Methodenartikel

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

DOI:

10.3791/59980

⸱

15 oktober 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Iowa, 2Medical Scientist Training Program, University of Iowa, 3Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 4Graduate Program in Molecular Medicine, University of Iowa

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreven is een vereenvoudigde standaard werkings procedure voor microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing en analyse met behulp van vrij beschikbare instrumenten. Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het microbiome veld en degenen die updates vereisen over methoden om bacteriële profilering bij een hogere resolutie te bereiken helpen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De menselijke darm wordt gekoloniseerd door triljoenen bacteriën die fysiologische functies ondersteunen zoals voedsel metabolisme, energie oogsten, en regulering van het immuunsysteem. Perturbatie van de gezonde gut microbiome is gesuggereerd om een rol te spelen bij de ontwikkeling van ontstekingsziekten, met inbegrip van multiple sclerose (MS). Milieu-en genetische factoren kunnen de samenstelling van het microbiome beïnvloeden; Daarom is de identificatie van microbiële gemeenschappen in verband met een fenotype ziekte de eerste stap geworden naar het definiëren van de rol van het microbiome in gezondheid en ziekte. Gebruik van 16S rRNA metagenomic sequencing voor profilering bacteriële Gemeenschap heeft geholpen bij het bevorderen van microbiome onderzoek. Ondanks het brede gebruik is er geen uniform protocol voor 16S rRNA-gebaseerde taxonomische profilerings analyse. Een andere beperking is de lage resolutie van taxonomische toewijzing als gevolg van technische moeilijkheden zoals kleinere sequentiëren, evenals het gebruik van alleen voorwaartse (R1) leesbewerkingen in de uiteindelijke analyse als gevolg van lage kwaliteit van omgekeerde (R2) leesbewerkingen. Er is behoefte aan een vereenvoudigde methode met een hoge resolutie om de bacterie diversiteit in een bepaald biospecimen te karakteriseren. Verbeteringen in sequentiëren van technologie met de mogelijkheid om langere leesbewerkingen bij hoge resolutie te sequenties hebben geholpen om een aantal van deze uitdagingen te overwinnen. Huidige sequencing technologie in combinatie met een algemeen beschikbare metagenomic analyse pijpleiding, zoals R-gebaseerde Divisive Amplicon die het algoritme-2 (DADA2) heeft geholpen om microbiële profilering bij hoge resolutie te voorkomen, omdat DADA2 sequentie kan toewijzen aan het genus en soorten. Hier beschreven is een gids voor het uitvoeren van bacteriële profilering met behulp van tweestapsversterking van de v3-v4-regio van het 16S rRNA-gen, gevolgd door analyse met behulp van vrij beschikbare analysetools (d.w.z. DADA2, Phyloseq en METAGENassist). Er wordt aangenomen dat deze eenvoudige en volledige workflow zal dienen als een uitstekend hulpmiddel voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van microbiome profilering studies.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbiota verwijst naar een verzameling van micro-organismen (bacteriën, virussen, Archaea, bacteriofagen en schimmels) die in een bepaalde omgeving leven, en de microbiome verwijst naar het collectieve genoom van ingezeten micro-organismen. Aangezien bacteriën een van de meest voorkomende microben bij mensen en muizen zijn, is deze studie alleen gericht op bacteriële profilering. De menselijke darm wordt gekoloniseerd door triljoenen bacteriën en honderden bacteriële stammen1. De normale gut microbiota speelt een vitale rol bij het handhaven van een gezonde staat in de gastheer door het reguleren van functies (dat wil zeggen, onderhoud van een intacte intestinale barrière, voedsel metabolisme, energie homeostase, remming van de kolonisatie door pathogene organismen, en regulering van de immuunresponsen)2,3,4,5. Compositorische perturbaties van de darm microbiota (gut dysbiosis) zijn gekoppeld aan een aantal menselijke ziekten, met inbegrip van gastro-intestinale stoornissen6, obesitas7,8, beroerte9, Cancer10, diabetes8,11, reumatoïde artritis12, allergieën13, en het centrale zenuwstelsel-gerelateerde ziekten zoals multiple sclerose (MS)14,15 en de ziekte van Alzheimer ziekte (AD)8,16. Daarom, in de afgelopen jaren, is er groeiende belangstelling voor instrumenten voor het identificeren van bacteriële samenstelling op verschillende lichaam sites. Een betrouwbare methode moet kenmerken hebben zoals hoge doorvoer en eenvoudig te gebruiken, met de mogelijkheid om bacteriële microbiota met hoge resolutie te classificeren, en lage kosten.

