Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59982

⸱

2 augustus 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Cellular Neurophysiology, Institute of Physiology CAS

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.

Samenvatting

Cellulaire reacties op externe stimuli sterk vertrouwen op de set van receptoren uitgedrukt in het celoppervlak op een bepaald moment. Dienovereenkomstig, de populatie van oppervlakte-uitgedrukte receptoren is voortdurend aan te passen en onderworpen aan strenge mechanismen van regulering. Het paradigmatische voorbeeld en een van de meest bestudeerde evenementen in de biologie is de gereguleerde controle van de synaptische expressie van glutamaat receptoren (GluRs). GluRs bemiddelen de overgrote meerderheid van de excitatory transmissie in het centrale zenuwstelsel en controle fysiologische activiteit-afhankelijke functionele en structurele veranderingen op de synaptische en neuronale niveaus (bijv., synaptische plasticiteit). Wijzigingen in het aantal, de locatie en de subeenheid samenstelling van het oppervlak uitgedrukt glurs diep beïnvloeden neuronale functie en, in feite, wijzigingen in deze factoren worden geassocieerd met verschillende neuropathieën. Hier gepresenteerd is een methode om glur-handel in gezien hippocampal primaire neuronen te bestuderen. Een "antilichaam-voedende" benadering wordt gebruikt voor het differentieel visualiseren van GluR populaties uitgedrukt op het oppervlak en inwendige membranen. Door het labelen van de oppervlakte-receptoren op levende cellen en het oplossen van hen op verschillende tijdstippen voor receptoren endocytose en/of recycling, deze handel processen kunnen worden geëvalueerd en selectief bestudeerd. Dit is een veelzijdig protocol dat kan worden gebruikt in combinatie met farmacologische benaderingen of overexpressie van veranderde receptoren om waardevolle informatie te verkrijgen over stimuli en moleculaire mechanismen die de handel in GluR beïnvloeden. Evenzo, het kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van andere receptoren of oppervlakte uitgedrukt eiwitten.

Inleiding

Cellen maken gebruik van het actieve proces van handel om eiwitten te mobiliseren voor specifieke subcellulaire lokalisaties en het uitoefenen van strikte spatiotemporele regulering over hun functie1. Dit proces is vooral belangrijk voor transmembraan receptoren, als cellulaire reacties op verschillende milieu stimuli vertrouwen op intracellulaire Cascades veroorzaakt door receptor activering. Cellen zijn in staat om deze reacties te wijzigen door het veranderen van de dichtheid, lokalisatie, en subeenheid samenstelling van receptoren uitgedrukt op het celoppervlak via receptor subcellulaire handel voorschrift2. Het inbrengen van nieuw worden receptoren in het plasma membraan, samen met endocytose en recycling van bestaande receptoren zijn voorbeelden van mensenhandel processen die bepalen de netto pool van oppervlakte-uitgedrukt receptoren2. Veel moleculaire mechanismen werken samen om de eiwit handel te reguleren, waaronder eiwit-eiwit interacties en posttranslationele modificaties zoals fosforylering, Ubiquitination of palmitoylation2.

Regulering van de receptor handel is met name vereist in sterk gepolariseerde cellen met zeer gespecialiseerde structuren. Het paradigmatische voorbeeld is de controle van neuronale functie door gereguleerde handel in glutamaat receptoren (glurs)3,4. Glutamaat, de belangrijkste excitatory neurotransmitter, bindt en activeert oppervlak-uitgedrukt GluRs voor het beheersen van fundamentele fysiologische neuronale functies zoals synaptische transmission en synaptische plasticiteit. Het feit dat veranderde GluR handel is waargenomen in een breed spectrum van neuropathieën, variërend van neuroontwikkelingsstoornissen tot neurodegeneratieve ziekten, benadrukt het belang van dit proces5. Het begrijpen van de moleculaire gebeurtenissen die de handel in GluR beheersen, is dus interessant voor veel onderzoeksgebieden.

