet te bereiken, te begrijpen en op te halen in een stereotiepe opeenvolging van bewegingen die homologe zijn voor het bereiken van menselijke patronen². Vanwege hun relatief korte generatie tijd en lagere huisvestingskosten, evenals hun vermogen om bekwame bereiken te verwerven gedurende dagen tot weken, is het mogelijk om grote aantallen onderwerpen te bestuderen tijdens zowel leer-als vaardigheids consolidatie fasen. Het gebruik van knaagdieren, vooral muizen, vergemakkelijkt ook het gebruik van krachtige moderne neurowetenschappelijke instrumenten (bijv. optogenetica, calcium beeldvorming, genetische modellen van de ziekte) om behendige vaardigheid te bestuderen.

Knaagdieren bekwame bereiken is al decennia lang gebruikt om normale motorische controle te bestuderen en hoe het wordt beïnvloed door specifieke pathologieën zoals beroerte en de ziekte van Parkinson³. Echter, de meeste versies van deze taak zijn arbeid en tijd-intensieve, het verzachten van de voordelen van het bestuderen van knaagdieren. Typische implementaties omvatten het plaatsen van knaagdieren in een bereiken kamer met een plank voor een smal slot waarlangs het knaagdier moet reiken. Een onderzoeker plaatst suiker pellets handmatig op de plank, wacht tot het dier te bereiken, en plaatst vervolgens een andere. Bereikt worden als successen of mislukkingen in real time of door video review⁴. Echter, simpelweg scoren bereikt als successen of mislukkingen negeert rijke kinematische gegevens die inzicht kunnen geven in hoe (in tegenstelling tot alleen of) bereiken is aangetast. Dit probleem werd aangepakt door het implementeren van gedetailleerd overzicht van het bereiken van Video's te identificeren en semi-kwantitatief Score bereiken subbewegingen⁵. Hoewel dit enkele gegevens over REACH kinematica toegevoegd, het ook aanzienlijk toegenomen experimentertijd en inspanning. Bovendien kunnen hoge niveaus van betrokkenheid van onderzoekers leiden tot inconsistenties in de methodologie en data-analyse, zelfs binnen hetzelfde lab.

Meer recentelijk zijn er verschillende geautomatiseerde versies van vakkundig bereiken ontwikkeld. Sommige hechten aan de huis kooi^6,7, waardoor de noodzaak om dieren over te dragen. Dit vermindert zowel de stress op de dieren en elimineert de noodzaak om ze te acclimeren aan een gespecialiseerde kamer te bereiken. Andere versies toestaan paw tracking zodat kinematische veranderingen onder specifieke interventies kunnen worden bestudeerd^8,9,¹⁰, of hebben mechanismen om automatisch te bepalen als pellets werden afgezet van de plank¹¹. Geautomatiseerde bekwame bereiken taken zijn vooral nuttig voor training met hoge intensiteit, zoals nodig kan zijn voor revalidatie na een blessure¹². Dankzij geautomatiseerde systemen kunnen dieren gedurende lange perioden grote aantallen bereikt hebben zonder intensieve betrokkenheid van de onderzoeker. Bovendien, systemen die paw tracking en geautomatiseerde uitkomst scoren mogelijk te verminderen onderzoeker tijd besteed aan het uitvoeren van gegevensanalyse.

We ontwikkelden een geautomatiseerd systeem voor rat-bekwaam bereiken met verschillende gespecialiseerde functies. Ten eerste, door gebruik te maken van een beweegbare voetstuk om de pellet in "bereiken positie" van onderaf te brengen, krijgen we een bijna vrij zicht op de forelimb. Ten tweede maakt een systeem van spiegels meerdere gelijktijdige views van het bereik mogelijk met een enkele camera, waardoor driedimensionale (3D) reconstructie van bereik trajecten mogelijk is met behulp van een hoge resolutie, High-Speed (300 fps) camera. Met de recente ontwikkeling van robuuste machine learning-algoritmen voor markerless Motion Tracking¹³, volgen we nu niet alleen de Paw maar individuele knokkels om gedetailleerd bereik te extraheren en kinematica te begrijpen. Ten derde kan een frame-Grabber die eenvoudige videoverwerking uitvoert, real-time identificatie van afzonderlijke bereiken fasen mogelijk maakt. Deze informatie wordt gebruikt om video-acquisitie te activeren (continue video-acquisitie is niet praktisch vanwege de bestandsgrootte) en kan ook worden gebruikt om interventies (bijv. optogenetica) op precieze momenten te triggeren. Ten slotte worden afzonderlijke videoframes geactiveerd door Transistor-Transistor Logic (TTL) pulsen, zodat de video nauwkeurig kan worden gesynchroniseerd met neurale opnamen (bijvoorbeeld elektrofysiologie of fotometrie). Hier beschrijven we hoe we dit systeem kunnen bouwen, ratten trainen om de taak uit te voeren, het apparaat met externe systemen synchroniseren en 3-D bereik trajecten reconstrueren.