Op cultuur gebaseerde microbiologische technieken zijn niet gevoelig genoeg om het complexe darmmicrobioom te identificeren en karakteriseren als gevolg van het falen van verschillende darmbacteriën om in cultuur te groeien. De opkomst van de sequencing-gebaseerde technologie, met name 16S rRNA gebaseerde metagenomische sequencing, heeft een aantal van deze uitdagingen overwonnen en getransformeerd microbiome onderzoek17. Geavanceerde 16S rRNA-gebaseerde sequentie technologie heeft geholpen bij het vaststellen van een cruciale rol voor het microbioom van de darmen in de menselijke gezondheid. Het humane Microbiome project, een National Institutes of Health Initiative18, en het metahit project (een Europees initiatief)19 hebben beiden geholpen bij het opzetten van een basiskader voor Microbiome analyse. Deze initiatieven hielpen een kick-start van meerdere studies om de rol van het microbioom van de darmen in de menselijke gezondheid en ziekte te bepalen.

Een aantal groepen hebben aangetoond gut dysbiosis bij patiënten met ontstekingsziekten12,14,15,20,21,22. Ondanks dat het op grote schaal wordt gebruikt voor taxonomische profilering vanwege het vermogen tot multiplex en lage kosten, zijn er geen uniforme protocollen voor 16S rRNA-gebaseerde taxonomische profilering. Een andere beperking is de lage resolutie van taxonomische toewijzing als gevolg van kleinere sequentiëren leesbewerkingen (150 BP of 250 BP) en het gebruik van alleen voorwaartse sequentiëring lezen (R1) als gevolg van lage kwaliteit omgekeerde sequencing leest (R2). Echter, vooruitgang in de sequencing technologie hebben geholpen om een aantal van deze uitdagingen te overwinnen, zoals de mogelijkheid om sequenties langere leesbewerkingen met behulp van gepaarde eind leesbewerkingen (bijvoorbeeld, Illumina MiSeq 2x300bp).

De huidige sequencing technologie kan sequentie 600 BP goede kwaliteit leest, die het mogelijk maakt samenvoeging van R1 en R2 leest. Deze samengevoegde langere R1 en R2 leesbewerkingen toestaan betere taxonomische toewijzingen, met name met open-toegang op basis van R gebaseerde Divisive Amplicon te geven algoritme-2 (DADA2) platform. DADA2 maakt gebruik van ampliconlengte voor temp sequence variant (ASV)-gebaseerde opdrachten in plaats van de operationele taxonomische eenheid (Otu) toewijzingen op basis van 97% gelijkenis gebruikt door qiime23. ASV Matches resulteren in een exacte sequentie match in de database binnen 1 – 2 nucleotiden, wat leidt tot toewijzing op genus-en soorten niveau. Dus, de combinatie van langere, goede kwaliteit gepaarde Lees-en betere taxonomische toewijzings tools (zoals DADA2) hebben microbiome studies getransformeerd.

Hier is een stapsgewijze handleiding voor het uitvoeren van bacteriële profilering met behulp van twee-stap versterking van de v3-v4 regio van 16S rRNA en data-analyse met behulp van DADA2, Phyloseq, en METAGENassist pijplijnen. Voor deze studie worden humane leukocytenantigeen (HLA) klasse II-transgene muizen gebruikt, aangezien bepaalde HLA klasse II-allelen zijn gekoppeld aan een aanleg voor auto-immuunziekten zoals MS20,24,25. Echter, het belang van HLA klasse II genen bij het reguleren van de samenstelling van gut microbiota is onbekend. Het is veronderstelde dat de HLA klasse II molecuul zal beïnvloeden gut microbiële Gemeenschap door te selecteren voor specifieke bacteriën. Grote histocompatibility complex (MHC) klasse II knock-outmuizen (AE Ko) of muizen die humane HLA-DQ8 moleculen (HLA-DQ8)24,25,26 uitdrukken, werden gebruikt om het belang van HLA klasse II moleculen te begrijpen in het vorm geven van de darm microbiële Gemeenschap. Er wordt aangenomen dat deze volledige en vereenvoudigde workflow met R-gebaseerde data-analyse zal dienen als een uitstekend hulpmiddel voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van microbiome profilering studies.