In dit protocol wordt een methode op basis van antilichamen gebruikt om het niveau van oppervlakte-uitgedrukt GluRs in primaire hippocampale neuronen te kwantificeren en te evalueren hoe veranderingen in internalisatie en recycling resulteren in de waargenomen netto-oppervlakte uitdrukking. Het gebruik van farmacologie en/of overexpressie van exogene receptoren die specifieke mutaties verteren maakt dit protocol een bijzonder krachtige benadering voor het bestuderen van moleculaire mechanismen onderliggende neuronale aanpassing aan verschillende milieu stimuli. Een laatste voorbeeld van het nut van dit protocol is het bestuderen van de invloed van de multifactoriële veranderingen in het milieu (zoals in een ziekte model) op de handel in GluR door het onderzoek van de oppervlakte expressie in dergelijke modellen.

Met behulp van specifieke voorbeelden, het is in eerste instantie aangetoond hoe een farmacologische manipulatie nabootsen van fysiologische synaptische stimulatie [Chemical LTP (cLTP)] verhoogt de oppervlakte uitdrukking van de endogene GluA1 subeenheid van de AMPA-type van GluRs (AMPARs) 6. de handel in een overuitgedrukt fosho-mimetische vorm van de GluN2B subeenheid van het NMDA-type GluRs (NMDARs) wordt ook geanalyseerd om te illustreren hoe dit protocol kan worden gebruikt om de regulering van de GluR-handel te bestuderen door specifieke posttranslationele Wijzigingen. Hoewel deze specifieke voorbeelden worden gebruikt, kan dit protocol gemakkelijk worden toegepast op andere gluren en andere receptoren en eiwitten die antigene extracellulaire domeinen bezitten. In het geval dat er geen antilichamen beschikbaar zijn voor extracellulaire domeinen, overexpressie van extracellulaire epitope-Tagged (bijv., vlag-, Myc-, GFP-Tagged, enz.) eiwitten kunnen helpen bij de etikettering van eiwitten.

Het huidige protocol bevat instructies voor het kwantificeren van specifieke GluR-subtype dichtheid en mensenhandel met specifieke antilichamen. Dit protocol kan worden gebruikt om te bestuderen 1) totaal GluR oppervlakte expressie, 2) GluR internalisatie, en 3) GluR recycling. Om elk proces afzonderlijk te bestuderen, wordt geadviseerd om te beginnen met de secties 1 en 2 en door te gaan met sectie 3, 4 of 5. In alle gevallen, eindig met secties 6 en 8 (Figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Werk met betrekking tot de voorbereiding van de primaire cultuur van hippocampal werd beoordeeld en goedgekeurd door het noordwestelijke universitair Dierenzorg-en gebruiks Comité (protocol #IS00001151).