Protocol

Alle methoden met betrekking tot dier gebruik die hier worden beschreven, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.

1. de ophaal kamer instellen

Opmerking: Zie Ellens et al.¹⁴ voor details en diagrammen van het apparaat. Onderdeelnummers verwijzen naar Figuur 1.

1. BIND doorzichtige polycarbonaat panelen met acryl cement om de bereiken kamer (15 cm breed 40 cm lang door 40 cm hoog) te bouwen (deel #1). Een zijpaneel (deel #2) heeft een scharnierende deur (18 cm breed en 15 cm hoog) met een slot. Als de rat aan een kabel wordt gekoppeld, snijd dan een spleet (5 cm breed met 36 cm lang) in het kamer plafond om het te accommoderen (deel #12). Het vloerpaneel heeft 18 gaten (1,75 cm diameter) (deel #13) erin gesneden en is niet gebonden aan de rest van de kamer.
2. Monteer en lijn infraroodsensoren (deel #3) in de zijpanelen 4,5 cm van de achterkant van de kamer en 3,8 cm van de vloer. De gedrags software heeft een indicator (' IR back ') die groen is wanneer de infraroodstraal niet gebroken is en rood wanneer de straal kapot is. Zodra de software is ingesteld, kan dit worden gebruikt om de uitlijning van de sensor te controleren.
3. Monteer een spiegel (15 cm x 5 cm, deel #4) 10 cm boven de sleuf (deel #14). Hoek de spiegel zodat de pellet afleverings staaf zichtbaar is voor de camera.
4. Plaats de kamer op een opruim bare steun doos (59 cm breed bij 67,3 cm lang door 30,5 cm hoog, deel #5). De kamer bevindt zich boven een gat in de steun doos (12 cm breed bij 25 cm lang) waardoor zwerfvuil door de vloer openingen (deel #13) en uit de verreikende kamer kan vallen. Snijd een tweede gat (7 cm breed met 6 cm lang, deel #15) in de steun doos voor het bereiken van de sleuf, waardoor een pellet levering staaf pellets naar de bereikte sleuf kan brengen.
5. Monteer twee spiegels (8,5 cm breed x 18,5 cm hoog, deel #6) op de vloer met magneten aan beide zijden van de kamer zodat de lange zijde van de spiegel het zijpaneel 3 cm van de voorkant van de bereiken doos raakt. Hoek de spiegels zodat de camera kan zien in de doos en het gebied voor de sleuf waar de pellet zal worden afgeleverd.
6. Monteer de high-definition camera (deel #7) 17 cm van de sleuf, tegenover de doos.
7. Monteer zwart papier (deel #18) aan beide zijden van de camera, zodat de achtergrond in de zijspiegels donker is. Dit verbetert het contrast om real-time en off-line paw-detectie te verbeteren.
8. Monteer de lineaire actuator (deel #16) op een reinigings frame (25 cm breed met 55 cm lang en 24 cm hoog, deel #8) met schroeven. De actuator is ondersteboven gemonteerd om te voorkomen dat pellet stof zich ophoteerd in de potentiometer met positiedetectie.
9. Steek een schuim O-ring in de nek van het pelletreservoir (trechter) (deel #9) om te voorkomen dat stof zich ophot in de assemblage. Monteer de trechter onder een gat (~ 6 cm diameter, deel #17) in de bovenkant van het frame door de randen van de trechter boven drie schroeven in de onderzijde van de frame bovenkant te glijden. Plaats de geleidings buis (deel #10) in de nek van de trechter.
10. Bevestig de plastic T-connector aan het uiteinde van de stalen staaf van de actuator. Steek het taps toelopende uiteinde van de pellet afleverings staaf in de bovenkant van de connector en het gecupte uiteinde door de geleidings buis in het pelletreservoir.
11. Plaats de lineaire Actuator assemblage onder de bekwame kamer, zodat de pellet afvoerstang zich door het gat kan uitstrekken (deel #15) voor het bereiken van de sleuf.
12. Plaats het gehele bereik apparaat in een wielkast (121 cm x 119 cm x 50 cm) geventileerd met computer ventilatoren (het interieur wordt warm als het goed verlicht is) en bekleed met akoestisch schuim.
13. Bouw vijf lichtpanelen (deel #11) door het vasthouden van LEDLICHTSTRIPS op 20,3 cm door 25,4 cm support panels. Monteer de diffusor film over de lichtstrips. Monteer een licht paneel op het plafond over de pellet levering Rod gebied. Monteer de andere vier aan de zijkanten van de kasten langs de verreikende kamer.
    Opmerking: het is belangrijk om het gebied rond de bereiken sleuf en pellet levering Rod voor real-time paw identificatie te verlichten.