De generatie van muizen ontbreekt endogene Murine MHC klasse II genen (AE KO) en AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) transgene muizen met een C57BL/6J achtergrond is eerder beschreven26. Fecale monsters worden verzameld van muizen van beide geslachten (8 – 12 weken oud). Muizen werden eerder gefokt en onderhouden in de Universiteit van Iowa Animal Facility volgens de NIH en institutionele richtlijnen. Strategieën voor verontreinigingsbeheersing zoals het spenen van de muizen in een laminaire stromings kast, het verwisselen van handschoenen tussen verschillende stammen van muizen en het correct onderhoud van muizen zijn cruciale stappen voor profilering van het microbioom van de darmen.

Goede persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) worden ten zeerste aanbevolen tijdens de gehele procedure. Geschikte negatieve controles moeten worden opgenomen bij het uitvoeren van DNA-isolatie, PCR1 en PCR2 versterking en sequentiëren stappen. Het gebruik van steriele, DNase-vrije, RNase-vrije en pyrogene-vrije voorraden wordt aanbevolen. Aangewezen pipet voor microbioom werk en gefilterde pipetpunten moeten in het hele protocol worden gebruikt. Microbiota-analyse bestaat uit zeven stappen: 1) fecale monsterverzameling en-verwerking; 2) extractie van DNA; 3) 16S rRNA genamplificatie; 4) DNA-bibliotheek constructie met behulp van geïndexeerde PCR; 5) opschonen en kwantificering van de geïndexeerde PCR (Library); 6) MiSeq-sequencing; en 7) gegevensverwerking en sequentieanalyse. Een schematisch diagram van alle protocol stappen wordt weergegeven in Figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol werd goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Iowa.

1. fecale Monsterverzameling en-behandeling

  1. Steriliseer de scheidings boxen (Zie tabel van de materialen, aanvullend figuur 1) met 70% ethanol.
  2. Pre-label microcentrifuge buizen (één per muis) met de monster-ID en de behandelingsgroep (indien van toepassing).
  3. Plaats de muizen in gesteriliseerde scheidings boxen en laat ze normaal tot 1 uur poeren.
  4. Verzamel de fecale pellets in een lege, vooraf gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buis met behulp van steriele Tang en sluit de buis stevig. Steriliseer de Tang na het verzamelen van elke muis.
  5. Plaats de microcentrifuge buis die fecale pellets bevat in een vriezer van 80 °C tot verdere verwerking.
    Opmerking: De scheidings boxen zijn voordelig omdat ze gelijktijdige verzameling van fecale monsters van meerdere muizen (tot 12) tegelijk toelaten.

