Methodenartikel

Murine cervicaal aorta transplantatie model met behulp van een gemodificeerde niet-hecht manchet techniek

DOI:

10.3791/59983

⸱

2 november 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General, Visceral, and Transplant Surgery, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University of Munich, 3Department of General, Visceral and Cancer Surgery, University Hospital of Cologne, University of Cologne

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol van heterotopische aorta transplantatie in muizen met behulp van de niet-hecht manchet techniek in een cervicale Murine model. Dit model kan worden gebruikt om de onderliggende pathologie van chronische transplantaat vasculopathie (CAV) te bestuderen en kan helpen bij het evalueren van nieuwe therapeutische middelen om de vorming ervan te voorkomen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de introductie van krachtige immunosuppressieve protocollen, zijn duidelijke vooruitgang mogelijk in de preventie en therapie van acute afwijzing afleveringen. In de afgelopen decennia kon echter slechts geringe verbetering van de lange termijn resultaten van getransplanteerde vaste organen worden waargenomen. In deze context vertegenwoordigt chronische transplantaat vasculopathie (CAV) nog steeds de belangrijkste oorzaak van laat-orgaanfalen bij cardiale, nier-en pulmonaire transplantatie.

Tot dusver blijft de onderliggende pathogenese van CAV-ontwikkeling onduidelijk, waarin wordt uitgelegd waarom effectieve behandelingsstrategieën momenteel ontbreken en de nadruk leggen op een behoefte aan relevante experimentele modellen om de onderliggende pathofysiologie te bestuderen die leidt tot CAV vorming. Het volgende protocol beschrijft een heterotope cervicale aorta transplantatie model Murine met behulp van een gemodificeerde niet-hecht manchet techniek. In deze techniek wordt een segment van de thoracische aorta in de rechter gemeenschappelijke halsslagader geplaatst. Met het gebruik van de niet-hecht manchet techniek, kan een gemakkelijk te leren en reproduceerbare model worden vastgesteld, waardoor de mogelijke heterogeniteit van gehecht vasculaire micro anastomoses wordt geminimaliseerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen zes decennia is een solide orgaantransplantatie geëvolueerd van een experimentele procedure naar een standaard van zorg voor de behandeling van eindstadium orgaanfalen1. Als gevolg van de verbetering van antimicrobiële middelen, chirurgische technieken en vooruitgang in immunosuppressieve regimenten, de vroege succespercentage van de vaste orgaantransplantatie zijn aanzienlijk toegenomen in de afgelopen decennia2.

Echter, lange termijn transplantaat overleving percentages zijn niet significant verbeterd op dezelfde manier3. De ontwikkeling van CAV is de belangrijkste factor die de lange termijn Overleving4,5,6beperkt. Deze pathologie wordt gekenmerkt door de vorming van een concentrische neointimale laag bestaande uit gladde spiercellen, wat leidt tot progressieve vernauwing van het vat en opeenvolgende malperfusie van het getransplanteerde vaste orgaan. Bij ontvangers van harttransplantaties kunnen CAV laesies worden gediagnosticeerd bij maximaal 75% van de patiënten 3 jaar na transplantatie7.

De pathofysiologie van CAV is nog niet volledig begrepen. Het lijkt te zijn gerelateerd aan tal van immunologische en niet-immunologische factoren, leidt tot endotheliale schade met daaropvolgende endotheliale activering en dysfunctie8. Tot dusver bestaat er geen causale behandelingsoptie voor de preventie van CAV, met de nadruk op de noodzaak van een reproduceerbare kleine diermodel om de vorming en mogelijke therapie van CAV te bestuderen.

Met het gebruik van muriene aorta transplantatie modellen, CAV achtige laesies kan worden gezien 4 weken na transplantatie. Deze laesies bestaan voornamelijk uit vasculaire gladde spiercellen, daardoor, die lijken op de menselijke pathologie. Door een breed scala aan transgene en knock-out muizen biedt het gebruik van Muismodellen in transplantatie geassocieerde pathologieën een unieke kans om nieuwe therapeutische opties te identificeren en hun ontwikkeling te begrijpen. Vanwege de kleine diameter van de getransplanteerde vaten wordt het gebruik van Muismodellen echter vaak geassocieerd met lange leer curves en een initiële hoge complicatie rate9. Met de introductie van de niet-hecht manchet techniek kan dit meest uitdagende deel van de operatie worden vergemakkelijkt en wordt de diameter van de anastomose constant10,11gehouden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Duitse dierenwelzijns akte (TierSchG). (AZ: 55.2-1-54-2532. Vet_02-80-2015).