2. de computer en hardware instellen

1. Installeer de FPGA frame Grabber en digitale uitbreidingskaarten volgens de instructies van de fabrikant (Zie de tabel met materialen).
   Opmerking: we raden ten minste 16 GB RAM-geheugen en een interne Solid-State harde schijf aan voor gegevensopslag, omdat het streamen van de video met hoge snelheid een aanzienlijke buffercapaciteit vereist.
2. Installeer Stuurprogramma's voor de high-definition camera en sluit deze aan op de FPGA framegrabber. De gedrags software moet worden uitgevoerd en interfacing met de camera om de software die is gekoppeld aan de camera te gebruiken.
   Opmerking: de meegeleverde code (Zie aanvullende bestanden) heeft toegang tot programmeerbare registers in de camera en is mogelijk niet compatibel met andere merken. We raden aan om ten minste 300 frames per seconde (fps) te registreren; bij 150 fps vonden we dat belangrijke veranderingen in de Paw-houding vaak werden gemist.
3. Kopieer de meegeleverde code (project) in "SR Automation_dig_ext_card_64bit" naar de computer.

3. gedrags training

1. Bereid ratten voor op de training.
   1. Huis Long-Evans ratten (mannelijk of vrouwelijk, leeftijden 10 – 20 weken) in groepen van 2 – 3 per kooi op een omgekeerde licht/donkere cyclus. Drie dagen voor de training, plaats ratten op voedsel beperking te handhaven lichaamsgewicht 10 – 20% onder Baseline.
   2. Behandel ratten gedurende een aantal minuten per dag gedurende ten minste 5 dagen. Plaats na het hanteren 4 – 5 suiker pellets per rat in elke huis kooi om het nieuwe voedsel te introduceren.
2. Laat de rat wennen aan de bereikte kamer (1 – 3 dagen)
   1. Zet de LED-lampjes aan en plaats 3 suiker pellets aan de voor-en achterzijde van de kamer.
   2. Plaats de rat in de kamer en laat de rat te verkennen voor 15 min. monitor als het eet de pellets. Herhaal deze fase totdat de rat alle pellets van de vloer eet.
   3. Reinig de kamer met ethanol tussen ratten.
      Opmerking: Voer trainingen en testen uit tijdens de donkere fase. Train ratten op hetzelfde moment dagelijks.
3. Train de rat te bereiken en observeren paw voorkeur (1 – 3 dagen).
   1. Zet de lichten aan en plaats de rat in de bekwame kamer.
   2. Gebruik de Tang, houd een pellet door de sleuf aan de voorkant van de doos (Figuur 1, Figuur 2). Laat de Rat 3 pellets uit de Tang eten.
   3. De volgende keer dat de rat de pellet uit de Tang probeert te eten, trek de pellet terug. Uiteindelijk zal de rat proberen te bereiken voor de pellet met zijn poot.
   4. Herhaal dit 11 keer. Het Paw dat de rat het meeste uit de 11 pogingen gebruikt is de rat ' paw voorkeur '.
      Opmerking: een poging wordt gedefinieerd als de Paw bereiken uit langs de bereiken sleuf. De rat hoeft de pellet niet met succes te verkrijgen en te eten.
4. Train de rat om te bereiken de pellet levering Rod (1 – 3 dagen)