2. extractie van DNA

  1. Verwijder de fecale monsters (muis of mens) uit de vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur (RT).
    Opmerking: Het is raadzaam om menselijke ontlasting monsters 's nachts bij 4 °C te ontdooien voor het verzamelen van 200 mg of de vereiste hoeveelheid uit voorraad monsters.
  2. Gebruik 200 mg uitgangsmateriaal en elueer DNA tot een eindvolume van 50 μL.
  3. Neem een DNA isolatie kit leeg waarin geen fecale monster wordt toegevoegd, maar wordt verwerkt door alle DNA-extractie stappen.
    Opmerking: Er werd een specifieke DNA-isolatiekit (Zie tabel met materialen) gebruikt, omdat het specifieke reagentia bevat om remmende materialen zoals biovaste stoffen, onverteerd plant materiaal en heem-verbindingen van gelyseerde rode bloedcellen in de menselijke en muis kruk te verwijderen Monsters.
  4. Plaats de kraal buis in een homogenisator (Zie tabel met materialen) en homogeniseren de monsters voor 45 s bij RT en een snelheid van 4,5 m/s.
    Opmerking: Kraal-kloppende homogenisator van elke fabrikant kan worden gebruikt. Het wordt echter aanbevolen om de methode te standaardiseren, met name de snelheid en duur van homogenisatie, bij gebruik van kraal-kloppende homogenisator van een andere leverancier.
  5. Isoleer DNA van individuele muizen fecale monsters met behulp van een bacteriële DNA-isolatiekit volgens het Protocol van de fabrikant (Zie tabel met materialen) met kleine wijzigingen. Kwantificeer het geïsoleerde DNA door 1 μL van het DNA op een Fluorimeter een of op de hoge gevoeligheid elektroforese chip te laden (Zie tabel met materialen).
    Opmerking: Het verwachte rendement van DNA kan variëren van 500 – 2500 ng bij aanvang met 200 mg van het fecale monster.
  6. Stel de concentratie van het DNA in op 4 – 20 ng/μL met behulp van elutie buffer. Requantify het DNA (zoals gedaan in stap 2,5) voordat u doorgaat naar 16S rRNA genamplificatie (PCR1), als PCR1 niet op dezelfde dag wordt uitgevoerd.

3.16S rRNA Genamplificatie (PCR1)

  1. Stel 16S rRNA Gene Amplification (PCR1) in een 96 goed PCR-plaat in met een reactievolume van 25 μL.
  2. Voeg met behulp van een multichannel-pipet 12,5 μL van 2x High-Fidelity polymerase-enzym mengsel inclusief buffer toe, naast Dntp's (Zie tabel met materialen): 40 ng van het DNA in maximaal 10,5 μL totaal volume (pas het totale volume aan met PCR-niveau water): 1 μL (elk) van voorwaartse en reverse primers bij 1 μM-concentratie.
    Opmerking: Sequenties van de primers zijn als volgt:
    voorwaartse primer = 5 '-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3 ' reverse primer = 5 '-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC C-3 '. Neem een kit leeg uit stap 2,3 (kit reagens Control) in de PCR-plaat.
  3. Sluit de PCR-plaat af en centrifugeer 1.000 bij 20 °c gedurende 1 minuut bij een tafel plaat centrifuge (Zie tabel met materialen) en voer PCR uit in een thermische cycler die is geprogrammeerd voor: 95 °c gedurende 3 minuten; 25 cycli van 1) 95 °C voor 30 s, 2) 55 °C gedurende 30 s, 3) 72 °C gedurende 30 s; laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 minuten; en houd deze vast bij 4 °C.
    Opmerking: Hoewel deze 16S rRNA Gene amplificatie methode met verschillende soorten biospecimens zou moeten werken, is het aan te raden om het aantal versterkings cycli te standaardiseren bij het starten van een nieuw project.
  4. Bevestig de grootte van PCR1 product door 1 μL van het DNA op een hoge gevoeligheid elektroforese chip te laden. U ook 5 μL 16S rRNA-versterkt product uitvoeren op een 1,5% agarose gel om 550 BP van het PCR1 product te bevestigen.
    Opmerking: Clean-up van 16S rRNA versterkte product is optioneel en is afhankelijk van de DNA-isolatie kit/methode die wordt gebruikt. Als u een in-House DNA-isolatiemethode gebruikt, kan PCR1 product worden gereinigd met behulp van een microbiome DNA-zuiverings pakket volgens het Protocol van de fabrikant (Zie tabel met materialen). De DNA-isolatie kit die hier wordt gebruikt, levert een ultrapuur DNA op en vereist geen clean-up van het PCR1-product.