1. huisvesting van dieren

  1. Gebruik voor experimenten mannelijke C57BL/6-en BALB/c-muizen met een gewicht van 20-25 g met C57BL/6 muizen als de ontvangende dieren en BALB/c muizen als donordieren.
  2. Koop de dieren en huis in een barrière-pathogeen-vrije faciliteit, in overeenstemming met de FELASA richtlijnen voor Health Monitoring12.
  3. Houd de muizen in standaard Makrolon kooien met verrijking nesten materiaal. Geef ad libitum toegang tot water en gepileerde voedsel bij een dag/nacht cyclus van 12 uur.
  4. Houd de kamertemperatuur bij 22 ± 2 °C en de relatieve vochtigheid bij 55 ± 5%.

2. voorbereiding van de geadresseerde

  1. Eerste, anesthetiseer het ontvangende dier (C57BL/6) met een intraperitoneale injectie van midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), medetomidin (0,5 mg/kg; 1 mg/mL) en fentanyl (0,05 mg/kg; 0,05 mg/mL).
    Opmerking: de juiste diepte van de anesthesie moet worden bereikt in 5-10 min.
    1. Knijp de achtervoeten met een tang om te controleren op reflexen om de diepte van de anesthesie te bevestigen.
  2. Clip al het haar van de cervicale laterale regio met een elektrische Hair Clipper voor kleine dieren en breng oftalmische zalf met wattenstaafjes om te voorkomen dat de ogen uitdrogen tijdens de procedure.
  3. Plaats het dier in een rugligging op een verwarmingspad onder de Microscoop en plak de poten voorzichtig op de bedienings tafel met huid gevoelige pleister stroken.
  4. Kantel het hoofd terug en schrobben het operatieve veld meerdere malen met alcohol.
  5. Maak een huid incisie van de halsader incisie naar rechts lager onderkaak met kleine schaar.
  6. Verwijder de rechter onderste LOB van de submandibulaire klier via bipolaire cauterie van het vaten been en daarna excisie met micro schaar.
  7. Verwijder de rechter sternocleidomastoïde spier via bipolaire cauterie van het bovenste en onderste gedeelte en daaropvolgende excisie met micro schaar om toegang te krijgen tot de gemeenschappelijke carotis slagader.
  8. Mobiliseer de common halsslagader-slagader zo veel mogelijk en in de nabije omgeving door het omringende bindweefsel uit elkaar te trekken met een fijne Tang.
  9. BIND twee 7-0 zijde ligaturen met minimale afstand tussen elk rond het midden van de gemeenschappelijke halsslagader en transect de gemeenschappelijke carotis slagader met fijne micro schaar tussen de ligaturen.
  10. Passeer het proximale, geligeerd uiteinde door de manchet en bevestig het met een kleine slagader klem.
    Opmerking: de manchetten die in deze procedure werden gebruikt, werden gesneden met een micro schaar uit buisjes van polyimide met een buitendiameter van 0,610 mm en een wanddikte van 0,0254 mm. De voltooide manchetten hadden een lengte van ~ 2 mm met een helft, die wordt gebruikt voor het cuffing-proces, een volle cilinder en de andere helft, die wordt geklemd, een halve cilinder.
  11. Verwijder de ligatuur met fijne micro schaar, zo dicht mogelijk bij de ligatuur, en spoel het lumen met een gehepariniseerd zoutoplossing (50 IE/ml) met een 30 G naald, terwijl u voorzichtig de wanden van het vat niet beschadigt.
  12. Distend het open lumen met behulp van fijne vasculaire dilatatoren en Evert de carotis stronk over de manchet door het zachtjes over de polyimide buis te trekken.
  13. Bevestig onmiddellijk de binnenstebuiten gekeerd halsslagader met een losjes vooraf gebonden 7-0 Silk loop.
    Opmerking: losjes vooraf binden 4 7-0 zijde lussen met een diameter van ongeveer 1,5 mm voor de operatie om de cuffing-procedure soepeler en gemakkelijker te maken.
  14. Voer dezelfde procedure uit (2.10-2.13) aan het andere uiteinde van de halsslagader.
  15. Stel het ontvangende dier opzij en hydrateer het operatieve veld met zoutoplossing totdat het aorta segment is explanted.