1. voorbereiding voor het labelen

  1. Bereiding en onderhoud van primaire hippocampal culturen
    1. Bereid primaire hippocampal culturen met een dichtheid van 150.000 cellen verguld op poly-D-Lysine-gecoate (0,1 mg/mL) 18 mm afdek glazen. Uitstekende gidsen voor de dissociatie van de neuronale cultuur voorbereiding zijn7,8beschikbaar.
      Opmerking: Indien nodig kunnen de culturen worden behandeld met cytosine uracilarabinoside (Ara-C, 10 mM van DIV1) om gliale proliferatie in het preparaat te voorkomen.
      Opmerking: Alternatieve coating reagentia zoals fibronectin (1 mg/mL) of laminine (5 mg/mL) mogen worden gebruikt in plaats van poly-D-Lysine.
    2. Handhaaf culturen in een cel incubator bij 37 °C en 5% CO2 in 2 ml/put van neurobasal media aangevuld met B27 en 2 mm L-glutamine.
      Opmerking: Vervangingen voor L-glutamine (bijv. Glutamax) kunnen desgewenst worden gebruikt.
    3. Op wekelijkse basis, verwijder de helft van het volume van de media en vervangen door dezelfde hoeveelheid aangevuld neurobasal media.
  2. Optioneel: transfectie van gemuleerde en/of epitope-gelabelde receptoren
    Opmerking:     neuronen moeten ten minste 3 – 4 dagen voorafgaand aan de analysetijd punt worden getransffecteerd om toe te staan voor receptor expressie. Het gebruik van jonge neuronen [dagen in vitro 6 – 9 (DIV6)] resulteert in een betere transfectie-efficiëntie dan oudere (DIV15 – 20) neuronen, maar een voldoende aantal getranssinfecteerde cellen (> 20) kan worden bereikt, ongeacht de gebruikte DIV.
    1. Verdun voor elk goed van een 12-waterput 1,5 μg plasmide met de te bouwen belangstelling in 100 μL verse neurobasale media zonder B27 of glutamine suppletie in een micro centrifugebuis en meng snel door grondig.
      Opmerking: Voor een succesvolle transfectie is het van cruciaal belang dat de gebruikte neurobasal media zo vers mogelijk zijn, idealiter minder dan 1 week na het openen van de fles.
    2. Meng in een tweede microcentrifuge buis 1 μL van een geschikt lipofection-reagens in 100 μL verse neurobasale media en meng zachtjes.
      Opmerking: De lipofection reagens mengsel niet Vortex. Gebruik van verse lipofectie reagentia kan transfectie efficiëntie verbeteren.
    3. Incuberen de buisjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    4. Voeg het lipofection-reagens mengsel druppelsgewijs toe aan het DNA-mengsel, meng zachtjes en inincuberen gedurende 20 minuten bij RT.
    5. Pas het volume van de media in elke put aan op 1 mL geconditioneerde media.
    6. Voeg de lipofection reagens-DNA mengsel druppelsgewijs aan de put.
    7. Cellen terug naar de incubator en laat ten minste 3 – 4 dagen voor eiwit expressie.
      Opmerking: Voor de doeleinden van de hieronder uiteengezette internalisering en recycling protocollen werden hippocampal neuronen getransffecteerd op DIV11-12 met constructies die GluN2B gelabeld met GFP in het extracellulaire domein (GFP-GluN2B) en afbeelding gemaakt op DIV15 – 16.
  3. FACULTATIEF: incubatie van cellen met geneesmiddelen (chronisch of acuut) in de geconditioneerde media tot de fixatie.
    Opmerking:     voor acute behandeling, beginnen met het behandelen van cellen voordat labelen. Afhankelijk van het gebruikte protocol voor de behandeling van geneesmiddelen kunnen cellen worden gehandhaafd in de drugsbevattende media tijdens rubriek 2. In ons voorbeeld waren DIV21 cellen onderhevig aan een cLTP-protocol om het oppervlak te verhogen-uitgedrukt AMPAR9.
    1. Exchange geconditioneerde media voor extracellulaire oplossing (ECS).
    2. Behandel cellen met 300 μM Glycine in ECS gedurende 3 minuten bij RT. Als een controle, behandelen van een zuster afdek met ECS (zonder Glycine).
    3. Spoel cellen 3x met 37 °C ECS en retourneer de cellen in ECS (zonder Glycine) naar de celincubator gedurende 20 minuten voordat u doorgaat met rubriek 2.
      Opmerking: ECS (in mm): 150 NaCl, 2 CACL2,5KCl, 10 Hepes, 30 glucose, 0,001 TTX, 0,01 strychnine en 0,03 picrotoxin bij pH 7,4.

2. live labelen van oppervlakte-uitgedrukt receptoren

  1. Dekbonnen voorbereiden voor labelen
    1. Om reagentia op te slaan en manipulatie te vergemakkelijken, overzet u de celzijde naar een met paraffine folie bedekte lade.
      Opmerking: Het is van cruciaal belang om de monsters nooit uit te laten drogen.
    2. Bewaar en onderhoud geconditioneerde media bij 37 °C voor incubatie-en wasstappen.
      Opmerking: Bij een dekslip van 18 mm wordt incubatie met 75 – 100 μL media voor antilichaam etikettering en 120 – 150 μL voor internalisatie/recycling aanbevolen.
  2. Etikettering van oppervlakte receptoren met primair antilichaam
    1. Incuberen cellen met primair antilichaam, verdund in geconditioneerde media gedurende 15 minuten bij RT.
      Opmerking: Voor receptoren met GFP-Tags werd het konijn anti-GFP-antilichaam bij een verdunning van 1:1000 gebruikt. Voor endogene GluA1, muis anti-GluA1 bij een 1:200 verdunning werd gebruikt.
    2. Zuig de media met behulp van een vacuümpipet en spoel de cellen driemaal met geconditioneerde media zorgvuldig op.
      Opmerking: Als de geconditioneerde media niet beschikbaar zijn, kunnen alle wasstappen worden uitgevoerd met PBS + [fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1 mM MgCl2 en 0,1 mm CACL2]. Handmatige aspiratie met behulp van een micro pipet kan worden uitgevoerd als zachte vacuüm aspiratie niet beschikbaar is.