4. DNA-bibliotheek constructie met behulp van geïndexeerde PCR (PCR2)

  1. Plaats de bargecodeerde primers index 1 en index 2 in een speciaal rek (zie tabel met materialen) voor 96 bibliotheken.
    1. Rangschik index 1 primer in de kolommen 1 – 12 en index 2 primer in rijen A – H van het speciale rek.
    2. Voeg 2,5 μL index 1 toe in de kolommen 1 – 12 en index 2 in rijen A – H met behulp van multikanaalspipetten. Plaats de nieuwe dop (Zie tabel van de materialen) op index 1 en index 2 adopter primers en bewaar deze in een vriezer van-20 °c.
  2. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 12,5 μL 2x High-Fidelity polymerase-enzym mix met een buffer toe, naast Dntp's (Zie tabel met materialen); 5 μL PCR-niveau water en 2,5 μL 16S rRNA-versterkt product.
    Opmerking: Voeg unieke indices toe aan elk sample voor multiplexing van meer dan 96 bibliotheken in één run, zoals beschreven in Kiernan et al.27. Het huidige protocol maakt gebruik van adapters van een commerciële Kit (bijv. nextera XT index Kit) volgens de instructies van de fabrikant in de 16s metagenomica sequencing methode (bijvoorbeeld Illumina).
  3. Seal en centrifuge de geïndexeerde PCR-plaat op 1.000 x g bij 20 °c gedurende 1 minuut en voer PCR uit in een thermische cycler die is geprogrammeerd voor: 95 °c gedurende 3 minuten; 8 cycli van 1) 95 °C voor 30 s, 2) 55 °C voor 30 s, 3) 72 °C gedurende 30 s; en laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min.
  4. Bevestig de basisgrootte van de 630 van het geïndexeerde PCR-product door 1 μL DNA te laden op een elektroforese chip met hoge gevoeligheid. U ook 5 μL geïndexeerd PCR-product uitvoeren op een 1,5% agarose-gel om de grootte en intensiteit van het product te bevestigen.

5. opschoon van geïndexeerde PCR (PCR2) en kwantificering

  1. Zwembad 5 μL PCR2 ampliconlengte voor Temp met behulp van multichannel pipetten van elke put in een meerkanaals reservoir tray vrij van detecteerbaar DNase, RNase, menselijk DNA, en pyrogene bacteriën (Zie tabel van materialen).
  2. Breng het gepoolde product van de multichannel reservoir tray over in een lege, voorgelabelde 1,5 mL micro centrifugebuis en Vortex om te mengen.
  3. Reinig PCR2 product met behulp van standaard magnetische kralen Kit (Zie tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant. Afdichting en bewaar de resterende 20 μL PCR2 in dezelfde plaat bij-80 °C voor verder gebruik, indien nodig.
  4. Bereid verse 80% ethanol voor door 4 mL 100% ethanol toe te voegen aan 1 mL PCR-grade water.
  5. Evenwichts de magnetische kraal naar RT en Vortex voor 30 s om de parels gelijkmatig te dispergeren.
  6. Kort Vortex en draai de gepoolde PCR2 ampliconlengte voor temp samples.
  7. Voeg 80 μL magnetische kralen toe aan een voorgelabelde, steriele micro centrifugebuis van 1,5 mL met 80 μL gepoolde PCR-producten, Vortex en draai kort om de magnetische kralen gelijkmatig te respenderen.
  8. Inbroed de inhoud op RT zonder de buisjes gedurende 15 minuten te storen.
  9. Plaats de buis met het DNA en magnetische parels op een magnetische standaard (Zie tabel met materialen) gedurende 5 minuten.
  10. Verwijder en gooi 150 μL van het supernatant voorzichtig weg.
  11. Voeg 200 μL vers bereide 80% ethanol toe zonder de kralen te storen en inincuberen voor 30 sec.
  12. Verwijder voorzichtig en gooi alle supernatant weg.
  13. Herhaal stap 5.11 – 5.12. Verwijder het resterende volume met een P10-pipet. Laat de kralen 15 minuten in de lucht drogen, waarbij de index PCR-buis op de magnetische standaard blijft staan.
  14. Verwijder de magnetische standaard. Voeg 33 μL elutie buffer (elutie buffer van DNA-Kit is aanvaardbaar) toe. Vortex goed en voer een snelle draai uit om eventuele resterende vloeistof aan de zijkant te verwijderen. Inbroed gedurende 2 minuten en plaats op de magnetische standaard gedurende 5 min.
  15. Breng 30 μL van de supernatant (schone PCR-producten) over in een voorgelabelde micro centrifugebuis van 1,5 mL.
  16. Kwantificeer het gezuiverde zwembad door 1 μL van het gezuiverde zwembad op een Fluorimeter een of een hoge gevoeligheid elektroforese chip te laden, omdat dit tijdens het sequentiëren nodig is. Voer de MiSeq uit zoals hieronder beschreven.