   1. Lijn de pellet levering staaf met de zijkant van de bereikte sleuf contralaterale naar de rat voorkeur paw (gebruik een gids voor consistente plaatsing 1,5 cm vanaf de voorkant van de bereiken kamer). De bovenkant van de afleverings staaf moet worden uitgelijnd met de onderkant van de sleuf (Figuur 2b). Plaats een pellet op de afleverings staaf.
      Opmerking: positionering van de afleverings staaf tegenover de rat voorkeur poot maakt het moeilijk voor de rat om de pellet te verkrijgen met zijn niet-geprefereerde poot. We hebben geen problemen met ratten met behulp van hun niet-voorkeurs paw. Bij bepaalde modellen (bijv. een beroerte) kan dit echter nog steeds voorkomen en kan een beperking van het niet-voorkeurs bereik van de ledemaat worden toegevoegd.
   2. Aas de rat met een pellet gehouden met behulp van de Tang, maar direct de rat naar de leverings staaf zodat de poot raakt de pellet op de staaf. Als de rat de pellet van de staaf klopt, vervang deze dan. Sommige ratten kunnen in eerste instantie niet ver genoeg reiken. Verplaats in dit geval de pellet-afleverstang dichter bij de sleuf en beweeg deze vervolgens langzaam verder weg als de rat verbetert.
   3. Na ongeveer 5 – 15 geaasde bereikt de rat zal beginnen te bereiken voor de pellet op de levering staaf spontaan. Zodra de rat heeft geprobeerd 10 bereikt de levering Rod zonder te worden baited, het kan doorgaan naar de volgende fase.
5. Train de rat om een pellet (2 – 8 dagen) aan te vragen.
   Opmerking: Hoewel we hebben 100% succes training ratten te bereiken voor pellets hebben, ongeveer 10% van de ratten niet leren om een pellet te vragen door te bewegen naar de achterkant van de kamer.
   1. Plaats de pellet afleverings staaf op basis van de voorkeur van de rat en zet deze op stand 2 (Figuur 2a). Stel hoogte posities van de pellet afleverings staaf in met behulp van de actuator afstandsbediening. Het vasthouden van knoppen 1 en 2 beweegt tegelijkertijd de afleverings stang omhoog, terwijl de knoppen 3 en 2 worden verplaatst. Wanneer de afleverings staaf op de juiste hoogte is, houdt u het gewenste aantal ingedrukt totdat het lampje rood knippert om in te stellen.
   2. Plaats de rat in de kamer en aas de rat aan de achterkant met een pellet. Wanneer de rat ver genoeg beweegt naar de achterzijde van de kamer dat het de infraroodstraal zou breken als de automatische versie actief was, verplaats de pellet afleverings staaf naar positie 3 (Figuur 2b).
   3. Wacht tot de rat te bereiken voor de pellet en verplaats de pellet levering staaf terug naar positie 2 (Figuur 2a). Plaats een nieuwe pellet op de afleveringsstang als deze eraf is geslagen.
   4. Herhaal deze stappen, geleidelijk aan het bakelen van de rat steeds minder, totdat de rat begint te: (i) verplaatsen naar de rug om een pellet aan te vragen zonder te worden baited, en (II) onmiddellijk bewegen naar de voorkant na het aanvragen van een pellet in de rug. Zodra de rat dit 10 keer heeft gedaan, is het klaar voor training over de geautomatiseerde taak.