3. donor bedrijf

  1. Anesthetiseer de donor muis (BALB/c) op dezelfde manier als het ontvangende dier.
    1. Knijp de achterpoten met een tang om te controleren op reflexen om voldoende verdoving te bevestigen.
  2. Clip alle haren van de buik en de thoracale regio met een elektrische Hair Clipper voor kleine dieren en breng oftalmische zalf met wattenstaafjes om te voorkomen dat de ogen uitdrogen tijdens de procedure.
  3. Plaats het dier in een rugligging op een verwarmingspad onder de Microscoop en plak de poten voorzichtig op de bedienings tafel met huid gevoelige pleister stroken.
  4. Scrub het operatieve veld meerdere malen met alcohol.
  5. Voer een middellijn abdominale laparotomie uit met een kleine schaar en duw de darmen iets omhoog om de inferieure vena cava (IVC) bloot te leggen.
  6. Injecteer de inferieure vena cava (IVC) met 1 ml gehepariniseerd Saline met een 30 G naald.
  7. Snijd de abdominale aorta en de IVC onder de nierslagaders met een kleine schaar om het donordier te exsanguineren. Plaats een kompres in de buik losjes om het bloed te absorberen.
  8. Voer een Thoracotomie uit bij de bilaterale omleiding van de ribben met een schaar en kantel de voorste borstwand cranially met een chirurgische klem om het mediastinum bloot te leggen.
  9. Snijd de IVC en de slokdarm direct boven het diafragma met micro schaar.
  10. Verwijder het hart en de longen door ze omhoog te kantelen met een tang die de geknipte IVC/slokdarm vasthoudt en ze vervolgens met een micro schaar uit de basis te halen om toegang te krijgen tot de thoracische aorta in het rugmediastinum.
  11. Mobiliseer de thoracale aorta van het omringende weefsel door het omringende bindweefsel en vet uit elkaar te trekken met een fijne Tang terwijl het voorzichtig is om geen intercostale slagaders te beschadigen.
  12. Cauteriseren alle takken van de thoracale aorta met bipolaire cauterie Tang en accijnzen het aorta segment tussen het diafragma en de aortische boog met behulp van micro schaar.
  13. Spoel het uitgesneden aorta segment met een gehepariniseerd zoutoplossing met een 30 G naald, terwijl u er voor zorgt dat u de wanden van het vat niet beschadigt, eventuele overgebleven bloed of stolsels verwijdert en het transplantaat overdraagt naar het ontvangende dier.
    Opmerking: plaats de aorta Graft direct in de ruwweg juiste positie in de ontvanger tijdens de overdracht. Als er problemen zijn met het verwarren van de verschillende uiteinden van de graft in het ontvangende dier, kan een losse ligatuur rond het distale uiteinde helpen.

4. implantatie

  1. Trek het proximale uiteinde van het aorta-segment van de donor over de proximale manchet bovenop de gealgeerde halsslagader met fijne Tang en bevestig het onmiddellijk met een losjes vooraf gebonden 7-0 Silk loop.
  2. Trim het distale, vrije uiteinde van de aorta Graft met micro schaar zodat de Graft lengte de afstand tussen de twee manchetten past.
  3. Herhaal stap 4,1 aan de andere kant van de aorta met de andere manchet om de anastomose te voltooien.
  4. Verwijder de distale klem om retrograde perfusie toe te staan.
  5. Na het bereiken van hemostase, verwijder de proximale klem om de anastomose te voltooien.
  6. Sluit ten slotte de wond met 6-0 continue hechting.

5. postoperatieve zorg

  1. Bewaak de muis nauwkeurig in de eerste 6 h na de operatie en vervolgens meerdere malen per dag voor de eerste 72 h na de transplantatie om eventuele complicaties onmiddellijk op te sporen.
  2. Injecteer voor postoperatieve analgesie de getransplanteerde muis met buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg) subcutaan direct na de transplantatie en vervolgens elke 12 h voor 72 h om geschikte, langdurige analgesie te bieden.