6. MiSeq-sequencing

  1. Maak een voorbeeldblad met voorbeeld specifieke barcode-informatie voor de werkstroom metagenomica en demultiplexing op het miseq-instrument (Zie tabel met materialen). Upload dit voorbeeldblad naar de software (bijvoorbeeld Illumina experiment Manager).
  2. Verdun de gepoolde bibliotheken van stap 5,15 tot 4 nM.
  3. Denature gepoolde bibliotheken door 5 μL van het 4 nM-bibliotheek zwembad te combineren met 5 μL vers bereide 0,2 M NaOH in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Draai Vortex kort om te mengen, centrifugeer kort en inincuberen gedurende 5 min bij Ambient RT.
  4. Voeg 990 μL ijskoude hybridisatie buffer (HB-buffer) toe en Pipetteer zachtjes om te mengen. Dit zal een bibliotheek van 20 pM opleveren.
  5. Combineer 2 μL van de 10 nM-controle bibliotheek met 3 μL EBT-buffer (10 mM tris-HCl, pH = 8,5, met 0,1% Tween 20) om een controle bibliotheek van 4 nM te leveren. Voeg 5 μL vers bereide 0,2 N NaOH en Vortex kort toe om te mengen. Inincuberen gedurende 5 minuten bij RT.
  6. Voeg 990 μL ijskoude hybridisatie buffer (HB-buffer) toe en Pipetteer zachtjes om te mengen. Dit zal 20 pM-controle bibliotheken opleveren.
    Opmerking: gedenatureerde 20 pM-regel bibliotheken kunnen tot 4 weken bij-20 °C worden bewaard. Na 4 weken hebben cluster nummers de neiging te dalen.
    1. Combineer 210 μL van de 20 pM-bibliotheek met 40 μL van de controle bibliotheek van 20 pM (eindconcentratie = ~ 18%) en Voeg 350 μL HB-buffer toe. Laad de bibliotheek met een eindconcentratie van 7 uur.
      Opmerking: Invoergegevens moeten worden aangepast volgens de prestaties van de uitvoering.
  7. Inincuberen monsters gedurende 2 minuten bij 96 °C. Zet het ijs 5 min. Laad 600 μL van het eind zwembad in de juiste put van de MiSeq-cartridges.
    Opmerking: Sectie 6 hierboven kan worden uitgevoerd in een genomic/DNA-kern faciliteit.