3. oppervlakte-uitdrukking (Figuur 2)

  1. Secundaire antilichamen labelen van oppervlakte-uitgedrukt receptoren
    1. Was één keer met PBS +.
    2. Repareer cellen met 4% Paraformaldehyde (PFA) en 4% sucrose in PBS gedurende 7 – 8 minuten.
      Opmerking: In tegenstelling tot andere fixatie methoden, zoals methanol, is PFA niet doordrongen van het plasma membraan en daarom geschikt voor oppervlakte-expressie analyse. Gebruik voor optimale resultaten vers bereide PFA. Kortdurende opslag van PFA bij 4 °C of lange termijn (up 30 dagen) opslag bij-20 °C is toelaatbaar voor adequate fixatie.
      Let op: PFA is een bekend kankerverwekkend. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en een veiligheidskap bij het hanteren.
    3. Spoel de cellen drie keer met regelmatige PBS.
      Opmerking: Als alternatief kan 0,1 M glycine worden gebruikt voor het wassen van PFA in plaats van PBS, omdat Glycine alle resterende fixeermiddelen zal doven die de achtergrond in het preparaat kunnen verhogen.
    4. Blokkeer niet-specifieke binding sites door te incuberen met 10% normaal geiten serum (NGS) in PBS gedurende 30 minuten bij RT.
      Opmerking: De blokkeertijd kan worden verlengd zonder nadelige effecten op het labelen.
    5. Inincuberen met fluorescently gelabeld secundair antilichaam verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT om primaire antilichaam gelabelde receptoren te labelen (d.w.z. oppervlakte-uitgedrukt).
      Opmerking: In deze voorbeelden werd een 1:500 verdunning van Alexa 555-geconjugeerde secundaire antilichamen: geit anti-konijn voor GFP-gelabelde receptoren en geit anti-muis voor GluA1 werd gebruikt.
    6. Spoel cellen met PBS 3x.
  2. Etikettering van intracellulaire receptoren
    1. Permeabilize cellen met 0,25% Triton X-100 in PBS voor 5 – 10 min bij RT.
      Opmerking: Om te controleren of de eerste ronde van antilichaam labeling alle oppervlakte epitopes beslaat, kan deze permeabilization stap in een zuster cultuur worden overgeslagen. In dit geval, geen signaal voor intracellulaire receptoren moet worden verkregen. Bovendien, om te controleren of er geen interne receptoren zijn gelabeld in de vorige sectie 2 (d.w.z., met de integriteit van de plasma membranen in de cultuur), de permeabilization stap kan worden overgeslagen in een zuster cultuur, en een primair antilichaam tegen een intracellulair eiwit (bijv. PSD-95 of MAP2) kan in stap 2.2.1 worden gebruikt. Er moet onder deze omstandigheden geen signaal worden verkregen van deze primaire. In dit geval werd een konijn anti-PSD-95 antilichaam (1:500) gebruikt.
    2. Blokkeer met 10% NGS in PBS gedurende 30 min bij RT.
    3. Het etiket intracellulaire receptoren door permeabel cellen te incuberen met hetzelfde primaire antilichaam dat wordt gebruikt in paragraaf 2,2, verdund in 3% ngs in PBS gedurende 1 uur bij RT.
      Opmerking: De antilichaam verdunning voor het labelen van intracellulaire receptoren kan afwijken van die nodig zijn voor het labelen van oppervlakte-uitgedrukt receptoren. In het voorbeeld van GluA1 werd dezelfde antilichaam verdunning (1:200) gebruikt.
    4. Was cellen 3x met PBS.
    5. Label met tweede fluorescently gelabeld secundair antilichaam verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT.
      Opmerking: In deze voorbeelden werd een 1:500 verdunning van geit anti-muis Alexa 647-geconjugeerd secundair antilichaam (voor GluA1) gebruikt.
    6. Was cellen 3x met PBS.