6. aorta transplantaat verklaringen

  1. Anesthetiseer het getransplanteerde dier met een intraperitoneale injectie van midazolam (5 mg/kg; 5 mg/mL), medetomidin (0,5 mg/kg; 1 mg/mL) en fentanyl (0,05 mg/kg; 0,05 mg/mL) 4 weken na transplantatie.
    1. Knijp de achterpoten met een tang om te controleren op reflexen om voldoende verdoving te bevestigen.
  2. Clip alle haren van de buik, thoracale en cervicale regio met een elektrische Hair Clipper voor kleine dieren.
  3. Plaats het dier in een rugligging op een verwarmingspad onder de Microscoop en plak de poten voorzichtig op de bedienings tafel met huid gevoelige pleister stroken.
  4. Scrub het operatieve veld meerdere malen met alcohol.
  5. Voer een middellijn abdominale laparotomie uit met een kleine schaar en duw de darmen iets omhoog om de inferieure vena cava (IVC) bloot te leggen.
  6. Injecteer de inferieure vena cava (IVC) met 1 ml gehepariniseerd Saline met een 30 G naald.
  7. Snijd de abdominale aorta en de IVC onder de nierslagaders met een kleine schaar om het donordier te exsanguineren. Plaats een kompres in de buik losjes om het bloed te absorberen.
  8. Maak een incisie van de huid van de halsader incisie aan de rechteronderkaak met een kleine schaar overeenkomend met de huid incisie gemaakt tijdens de transplantatie procedure.
  9. Identificeer de getransplanteerde aorta Graft samen met de distale en proximale Cuff en Blunt Verwijder het omringende weefsel met een tang.
  10. Gebruik micro schaar om de aorta-transplantaat samen met de twee manchet uiteinden uit te snijden door de gewone halsslagader distale en proximale naar de aorta Graft met de manchetten.
  11. Snijd het aorta segment in tweeën en bewaar de specimens voor verdere analyses (bevroren delen, paraffine ingesloten secties, bevroren materiaal van de module)13,14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het volledig MHC-mismatch-transplantatie model kan een concentrische neointimale laag worden gezien 4 weken na de transplantatie (Figuur 2). Deze laag bestaat hoofdzakelijk uit vasculaire gladde spiercellen als immunohistologische kleuring voor SM22 (een selectieve marker voor rijpe vasculaire gladde spiercellen) onthuld. Zoals eerder vermeld, deze vasculaire gladde spiercellen zijn Pathognomonisch voor laesies gezien in chronische transplantaat vasculopathie. Voor verdere analyses moeten...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische allotransplantaat vasculopathie is de belangrijkste oorzaak van laat transplantaat verlies na een solide orgaantransplantatie van het hart en waarschijnlijk nier-en Long allograften8. Tot nu toe kon geen causaal therapeutisch regime worden ontwikkeld om de vorming van CAV te voorkomen.