7. gegevensverwerking en sequentieanalyse

  1. Gebruik R-software (versie 3,5) voor DADA2 gegevensverwerking en-analyses. Voor stappen 7.1 – 7.4, gebruik de Open-Access software zoals uiteengezet in de eerder ontwikkelde DADA2 online tutorial gevonden op < https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html >.
    Opmerking: Een gemakkelijk bruikbaar R-script is bijgevoegd als een aanvullend bestand 2en gebruikers moeten de naam en de bron van sequentiëren bestanden wijzigen (BIJV. SAMPLENAME_R1_001. fastq en SAMPLENAME_R2_001. fastq).
  2. Visualiseer de kwaliteits profielen van de voorwaartse en omgekeerde leesbewerkingen met behulp van de opdracht Plotqualityprofile .
  3. Trim nucleotiden van voorwaartse en omgekeerde leesbewerkingen op basis van het kwaliteits perceel. Deze parameters worden opgegeven door de parameter truncLen in DADA2.
    Opmerking: Hier wordt 280 gebruikt als de lengte drempel waarvoor de voorwaartse leesbewerkingen zouden worden genegeerd en 260 wordt gebruikt als de lengte drempel waarvoor de omgekeerde leesbewerkingen zouden worden genegeerd.
  4. De RAW 16s gegevens verwerken als fastq bestanden door de DADA2 pipeline zoals uiteengezet in de online tutorial (te vinden op < https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html >) om samen te voegen R1 en R2 leest en vorm ampliconlengte voor temp sequentie varianten (asv's), die vervolgens worden gebruikt om toe te wijzen taxa met de Silva Reference database23.
    Opmerking: een voorbeeld ampliconlengte voor temp sequentie variant tabel gegenereerd uit de DADA2 pipeline is opgenomen als aanvullend bestand 3. Ofwel een Greengene of Silva referentiedata Base kan worden gebruikt, als er geen verschillen in bacteriële classificatie werden gevonden met behulp van een van deze databases.
  5. Genereer een door de gebruiker gedefinieerd toewijzingsbestand dat de metagegevens (d.w.z. genotype, geslacht, behandeling, enz.) voor elk monster bevat. Een voorbeeldbestand met metagegevens is opgenomen als aanvullend bestand 4.
  6. Bereken alpha Diversity (Shannon index) en Beta diversiteit met behulp van de belangrijkste coördinaten analyse (PCA) op basis van de verheven Otu telt met behulp van phyloseq28 zoals uiteengezet in de online tutorial, te vinden op < https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html >.
  7. Voer de volgende analyse uit in METAGENassist29.
    Opmerking:     Voer de differentiële abundantie analyse uit met behulp van de Wilcoxon Rank-Sum test op het genus niveau. Heatmaps en differentieel overvloedige taxa worden gemarkeerd met behulp van METAGENassist29, een openbare en webgebaseerde analyse pijplijn.
    1. Upload de taxonomische abundantie tabel (CSV-indeling) en selecteer voor beelden in de kolom.
    2. Upload het toewijzingsbestand (CSV-indeling) en selecteer voor beelden in een rij.
    3. Selecteer Opties om variabelen met meer dan 50% nullen te verwijderen en niet-toegewezen en niet-toegewezen leesbewerkingen uit te sluiten.
    4. Selecteer Opties om rijen te normaliseren op som en log normaliseren kolommen.
    5. Maak een vulkaan, PCA of plsda plot door te klikken op dezelfde in de linker kolom en klik op voor beelden verwijderen naam om de grafiek te maken.
    6. Voer een t-toets uit (als er slechts twee groepen zijn) of ANOVA (indien groter dan twee groepen) om de kenmerken (bacteriën) te visualiseren die tussen groepen verschillen. Klik op geselecteerde functies om specifieke bacteriën te visualiseren die tussen groepen verschillen.
    7. Klik op dendrogram of heatmap om de betreffende percelen te maken. Er kunnen aanvullende analyses worden uitgevoerd, zoals voorbeeld visualisatie per groep of t-toets/op ANOVA gebaseerde top 25-functies.
    8. Klik op randomforest om grafieken te maken met functies die kunnen worden gebruikt voor classificatie. Klik op het tabblad variantie bovenaan om grafieken te maken voor de topfuncties die verschillen tussen/tussen groepen. Klik op functie Details om een lijst met bacteriën te zien die tussen groepen verschillen en klik op elke bacterie om een grafische samenvatting van hetzelfde te maken.
    9. Klik op het tabblad outlier bovenaan om voorbeelden te visualiseren die uitschieters zijn.
    10. Klik ten slotte op Download en selecteer 1) een zip-bestand met alle uitgevoerde analyses of 2) de gewenste functies om te downloaden. Dit bestand moet worden opgeslagen als een unieke naam en moet worden uitgepakt voordat het wordt gebruikt.