4. internalisering (Figuur 3)

  1. Internalisering van antilichaam-gelabelde oppervlak receptoren
    1. Na het labelen van de oppervlakte-uitgedrukte receptoren en het wassen van antilichamen (punt 2,2), het onderhouden van cellen in geconditioneerde media zonder antilichaam en terug te keren naar de incubator (37 ° c) om te internaliseren.
      Opmerking: Voor NMDA-receptoren wordt 30 min voor internalisatie aanbevolen. Als controle kan een zuster cultuur worden gehandhaafd met geconditioneerde media bij 4 °C tijdens het internalisatie proces. Minimale receptor internalisering moet plaatsvinden onder deze omstandigheden.
  2. Etikettering van oppervlakte receptoren
    1. Spoel de cellen één keer met PBS +.
    2. Repareer cellen met 4% PFA en 4% sucrose in PBS voor 7 – 8 min.
      Let op: Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en een veiligheidskap bij het hanteren van PFA.
    3. Was cellen 3x met reguliere PBS.
    4. Blokkeer met 10% NGS in PBS gedurende 30 minuten bij RT om niet-specifieke binding te voorkomen.
    5. Inbroed monsters met fluorescently-gelabeld secundair antilichaam verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT om primaire antilichaam gelabelde receptoren te labelen (d.w.z. oppervlakte-uitgedrukte receptoren die niet geïnternationaliseerd waren).
      Opmerking: Voor dit voorbeeld, Alexa 555-geconjugeerd geit anti-konijn secundair antilichaam (1:500) werd gebruikt voor het labelen.
    6. Was cellen 3x met PBS.
  3. Etikettering van geïnternationaliseerde receptoren
    1. Permeabilize cellen met 0,25% Triton X-100 in PBS voor 5 – 10 min.
    2. Blokkeer niet-specifieke binding door te incubatie met 10% NGS in PBS gedurende 30 minuten bij RT.
    3. Inbroed monsters met fluorescently gelabeld secundair antilichaam, verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT, voor het labelen van geïnternationaliseerde antilichamen-gelabelde receptoren.
      Opmerking: Voor dit voorbeeld, Alexa 647-geconjugeerd geit anti-konijn secundair antilichaam (1:500) wordt gebruikt voor het labelen.
    4. Was cellen 3x met PBS.

5. recycling (Figuur 4)