De pathofysiologie van CAV is multifactoriaal en omvat immunologische en niet-immunologische aspecten16. Het gebruik van knaagdieren modellen bij transp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Balb-c Muizen (H2-d)Charles RiverStam# 028Donordier
Bipolare cauterisatiesysteemERBEICC 50 / 20195-023Bipolare cauterisatie
C57BL/6J (H-2b)Charles RiverStam# 027Ontvangerdier
Halsey NaaldhoudersFST12501-12Naaldhouder
Halsted-MosquitotangAESCULAPBH111RGebogen Tang
Medisch Polyimide BuizenNordson MEDICAL141-0031Manchetmateriaal
Micro SerrefinesFST18055-04Micro Vatclip
Micro-Adsontang (gekarteld)FST11018-12Standaardtang
Micro-Serrefine KlemtangFST18057-14Clipapplicateur
S&T Forceps - SuperGrip Tips (Gewelfde 45°)S&T00649-11Fijne Tang
S&T Vaatverwijdende Tang - Gewelfd 10° (Tipdiameter 0.2 mm)S&T00125-11Vaatverwijder
Schott VisiLED SetSchottMC 1500 / S80-55Licht
Stereoscopisch microscoopZEISSSteREO Discovery.V8Microscoop
Student Fijne Schaartjes / Chirurgische Schaartjes - Scherp-BluntFST91460-11 / 14001-12Standaard Schaartjes
Vannas-Tübingen Veerschaar (gebogen, 8.5 cm)FST15004-08Microschaar (gebogen)
Vannas-Tübingen Veerschaar (recht, 8.5 cm)FST15003-08Microschaar (recht)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rana, A., et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).
  2. Rana, A., Godfrey, E. L. Outcomes in Solid-Organ Transplantation: Success and Stagnation. Texas Heart Institute Journal. 46 (1), 75-76 (2019).
  3. Meier-Kriesche, H. U., Schold, J. D., Srinivas, T. R., Kaplan, B. Lack of improvement in renal allograft survival despite a marked decrease in acute rejection rates over the most recent era. American Journal of Transplantation. 4 (3), 378-383 (2004).
  4. Bagnasco, S. M., Kraus, E. S. Intimal arteritis in renal allografts: new takes on an old lesion. Current Opinion in Organ Transplantation. 20 (3), 343-347 (2015).
  5. Hollis, I. B., Reed, B. N., Moranville, M. P. Medication management of cardiac allograft vasculopathy after heart transplantation. Pharmacotherapy. 35 (5), 489-501 (2015).
  6. Verleden, G. M., Raghu, G., Meyer, K. C., Glanville, A. R., Corris, P. A new classification system for chronic lung allograft dysfunction. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (2), 127-133 (2014).
  7. Ramzy, D., et al. Cardiac allograft vasculopathy: a review. Canadian Journal of Surgery. 48 (4), 319-327 (2005).
  8. Skoric, B., et al. Cardiac allograft vasculopathy: diagnosis, therapy, and prognosis. Croatian Medical Journal. 55 (6), 562-576 (2014).
  9. Koulack, J., et al. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).
  10. Rowinska, Z., et al. Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
  11. Dietrich, H., et al. Mouse model of transplant arteriosclerosis: role of intercellular adhesion molecule-1. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (2), 343-352 (2000).
  12. Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Laboratory Animals. 48 (3), 178-192 (2014).
  13. Ollinger, R., et al. Blockade of p38 MAPK inhibits chronic allograft vasculopathy. Transplantation. 85 (2), 293-297 (2008).
  14. Thomas, M. N., et al. SDF-1/CXCR4/CXCR7 is pivotal for vascular smooth muscle cell proliferation and chronic allograft vasculopathy. Transplant International. 28 (12), 1426-1435 (2015).
  15. Ollinger, R., et al. Bilirubin: a natural inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation. 112 (7), 1030-1039 (2005).
  16. Segura, A. M., Buja, L. M. Cardiac allograft vasculopathy: a complex multifactorial sequela of heart transplantation. Texas Heart Institute Journal. 40 (4), 400-402 (2013).
  17. McDaid, J., Scott, C. J., Kissenpfennig, A., Chen, H., Martins, P. N. The utility of animal models in developing immunosuppressive agents. European Journal of Pharmacology. 759, 295-302 (2015).
  18. Shi, C., Russell, M. E., Bianchi, C., Newell, J. B., Haber, E. Murine model of accelerated transplant arteriosclerosis. Circulation Research. 75 (2), 199-207 (1994).
  19. Koulack, J., et al. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clinical Immunology and Immunopathology. 80 (3 Pt 1), 273-277 (1996).
  20. Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141 (5), 682-689 (2007).
  21. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753(2014).
  22. Nakao, A., Ogino, Y., Tahara, K., Uchida, H., Kobayashi, E. Orthotopic intestinal transplantation using the cuff method in rats: a histopathological evaluation of the anastomosis. Microsurgery. 21 (1), 12-15 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Aortatransplantatie bij muizenheterotopisch cervicaal modelchronische allograft vasculopathievasculaire microanastomoseinterpositie van aortasegmentspoeling met hepariniseerde zoutoplossingVan Gieson kleuringSM22 immunofluorescentiewarme ischemieperiode

Gerelateerde artikelen