Opmerking: Voor gedetailleerde statistische tests uitgevoerd tijdens microbiome analyse, verwijzen naar de werken van Chen et al. en hugerth et al.14,30.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangezien MHC klasse II moleculen (HLA bij mensen) centrale spelers zijn in de adaptieve immuunrespons en sterke associaties vertonen met een aanleg voor MS24,25,26, was het veronderstelde dat het HLA klasse II molecuul darm microbiële samenstelling zou beïnvloeden. Daarom werden Muizen zonder het MHC klasse II gen (AE KO) of het uitdrukken van humaan HLA-DQ8 gen (HLA-DQ8) gebruikt om het belang van HLA klasse II moleculen in he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven protocol is eenvoudig, met gemakkelijk te volgen stappen voor het uitvoeren van microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing van een groot aantal biospecimens van belang. De volgende generatie sequencing heeft microbiële ecologie studies getransformeerd, vooral in humane en preklinische ziekte modellen31,32. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om complexe microbiële composities (culturable en nie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. M. ontving royalty's van Mayo Clinic (betaald door Evelo Biosciences) als een van de uitvinders van een technologie die aanspraak maken op het gebruik van Prevotella histicola voor de behandeling van auto-immuunziekten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen de financiering van de NIAID/NIH (1R01AI137075-01), de Carver Trust Medical Research Initiative Grant, en het University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL Natural Microcentriguge TubeUSA, Scientific1615-5500Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G3M, MN, US7100038651Squeeger voor correct afdichten van PCR-plaat
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter, IN, USAA63880PCR-zuivering, NGS-opruiming, PCR-opruiming
Agilent DNA 1000 REAGENTAgilent Technologies, CA, USA5067-1504DNA-kwantificering en kwaliteitscontrole
Bioanalyzer DNA 1000 chipAgilent Technologies, CA, USA5067-1504DNA-kwantificering en kwaliteitscontrole
Index Adopter Replacement CapsIllumina, Inc., CA, USA15026762Nieuwe dop voor Index 1 en 2 adapter-primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil KitMoBio nu onderdeel van QIAGEN, Valencia, CA, USA12855-100DNA-isolatie
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)Kapa Biosystem, MA, USAKK2602PCR-klare mix voor Amplicon PCR1 en geïndexeerde PCR2
Lewis Divider BoxesLewis Bins, WI, USND03080Fecal collection
Magnetic standNew England BioLabs, MA, USAS1509SVoor PCR-opruiming
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4346906PCR-plaat
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4311971PCR-plaat afdichting
Microfuge 20 CentrifugeBeckman Coulter, IN, USAB30154Centrifuge gebruikt voor DNA-isolatie
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3Illumina, Inc., CA, USAMS-102-3003Voor MiSeq-sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation KitIllumina, Inc., CA, USAFC-131-100116S rRNA DNA-bibliotheekvoorbereiding
Reagent Reservoirs Multichannel TraysASI, FL,USARS71-1Voor het poolen van PCR2-product
Plate CetrifugeThermo Fisher Scientific, CA, USA75004393Voor PCR-reagensmenging en het verwijderen van luchtbellen uit de plaat
PhiX ControlIllumina, Inc., CA, USAFC-110-3001Voor MiSeq-sequencingcontrole
Microbiome DNA Purification KitThermo Fisher Scientific, CA, USAA29789Voor zuivering van PCR1-product
PowerLyzer 24 HomogenizerOmni International, GA, USA19-001Bead beater voor DNA-isolatie
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kitThermo Fisher Scientific, CA, USAQ32854DNA-kwantificering
TruSeq Index Plate FixtureIllumina, Inc., CA, USAFC-130-1005Voor het rangschikken van de indexprimers
Vertical Dividers (large)Lewis Bins, WI, USDV-2280Fecal collection
Vertical Dividers (small)Lewis Bins, WI, USDV-1780Fecal collection

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
  2. Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
  3. Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
  4. Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
  5. Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
  6. Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
  7. Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
  8. Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
  9. Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
  10. Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
  11. Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695(2018).
  12. Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189(2017).
  13. Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
  14. Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484(2016).
  15. Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
  16. Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
  17. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
  18. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
  19. Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, Suppl 1 23-28 (2010).
  20. Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015(2016).
  21. Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429(2015).
  22. Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
  25. Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
  26. Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
  27. Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
  28. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217(2013).
  29. Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
  30. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561(2017).
  31. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617(2015).
  32. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
  33. Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
  34. Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649(2013).
  35. Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
  36. Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
  37. Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462(2019).
  38. Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
  39. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52(2017).
  40. Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
  41. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
  42. Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112(2014).
  43. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24(2016).
  44. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87(2014).
  45. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564(2014).
  46. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
  47. Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
  48. Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
  49. Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

16S rRNA sequencingNext generation sequencingbacteri le DNA isolatieverwerking van fecale monstersDADA2 analysePhyloseq analyseMETAGENassist analyseamplificatie van de V3 V4 regio

Gerelateerde artikelen