4. trainen van ratten met behulp van het geautomatiseerde systeem

1. Stel het geautomatiseerde systeem in.
   1. Zet de lampjes in de kamer aan en vul indien nodig het pelletreservoir aan.
   2. Plaats de pellet afleverings staaf volgens de voorkeur van de rat. Controleer of de actuator posities correct zijn ingesteld (zoals in Figuur 2a).
   3. Zet de computer aan en open het bekwame bereiken programma (SR_dig_extension_card_64bit_ (HOST) _ 3. VI). Voer het Rat-ID-nummer onder onderwerp in en selecteer de Paw- voor keur in het vervolgkeuzemenu hand . Geef het Bewaar pad voor de Video's op.
   4. Stel sessietijd en Max Video's in (aantal Video's waarop de sessie moet eindigen). Het programma stopt met het uitvoeren van de limiet die het eerst wordt bereikt.
   5. Set pellet Lift duur (duur van de tijd dat de levering staaf blijft in positie "3" nadat de rat vraagt om een pellet). Vroegtijdig bereik straf in-of uitschakelen (afleverings staaf wordt gereset naar positie "1" en vervolgens terug naar "2" als de rat bereikt voordat een pellet wordt aangevraagd).
2. Neem kalibratie beelden. De 3-D-traject reconstructie maakt gebruik van een computervision Toolbox om de juiste transformatie matrices te bepalen, waarvoor in elke weergave overeenkomende punten moeten worden geïdentificeerd. Gebruik hiervoor een kleine kubus met dambord patronen aan elke kant (Figuur 3).
   1. Plaats de helpende hand in de bereiken kamer en porren de alligator clip door de sleuf. Houd de kubus voor de sleuf met de alligator clip.
   2. Plaats de kubus zodanig dat de rode kant in de bovenste spiegel, de groene kant in de linker spiegel en de blauwe kant in de rechter spiegel verschijnt. Het hele gezicht van elk van de drie zijden moet zichtbaar zijn in de spiegels (Figuur 3).
   3. In het gedrags programma, zorg ervoor dat de ROI drempel is ingesteld op een zeer grote waarde (bijvoorbeeld 60000). Klik op de knop uitvoeren (witte pijl). Zodra de knop camera geïnitialiseerd groen wordt, drukt u op Start. Houd er rekening mee dat de video wordt opgehaald.
   4. Klik op CAL-modus. Neem vervolgens een afbeelding door te klikken op Take CAL image. Het pad naar de afbeeldingsmap wordt nu weergegeven onder '. png-pad ' met de PNG-bestandsnaam die is opgemaakt als ' GridCalibration_YYYYMMDD_img #. png '.
   5. Verplaats de kubus iets en neem een andere afbeelding. Herhaal dit voor een totaal van 3 afbeeldingen.
   6. Stop het programma door te klikken op Stop en vervolgens op de knop Stop Sign. Verwijder de helpende hand en kubus uit de doos.
   7. Wees voorzichtig om niets in de gedrags kamer te stoten nadat de kalibratie beelden die dag zijn genomen. Als er iets beweegt, moeten er nieuwe kalibratie beelden worden gemaakt.
3. Voer het geautomatiseerde systeem uit.
   Opmerking: Bepaal de "ROI Threshold"-instellingen (hieronder beschreven) voor elke mirror voordat u ratten uitvoert voor daadwerkelijke gegevensverzameling. Zodra deze instellingen zijn vastgesteld, vooraf instellen ze voordat u begint met het programma en aanpassen tijdens acquisitie indien nodig.
   1. Plaats de rat in de bekwame kamer. Klik op de witte pijl om het programma uit te voeren.