  1. Internalisering van antilichaam-gelabelde oppervlak receptoren
    1. Na het labelen van de oppervlakte-uitgedrukte receptoren en het wassen van antilichamen (punt 2,2), het onderhouden van cellen in geconditioneerde media zonder antilichaam en terug te keren naar de incubator (37 ° c) om te internaliseren.
      Opmerking: Voor NMDA-receptoren wordt 30 min voor internalisatie aanbevolen.
  2. Blokkering van stabiel oppervlak uitgedrukt receptoren
    1. Om de epitopen te blokkeren op het primaire antilichaam dat is bevestigd aan de oppervlakte-uitgedrukte receptoren die niet geïnternationaliseerd zijn, cellen met niet-geconjugeerde Fab anti-IgG (H + L) antilichaam fragmenten (tegen de primaire gebruikt in punt 2,2), verdund in geconditioneerde media ( 20 μg/mL) gedurende 20 minuten bij RT. Deze behandeling voorkomt toekomstige interactie met secundaire antilichamen.
      Opmerking: Voor dit voorbeeld werden geit anti-Rabbit Fab fragmenten gebruikt.
      Opmerking: Controle experiment: om ervoor te zorgen dat volledige blokkering van de oppervlakte-uitgedrukte receptoren is opgetreden, zuster dekstroken kunnen worden geïnineerd met en zonder fab. Culturen moeten onmiddellijk na een fantastische behandeling worden vastgesteld en beide culturen worden geïnfiltreerd met Alexa 555-geconjugeerd secundair antilichaam. Geen Alexa 555 signaal in de Fab-geïnde cellen geeft goede antilichaam blokkering.
    2. Was cellen 3x met geconditioneerde media.
    3. Incubeer cellen met geconditioneerde media die 80 μM dynasore bevatten om verdere internalisering te voorkomen en cellen terug te keren naar de incubator (37 °C), zodat er recycling van geïnternationaliseerde receptoren mogelijk is. Dynasore is een GTPase-remmer die dynamin remt en daarom internalisering voorkomt.
      Opmerking: 45 min voor nmdar recycling wordt aanbevolen. Merk op dat Dynasore uitsluitend het dynamin-afhankelijke internalisatie proces blokkeert (bijv. internalisering van NMDARs). Echter, internalisatie van andere synaptische eiwit (dynamine-onafhankelijk) kan nog steeds optreden in de aanwezigheid van Dynasore.
  3. Etikettering van gerecycleerde receptoren
    1. Spoel de cellen één keer met PBS +.
    2. Repareer cellen met 4% PFA en 4% sucrose in PBS voor 7 – 8 min.
      Let op: Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en een veiligheidskap bij het hanteren van PFA.
    3. Was cellen 3x met PBS.
    4. Blokkeer met 10% NGS in PBS gedurende 30 minuten bij RT om niet-specifieke binding te voorkomen.
    5. Label cellen met eerste fluorescently gelabeld secundair antilichaam verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT.
      Opmerking: Voor dit voorbeeld, Alexa 555-geconjugeerde geit anti-konijn antilichaam (1:500) werd gebruikt voor het labelen.
    6. Was cellen 3x met PBS.
      Opmerking: Langere wast met PBS (5 – 10 min) kan helpen om de achtergrond in het preparaat te verminderen.
  4. Etikettering van geïnternationaliseerde receptoren
    1. Permeabilize cellen met 0,25% Triton X-100 in PBS voor 5 – 10 min.
    2. Blokkeer met 10% NGS in PBS gedurende 30 min bij RT.
    3. Label met tweede fluorescently gelabeld secundair antilichaam verdund in 3% NGS in PBS voor 1 uur bij RT.
      Opmerking: Voor dit voorbeeld, Alexa 647-geconjugeerde geit anti-konijn antilichaam (1:500) werd gebruikt voor het labelen.
    4. Was cellen 3x met PBS.

6. montage en beeldvorming van monsters

  1. Monteer de cellen door de afdek stroken van de cel voorzichtig op 12 – 15 mL van de juiste bevestigings media te plaatsen.
    Opmerking: Aspiratie van overtollige bevestigings media zal de kwaliteit van de beelden verbeteren.
  2. Beeld cellen op een geschikte confocale Microscoop.
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om een z-stack te beelden met een vergroting van 60x met stappen van 0,35 μm, die de volledige dikte van het neuron omvat.

7. tijd overwegingen

  1. Dit is een lang protocol dat op verschillende punten kan worden stopgezet. Indien gewenst, voer de incubatie stappen voor blokkering en primair antilichaam 's nachts bij 4 °C in een vochtige kamer uit.
  2. Als alternatief u desgewenst een microgolf tissue processor gebruiken om de incubatie tijden na de vastlegging aanzienlijk te versnellen. Gebruik voor alle stappen 150 W bij 30 °C voor "aan"-instellingen.
    1. Om te blokkeren, voert u de processor uit op 2 minuten "aan," 1 min "uit," en 2 min "aan."
    2. Voer voor de incubatie stappen primair en secundair antilichaam de processor in op 3 min "aan," 2 min "uit," en 3 min "aan."
      Opmerking: We observeren geen kwaliteitsverschil door de bovenstaande wijzigingen aan te maken in het protocol.

8. beeldanalyse

  1. Het wordt aanbevolen om FIJI te gebruiken < https://Fiji.SC/> om beeldanalyse uit te voeren, omdat het compatibel is met meerdere bestandsformaten. Voor onze gegevens werden afbeeldingen in het Nikon ND2-bestandsformaat verkregen.
  2. Een macro script is voorzien voor eenvoudige batch kwantificering van verschillende parameters die vooraf zijn geselecteerd door FIJI. De volgende stappen zijn opgenomen in de macro:
    Opmerking: Voor deze voorbeelden werd "geïntegreerde intensiteit" gemeten.
  3. Open de afbeeldingsbestanden in FIJI en afzonderlijke kanalen.
  4. Z-projecteer elke kanaal stack als een projectie met maximale intensiteit.
  5. Stel voor elk kanaal een lagere drempel in.
    Opmerking: De drempels moeten voor elke experimentele gegevensset empirisch worden bepaald. Hoewel elk kanaal een afzonderlijke lagere drempelwaarde kan hebben, is het cruciaal dat de drempelwaarden voor kanaal consistent worden bijgehouden voor alle afbeeldingen van dezelfde gegevensset.
  6. Selecteer drie tot vijf secundaire of tertiaire dendrites en sla ze op als interessegebieden (ROIs).
  7. Meet de geïntegreerde dichtheid van elke ROI in oppervlakte-en intracellulaire kanalen.
  8. Normaliseer het signaal voor elke ROI door de geïntegreerde dichtheidswaarde van het oppervlakte kanaal te delen door het intracellulaire kanaal.
  9. Herhaal de metingen voor alle besturings-en experimentele beelden en Normaliseer experimentele waarden om waarden te beheersen (bijv. GluN2B WT-of no-Glycine-condities).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol om te studeren glutamaat-receptor handel is gebaseerd op differentiële labeling van receptoren uitgedrukt op het celoppervlak en die uitgedrukt in interne membranen. Segregatie wordt bereikt door het labelen van de receptoren voor en na membraan permeisatie, met behulp van hetzelfde primaire antilichaam, maar een secundair antilichaam geconjugeerd aan een verschillende fluorophore. Zoals uiteengezet in de optionele stappen omvatte het Protocol, dit is een zeer veelzijdige met...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De interactie tussen een cel en zijn omgeving (bijv. communicatie met andere cellen, reactie op verschillende stimuli, enz.) is sterk afhankelijk van de juiste expressie van receptoren op het celoppervlak. De snelle en fijngetunede regulering in oppervlakte-uitgedrukt receptor inhoud zorgt voor een goede cellulaire reactie op een voortdurend veranderende omgeving. In het specifieke geval van neuronen, wijzigingen in het aantal, lokalisatie, en de samenstelling van de subeenheid van Synaptisch uitgedrukt receptoren sterk ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken het noordwestelijke centrum voor geavanceerde microscopie voor het gebruik van de Nikon a1 confocale Microscoop en hun hulp bij het plannen en analyseren van de experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) en NIA (R00AG041225) en een NARSAD Young Investigator subsidie van de Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
18 mm dia. #1.5 thick coverglassesNeuvitroGG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secundairLife TechnologiesA21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secundairLife TechnologiesA21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secundairLife TechnologiesA21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secundairLife TechnologiesA21245
B27Gibco17504044
CaCl2SigmaC7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning3513
DynasoreTocris2897
GlucoseSigmaG8270
GlycineTocris0219
Goat anti-rabbit Fab fragmentenSigmaSAB3700970
HEPESSigmaH7006
KClSigmaP9541
L-GlutamineSigmaG7513
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Mouse anti-GluA1 antibodyMilliporeMAB2263
NaClSigmaS6546
Neurobasal MediaGibco21103049
NGSAbcamAb7481
ParafilmBemisPM999
PBSGibco10010023
Pelco BioWaveTed Pella36500
PFAAlfa Aesar43368
PicrotoxinTocris1128
Poly-D-lysine hydrobromideSigmaP7280
ProLong Gold Antifade MountantLife TechnologiesP36934
Rabbit anti-GFP antibodyInvitrogenA11122
Rabbit anti-PSD-95 antibodyCell Signaling2507
StrychnineTocris2785
SucroseSigmaS0389
Superfrost plus microscope slidesFisher12-550-15
Triton X-100SigmaX100
TTXTocris1078

Referenties

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896(2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067(2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Gedissocieerde hippocampusculturenlabeling van oppervlaktereceptorenreceptorinternalisatiereceptorrecyclingconfocale microscopie-imagingincubatie met primaire antilichamenFab-blokkeringsprotocolPFA-fixatiemethode
Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.