   2. Voordat u op Start, stelt u de positie van de ROI voor paw detectie door het aanpassen van x-offset (x-coördinaat van de linkerbovenhoek van de rechthoek ROI), y-offset (y-coördinaat van de linkerbovenhoek van de ROI), ROI breedte en ROI hoogte.
   3. Plaats de ROI in de zijspiegel die de dorsum van de poot toont, direct voor de sleuf (figuur 2c). Zorg ervoor dat de pelletleveringsstang niet in de ROI komt en dat de ROI niet in de doos uitreikt om te voorkomen dat de pellet of de vacht van de rat een video activeert wanneer de rat niet bereikt.
   4. Klik op Start om het programma te starten .
   5. Pas de waarde "lage ROI Threshold" totdat de "Live ROI trigger waarde" is oscillerend tussen "0" en "1" (wanneer de rat niet bereikt). Deze waarde is het aantal pixels binnen de ROI met intensiteitswaarden in het drempel bereik.
   6. Stel de ROI-drempelin. Observeer de Live ROI trigger waarde wanneer de rat de neus in de ROI en wanneer de rat bereikt voor de pellet. Stel de ROI drempel aanzienlijk groter zijn dan de "Live ROI trigger waarde" tijdens de neus Pokes en lager dan de "Live ROI trigger waarde" wanneer de rat bereikt. Pas aan totdat Video's consequent worden geactiveerd wanneer de rat bereikt, maar niet wanneer het zijn neus door de sleuf Pokes
      Opmerking: Dit veronderstelt dat de poot lichter gekleurd is dan de neus; de aanpassingen worden omgekeerd als de poot donkerder is dan de neus.
   7. Controleer de eerste paar proeven om ervoor te zorgen dat alles goed werkt. Wanneer een rat bereikt voor het aanvragen van een pellet (levering staaf in positie "2"), de "Early bereikt" nummer stijgt. Wanneer een rat bereikt na het aanvragen van een pellet (leverings staaf in positie "3"), het nummer "Video's" toeneemt en een video wordt opgeslagen als een. bin bestand met de naam "RXXXX_YYYYMMDD_HH_MM_SS_trial #".
      Opmerking: de standaard is voor Video's 300 frames (dat wil zeggen, 1 s) vóór en 1000 frames na de trigger-gebeurtenis (dit kan worden geconfigureerd in de software), die lang genoeg is om de gehele bereik-tot-greep-beweging, inclusief paw terugtrekking, te bevatten.
   8. Zodra de sessietijd of Max Video's is bereikt, stopt het programma. Druk op de knop Stop Sign.
   9. Reinig de kamer met ethanol en herhaal met een andere rat, of als gedaan voor de dag overgaan tot het converteren van Video's.
4. Converteer. bin bestanden naar. AVI bestanden.
   Opmerking: als u Video's comprimeert tijdens de overname, worden de binaire bestanden tijdens de overname naar de schijf gestreamd (gebruik een Solid State-schijf vanwege hoge overdrachtssnelheden). Deze binaire bestanden moeten off line worden gecomprimeerd of de opslagvereisten zijn buitensporig groot.
   1. Open het programma "bin2avi-color_1473R_noEncode. VI".
   2. Klik onder ' bestandspad-besturing ' op de knop map om de sessie te selecteren (bijvoorbeeld R0235_20180119a) die u wilt converteren. Herhaal dit voor elke sessie (maximaal zes).
   3. Klik op de witte pijl (uitvoeren) en vervolgens op "START" om te beginnen. U de videocompressie controleren in de algemene voortgang (%) Bar. Laat het programma 's nachts draaien.
   4. Voordat u begint met het trainen van dieren de volgende dag, Controleer of de Video's zijn geconverteerd en verwijder de. bin bestanden, zodat er genoeg ruimte is om nieuwe Video's te verwerven.

5. Video's analyseren met DeepLabCut

Opmerking: verschillende netwerken worden getraind voor elke paw-voorkeur (rechterpoot en linker poot) en voor elke weergave (directe weergave en linker spiegel weergave voor rechtse, gepaaide ratten, directe weergave en rechter spiegel weergave voor links gepaaide ratten). De bovenste spiegel weergave wordt niet gebruikt voor 3D-reconstructie-alleen om te detecteren wanneer de neus de sleuf binnenkomt, wat nuttig kan zijn om interventies te triggeren (bijv. optogenetica). Elk netwerk wordt vervolgens gebruikt voor het analyseren van een set van Video's bijgesneden voor de bijbehorende paw en weergave.

1. Train de DeepLabCut-netwerken (gedetailleerde instructies zijn beschikbaar in de DeepLabCut-documentatie op https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
   1. Creëer en configureer een nieuw project in DeepLabCut, een machine learning-algoritme voor een schatting van markerless pose¹³.
   2. Gebruik het programma om frames uit de bekwame Video's te halen en afbeeldingen bij te snijden in de weergave om (direct of Mirror View) op te nemen in de programma-interface. Snij frames groot genoeg zodat de rat en beide voorste poten zichtbaar zijn.
      Opmerking: voor netwerken zijn doorgaans 100 – 150 trainings frames vereist. Meer opleidings frames zijn nodig wanneer het Paw binnen in vergelijking met buiten de kamer vanwege verlichting. Nauwere bijsnijden verkort de verwerkingstijd, maar wees voorzichtig dat de bijgesneden gebieden groot genoeg zijn om het volledige traject van de Paw voor elke rat te detecteren. Het moet breed genoeg zijn voor het hele lichaam van de rat om te passen in het frame (direct zicht), en om zo ver terug in de kamer mogelijk te zien en voor de afleverings staaf (spiegelbeeld).
   3. Gebruik de programma-GUI om lichaamsdelen te labelen. Label 16 punten in elk frame: 4 metacarpophalangeale (MCP) gewrichten, 4 proximale interfalalangeale (PIP) gewrichten, 4-cijferige tips, de dorsum van de bereiken poot, de neus, de dorsum van de niet-bereiken poot, en de pellet (Figuur 4).
   4. Volg de instructies DeepLabCut (afgekort als DLC voortaan) om de traininggegevensset te maken, het netwerk te trainen en het getrainde netwerk te evalueren.
2. Analyseer Video's en Verfijn het netwerk.
   1. Voordat u alle Video's met een nieuw getraind netwerk analyseert, analyseert u 10 Video's om de prestaties van het netwerk te evalueren. Als er in bepaalde poses consistente fouten zijn, extraheert u aanvullende opleidingskaders met die poses en hertrain het netwerk.
   2. Bij het analyseren van Video's, zorg ervoor dat u uitvoer. CSV-bestanden, die zal worden ingevoerd in de code voor 3D traject reconstructie.

6. kalibratie van het vak

Opmerking: deze instructies worden gebruikt om de transformatie matrices te bepalen om punten te converteren die zijn geïdentificeerd in de directe en spiegel weergaven in 3D-coördinaten. Voor de meest actuele versie en meer informatie over het gebruik van het boxCalibration-pakket raadpleegt u het Leventhal Lab GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration, met stapsgewijze instructies voor het gebruik ervan.

1. Verzamel alle kalibratie beelden in dezelfde map.
2. Gebruik ImageJ/Fiji om de checkerboard-punten handmatig te markeren voor elke kalibratie afbeelding. Sla deze afbeelding op als ' GridCalibration_YYYYMMDD_ #. TIF ', waarbij ' YYYYMMDD ' de datum is waarop de kalibratie afbeelding correspondeert en ' # ' het afbeeldingsnummer voor die datum.
   1. Gebruik de meetfunctie in ImageJ (Selecteer in de werkbalk analyseren | Maatregel). Hiermee wordt een tabel weergegeven met coördinaten voor alle gemarkeerde punten. Sla dit bestand op met de naam ' GridCalibration_YYYYMMDD_ #. csv ', waarbij de datum en het afbeeldingsnummer hetzelfde zijn als het bijbehorende. TIF-bestand.
3. Open in het pakket Boxcalibration het bestand setParams. m. Dit bestand bevat alle vereiste variabelen en de bijbehorende beschrijving. Bewerk de variabelen zo nodig om aan de specificaties van het project te voldoen.
4. Voer de functie Kalibrateboxes uit. Er worden verschillende prompts weergegeven in het opdrachtvenster. De eerste prompt vraagt of alle afbeeldingen in de map moeten worden geanalyseerd. Als u Y typt, worden de prompts beëindigd en worden alle afbeeldingen voor alle datums geanalyseerd. Als u N typt, wordt de gebruiker gevraagd de te analyseren datums in te voeren.
   Opmerking: er worden twee nieuwe directory's gemaakt in de map kalibratie afbeeldingen: ' markedImages ' bevat PNG-bestanden met de door de gebruiker gedefinieerde schaakbord markeringen op de kalibratie afbeelding. De map ' boxCalibration ' bevat. mat-bestanden met de parameters voor de kalibratie van het vak.
5. Voer de functie Checkboxcalibration uit. Hiermee wordt een nieuwe map gemaakt, ' checkCalibration ' in de map ' boxCalibration '. Elke datum heeft een submap met de afbeeldingen en verschillende. Fig-bestanden, die worden gebruikt om te controleren of de kalibratie van het vak nauwkeurig is voltooid.

7. reconstrueren van 3D-trajecten

1. Assembleer de CSV-bestanden met de uitvoer van het leerprogramma in de mapstructuur die wordt beschreven in het script reconstruct3Dtrajectories .
2. Voer reconstruct3Dtrajectoriesuit. Dit script zal de mapstructuur doorzoeken en direct/mirror Points matchen op basis van hun namen in het scheve programma (het is belangrijk om dezelfde namen van lichaamsdelen te gebruiken in beide views).
3. Voer Calculatekinematicauit. Dit script extraheert eenvoudige kinematische kenmerken van de 3-D-traject reconstructies, die kunnen worden aangepast aan specifieke behoeften.
   Opmerking: de Software schat de positie van de verstopt lichaamsdelen op basis van hun buren en hun locatie in de complementaire weergave (bijv. de locatie van een lichaamsdeel in de directe cameraweergave beperkt de mogelijke locaties in de spiegel weergave). Voor tijden wanneer de Paw is verstopt in de mirror-weergave als deze door de sleuf loopt, worden paw-coördinaten geïntermuleerd op basis van naburige frames.

Resultaten

Ratten verwerven de bekwame bereiken taak snel eenmaal geacclimatiseerd aan het apparaat, met prestaties en in termen van zowel de aantallen bereikt en nauwkeurigheid over 1 – 2 weken (Figuur 5). Figuur 6 toont sample videoframes die wijzen op structuren die zijn geïdentificeerd door DeepLabCut, en Figuur 7 toont de bovenopgelegde individuele REACH-trajecten vanuit één sessie. Tot slot illustreren we in Figuur 8...

Discussie

Knaagdieren bekwaam bereiken is uitgegroeid tot een standaard instrument om motorische systeem fysiologie en pathofysiologie te bestuderen. We hebben beschreven hoe u een geautomatiseerde rat bekwame bereiken taak die het mogelijk maakt: training en testen met minimale toezicht, 3-D paw en Digit traject reconstructie (tijdens het bereiken, grijpen en paw terugtrekking), real-time identificatie van de Paw tijdens het bereiken en synchroniseren met externe elektronica. Het is zeer geschikt voor het correleren van forelimb ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
clear polycarbonate panels	TAP Plastics		cut to order (see box design)
infrared source/detector	Med Associates	ENV-253SD	30" range
camera	Basler	acA2000-340kc	2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link
camera lens	Megapixel (computar)	M0814-MP2	2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus
camera cables	Basler	#2000031083	Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables
mirrors	Amazon
linear actuator	Concentrics	LACT6P	Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer
pellet reservoir/funnel	Amico (Amazon)	a12073000ux0890	6" funnel
guide tube	ePlastics	ACREXT.500X.250	1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long
pellet delivery rod	ePlastics	ACRCAR.250	0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length)
plastic T connector	United States Plastic Corp	#62065	3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee
LED lights	Lighting EVER	4100066-DW-F	12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool
Light backing	ePlastics	ACTLNAT0.125X12X36	0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet
Light diffuser films	inventables	23114-01	.007x8.5x11", matte two sides
cabinet and custom frame materials	various (Home Depot, etc.)		3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure)
acoustic foam	Acoustic First		FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick)
ventilation fans	Cooler Master (Amazon)	B002R9RBO0	Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers
cabinet door hinges	Everbilt (Home Depot	#14609	continuous steel hinge (1.4" x 48")
cabinet wheels	Everbilt (Home Depot	#49509	Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake
cabinet door handle	Everbilt (Home Depot	#15094	White light duty door pull (4.5")
computer	Hewlett Packard	Z620	HP Z620 Desktop Workstation
Camera Link Frame Grabber	National Instruments	#781585-01	PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full
Multifunction RIO Board	National Instruments	#781100-01	PCIe-17841R
Analog RIO Board Cable	National Instruments	SCH68M-68F-RMIO	Multifunction Cable
Digital RIO Board Cable	National Instruments	#191667-01	SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series
Analog Terminal Block	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
Digital Terminal Block	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
24 position relay rack	Measurement Computing Corp.	SSR-RACK24	Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel
DC switch	Measurement Computing Corp.	SSR-ODC-05	Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A
DC Sense	Measurement Computing Corp.	SSR-IDC-05	solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC
DC Power Supply	BK Precision	1671A	Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply
sugar pellets	Bio Serv	F0023	Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored)
LabVIEW	National Instruments	LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions	64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW
MATLAB	Mathworks	Matlab R2019a	box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox