Methodenartikel

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

DOI:

10.3791/59985

⸱

16 augustus 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Endocrinology, Diabetes & Metabolism, Baylor College of Medicine, 3Scientific Center, Shandong Provincial Hospital affiliated to Shandong University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Type 1 diabetes (T1D) wordt gekenmerkt door de eilandje-specifieke auto-immuniteit leidt tot bèta celvernietiging en absoluut verlies van insulineproductie. In het spontane niet-zwaarlijvige diabetes (NOD) muismodel, insuline is het primaire doelwit, en genetische manipulatie van deze dieren te verwijderen van een enkele sleutel insuline epitoop voorkomt ziekte. Dus selectieve eliminatie van professionele antigeen presentatie cellen (apc's) die deze pathogene epitoop dragen, is een benadering om de ongewenste insuline-specifieke auto-immuunresponsen te remmen en heeft waarschijnlijk een groter translationeel potentieel.

Chimeric antigeen receptoren (Auto's) kunnen T cellen omleiden naar selectief richten op ziekteveroorzakende antigenen. Deze techniek is van fundamenteel belang voor recente pogingen om cellulaire techniek te gebruiken voor adoptie van celtherapie om meerdere kankers te behandelen. In dit protocol beschrijven we een geoptimaliseerde T-Cell retrovirus (RV) transductie en in-vitro uitbreidings protocol dat hoge aantallen functionele antigeen-specifieke CD8 CAR-T cellen genereert, beginnend bij een laag aantal naïeve cellen. Eerder werden meerdere auto-T-celprotocollen beschreven, maar meestal met relatief lage transductie-efficiëntie en levensvatbaarheid van de cellen na transductie. Ons protocol biedt daarentegen tot 90% transductie-efficiëntie en de gegenereerde cellen kunnen meer dan twee weken in vivo overleven en het begin van de ziekte significant vertragen na een enkelvoudige infusie. We geven een gedetailleerde beschrijving van het celonderhoud en het transductie protocol, zodat de kritische stappen gemakkelijk kunnen worden opgevolgd. De hele procedure van het isoleren van de primaire cel tot de auto-expressie kan binnen 14 dagen worden uitgevoerd. De algemene methode kan worden toegepast op elke muis ziekte model waarin het doel bekend is. Evenzo is de specifieke toepassing (gericht op een pathogene peptide/MHC klasse II complex) van toepassing op elk ander auto-immuunziekte model waarvoor een sleutel complex is geïdentificeerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gezien het waarschijnlijke verminderde risico op ongewenste niet-doel effecten, zijn antigeen-specifieke immuuntherapieën (ASI) veelbelovende behandelingen voor auto-immuunziekten zoals T1D. Accumulerend bewijs suggereert dat immuunresponsen op (PrePro) insuline bijzonder belangrijk kan zijn in T1D1. In het afgelopen decennium, studies van meerdere groepen, met inbegrip van onze eigen, sterk suggereren dat de presentatie van een epitoop met insuline B keten aminozuren 9 aan 23 door specifieke MHC klasse II moleculen (B: 9-23/mhcii), speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van T1D in muizen en mensen2,3,4,5. Selectief richten op de B: 9-23/MHCII complex, we genereerden een monoklonaal antilichaam, genaamd mAb287, dat heeft geen kruisreactiviteit aan het hormoon insuline of complexen met andere peptiden6. MAb287 blocks antigeen presentatie in vitro, en wekelijkse toediening van mAb287 aan pre-diabetische NOD muizen vertraagde de ontwikkeling van T1D in 35% van de behandelde muizen6. Om de antigeen-presentatie in vivo te blokkeren, zijn frequente injecties meestal nodig om een hoge circulerende concentratie te behouden. We veronderstelde dat we deze moeilijkheid kunnen overwinnen door gebruik te maken van de hoge specificiteit van Ab287 om T-cellen te herprogrammeren, waardoor een verbeterde antigeen-specifieke T-celtherapie voor T1D7wordt geboden.

Cytotoxische T-cellen worden gerapporteerd om hun doelwit te kunnen doden als zelfs een enkel exemplaar van hun verwant ligand wordt uitgedrukt8,9,10. Dus, B: 9-23/MHCII specifieke CD8 T cellen zullen naar verwachting een hogere efficiëntie hebben bij het elimineren van de ongewenste antigeen presentatie dan het bovenliggende antilichaam, die waarschijnlijk moet binden aan meerdere complexen op dezelfde APC om het effect uit te oefenen. Auto-T-cellen zijn gebruikt voor de behandeling van meerdere menselijke kankers11,12,13, en kan ook werkzaam zijn in auto-immuniteit14. Echter, auto-T cellen met specificiteit voor pathogene peptide-MHC complexen zijn tot nu toe niet gebruikt voor het wijzigen van de progressie van T1D. Door gebruik te maken van de geoptimaliseerde CD8 T celtransductie techniek die hieronder wordt beschreven, hebben we onlangs aangetoond dat dit inderdaad een levensvatbare aanpak is7.

In dit protocol schetsen we een efficiënte en gestroomlijnde transductie en uitbreidingsmethode. Ons protocol is van toepassing op andere studies die de generatie van muis CD8 auto T-cellen met een hoog rendement vereisen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muizen werden gehandhaafd onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden bij een transgene muis faciliteit, en alle dier experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen die zijn goedgekeurd door het Baylor College van het geneeskunde Dierenzorg-en gebruiks Comité.

Opmerking: het experiment is vereist voor de voorbereiding van het virus en de T-cellen parallel. Tabel 1 bevat een overzicht van het protocol. De belangrijkste reagentia en buffers staan vermeld in de tabel met materialen. We richten ons op het genereren en uitbreiden van CAR-T-cellen die gericht zijn op specifieke populaties van Apc's in dit protocol.

1. generatie en validatie van single Chain Fab antilichamen (scFab)-Auto's.

Opmerking: auto's bevatten doorgaans 3 kritieke domeinen-een antigeen-targeting domein, een spacer/transmembraan domein en een cytoplasmonisch signalerings domein. Het precieze ontwerp van elke auto hangt af van de beoogde doelstelling, en dus, afgezien van de belangrijkste kenmerken van de constructie die relevant is voor de opwekking van het retrovirus, zal niet gedetailleerd in dit protocol worden beschreven. Het algemene ontwerp van de Auto's die worden gebruikt voor de hieronder beschreven onderzoeken, wordt weergegeven in Figuur 1. In het kort, het doeldomein bestaat uit de gehele lichte keten en variabele en CH1 domein van de zware keten van de bovenliggende monoklonaal antilichaam gekoppeld door een semi-rigide linker. Het domein spacer/transmembraan is van de muis CD28 en het signalerings domein is een fusie met elementen uit de muis CD28, CD137 (4-1BB) en CD247 (CD3ζ). Deze elementen worden geassembleerd door standaard moleculaire biologie procedures zoals Splice overlapping polymerase kettingreactie (PCR), of de synthese van een geschikte "genblok". Details van de generatie van de mAB287 auto zijn opgenomen in Zhang et al.7. De cDNA-sequenties kunnen op verzoek van de auteurs worden verkregen.

  1. Montage van de auto constructie
    1. Synthetiseren van de targeting single Chain Fab antilichaam (scfab) en gecombineerde spacer/signalering domeinen afzonderlijk, en gebruik een "3 punt" ligatie techniek15 om de uiteindelijke constructie te monteren (Figuur 1).
      Opmerking: de belangrijkste eis voor de auto-insert is dat het flankerende restrictie-endonuclease-sites moet bevatten die kunnen worden geligd in de retrovirale expressie vector pMSCV-IRES-GFP II (pmig II), of een verwant derivaat15 ook Passende.
  2. Validatie van de auto oppervlakte-expressie
    1. De hybridoma-cellen worden door middel van pMIG II afgeleide retrovirale deeltjes die door een standaardprotocol worden gegenereerd (bijv. Holst et al.16).
    2. Voer flow cytometrie analyse uit om de uitdrukking van GFP uit de auto Vector17te detecteren.
    3. Vlek oppervlak expressie van de auto van de getransduceerde Hybridomas met gelabelde antilichamen tegen de muis-κ-keten (bijv. kloon RMK-45)17.
      Opmerking: 18.
  3. Validering van de specificiteit van de auto
    1. Stimuleer de getransduceerde hybridoma-cellen met geschikte plaat gebonden of cellulaire antigenen. Na de nachtelijke co-cultuur te verzamelen supernatanten en uitgescheiden cytokines, en getest door enzym-gebonden immunosorbent assay (Elisa)7.
      Opmerking: Idealiter moet elke auto onafhankelijk worden gevalideerd voordat deze wordt gebruikt voor transductie. Bij deze stap kan het experiment worden onderbroken en later opnieuw worden gestart.

2. transfectie van virale producerende cellen (dag-4 tot dag 3)

Opmerking: retrovirus wordt geproduceerd met behulp van Phoenix-Eco-cellen (Zie de tabel met materialen)19,20. Gebruik de gepaste voorzorgsmaatregelen voor het opwekken van potentieel infectieuze agentia (bij voorkeur met inbegrip van een aangewezen BSL-2 kast en een aparte incubator voor het kweken van getransfunseerde/transduced cellen).

  1. Phoenix-cellen ontdooien (dag-4)
    1. Ontdooien 2 x 106 Phoenix-Eco-cellen. Schaal het aantal Phoenix-cellen op als er meerdere transducties zijn gepland.
    2. Plaat ze in een 10 cm weefselkweek schaal met 10 mL medium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal kalf serum (FCS)).
  2. Passage Phoenix cellen (dag-3)
    1. Verwijder het medium en was met 5 mL van de fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) van Dulbecco.
    2. Voeg 3 mL 0,25% trypsine toe en inincuberen bij 37 °C onder 10% CO2 -atmosfeer gedurende 3 minuten.
    3. Oogst de cellen dan pellet door centrifugeren voor 3 min bij 200 x g. Herplaat cellen met 10 mL vers medium en incuberen bij 37 °C.
  3. Bestraling van Phoenix cellen (dag-1 namiddag)
    1. Om verdere celdeling te minimaliseren, verzamelen Phoenix cellen zoals beschreven in stap 2,2, respenderen in 5 mL medium, en gamma bestraalde cellen op ijs (1000 RAD).
      Opmerking: voorzichtigheid moet worden gebruikt voor stralings werk om blootstelling van het personeel te voorkomen.
    2. Centrifugeer de bestraalde cellen, hervat het verse medium, de plaat bij 2 x 106 cellen (in 10 ml medium)/plate/CAR en inincuberen.
  4. Transfectie (dag 0-ochtend)
    1. Zuig de supernatant uit de Phoenix-cellen, was met 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg voorzichtig 7 ml verlaagd serum medium (bijv. Opti-mem) druppelsgewijs toe aan de zijwand van de plaat om te voorkomen dat de monolayer wordt verstoord. Breng cellen terug naar incubator.
    2. Neem 2 14 mL ronde onderkant polypropyleen buizen en voeg 1,5 mL verlaagd serum medium toe aan elk. Aan één buis, voeg 40 μL transfectie reagens toe (Zie de tabel met materialen).
    3. Voeg aan de andere buis 15 μg AB-CAR-plasmide (gegenereerd in stap 1) en 5 μg envelop en verpakkings plasmide (5 μg pCL-eco) toe. Inincubate buisjes bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    4. Voeg het transfectie reagens mengsel van stap 2.4.2 druppelsgewijs toe aan de tweede buis zonder contact te maken met de zijkanten van de buis en meng door de oplossing 3 keer zachtjes op en neer te pipetteren. Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20 min.
    5. Voeg 3 ml van het mengsel druppelsgewijs toe aan de Phoenix-cellen en plaats het in een incubator voor weefselkweek.
    6. Voeg na 4 – 5 uur 1 mL FCS toe. Kweekcellen 's nachts bij 37 °C.
  5. Gemiddelde verandering (dag 1)
    1. Verwijder het supernatant dat de plasmide/transfection-reagens complexen bevat en gooi deze weg in overeenstemming met de institutionele procedures voor de omgang met infectieuze stoffen. Voeg 4 mL vers, voorverwarmd kweekmedium toe aan de cellen.
  6. Oogst virus voor transductie (dag 2)
    1. Verzamel het virus-bevattende medium uit de Phoenix-cellen met een steriele spuit, filter (0,45 μm) om rest celresten te verwijderen en in een nieuwe buis te verzamelen.
    2. Voeg rhIL-2 voorraad toe aan een eindconcentratie van 200 IE/mL. Gebruik het virus onmiddellijk voor transductie (stap 5,3). Voeg 4 mL vers medium toe aan de Phoenix-cellen en plaats deze in de incubator.
  7. REPEAT virus Collection (dag 3)
    1. Herhaal stap 2,6, maar gooi Phoenix-cellen weg als besmettelijk afval in plaats van vers medium toe te voegen. Deze supernatant wordt gebruikt in stap 5,4.

3. primaire CD8 T-celisolatie en-activering (dag-1 tot dag 0)

Opmerking: Verzamel eerder CD8 T-cellen van vrouwelijke NOD-muizen op 4 tot 5 weken, een tijdpunt voor de ontsteking van het eilandje begint op21,22. Behandel alle muizen na de door IACUC goedgekeurde protocollen. CD8 T-cellen worden verrijkt met splenocyten met behulp van een commerciële negatief selectiekit.

  1. Coating platen met CD3/CD28 antilichamen (dag-1)
    1. Voeg 1 mL van een mengsel van anti-muis CD3 en CD28-antilichamen (beide bij 1 μg/mL in PBS) toe aan elke put van een 24-pits plaatje en inincuberen bij 4 °C 's nachts.
    2. De volgende dag de platen met 1 mL steriele PBS 3 keer wassen voordat de Murine CD8 T-cellen worden toegevoegd (stap 4,1).
      Opmerking: het aantal te gecoat putten varieert per experiment, afhankelijk van het totale aantal geactiveerde CD8 T-cellen dat nodig is.
  2. Verzameling van splenocyten (dag 0)
    1. Euthanferen twee NOD vrouwelijke muizen in de leeftijd van 4 – 5 weken met CO2 inademing gevolgd door onthoofding. Oogst de milt en zet ze op een celzeef weken in 10 mL PBS in een celkweek schotel op het ijs.
    2. In een cel cultuur kap, snijd elke milt in 3 – 5 stukken, druk weefsels met een steriele zuiger van een 3 of 5 mL spuit om te forceren milt fragmenten uit elkaar en laat cellen door het gaas passeren.
    3. Verwijder de rode bloedcellen voorzichtig door het resuspeneren van splenocyten in 1:4 verdunde Red Cell lysisbuffer (1 mL lysisbuffer in 3 mL PBS voor één milt) en inbroed gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Verdun vervolgens 10 μL celsuspensie met trypan blauwe kleurstofoplossing voor het tellen van cellen met een hemocytometer en pellet de rest van de cellen door centrifugeren bij 350 x g gedurende 7 minuten.
  3. Verrijking van CD8 T-cellen (dag 0)
    1. Verrijk CD8 T-cellen door negatieve selectie met behulp van een muis CD8 T cell isolation Kit, volgens de instructies van de fabrikant.
      Opmerking: om een hoge zuiverheid te waarborgen, moet u altijd de celaantallen afronden bij het berekenen van het volume biotinylated-antilichaam dat moet worden toegevoegd (gebruik bijvoorbeeld het volume van de reagentia voorgesteld voor 108 cellen voor een berekende 9,1 x 107 cellen).
    2. Suspendeer celpellets in 400 μL buffer en 100 μL biotin-antilichaam cocktail per 1 x 108 cellen, meng goed en incuberen gedurende 5 minuten in de koelkast (4 °c) om antilichaam binding toe te staan.
    3. Voeg 300 μL etiketterings buffer en 200 μL anti-Biotine micro-Beads toe per 1 x 108 cellen, meng goed en inbroed gedurende 10 minuten bij 4 °c.
    4. Terwijl u wacht op de micro-Bead binding, stelt u de scheidings kolom in op het scheidingsteken. Spoel de kolom door met 3 mL etiketteer buffer te spoelen.
    5. Passeer 1000 μL kraal/celmengsel door een celzeef van 40 μm voordat u deze op de scheidings kolom laadt om celaggregaten te verwijderen. Verzamel de kolom doorstroming in een voorgekoelde buis van 15 mL.
    6. Was de kolom volgens de instructies van de fabrikant en verzamel alle effluent in dezelfde buis. Bepaal het celnummer (zelfde als stap 3.2.4) en verzamel door centrifugeren bij 350 x g gedurende 5 min. was de cellen door resuspendigen in 2 ml volledig T-cel medium (rpmi-1640 met FCS, 2-mercaptoethanol, rhil-2 (200 U/ml), mIL-7 (0,5 ng/ml), zijn , HEPES en penicillaire-streptomycine) en centrifugeren bij 350 x g gedurende 5 min.
    7. Respendeer de cellen in pre-warmed (37 ° c) volledig T-cel medium met een concentratie van 0,25 – 0,5 x 106/ml.

4. T-cel activatie (dag 0 tot 2)

  1. Voeg 2 mL celsuspensie (0,25 – 0,5 x 106/ml) toe aan elke gecoate put van het CD3/CD28-antilichaam gecoate 24-Well plaat uit stap 3.1.2. Gebruik een wervelende beweging om de cellen gelijkmatig te doseren.
    Opmerking: Voeg de cellen toe met een wervelende beweging om ze gelijkmatig te verdelen en de randeffecten te minimaliseren. Als de cellen een cluster langs de rand van de putten, zowel de transductie snelheid en de levensvatbaarheid van de cel zal worden verlaagd.
  2. Als een controle, plaat hetzelfde aantal CD8 T cellen in een enkele niet-gecoate put van de plaat. Incuberen de cellen bij 37 °C met behulp van een 10% CO2 vergasste incubator voor 48 h.
    Opmerking: na 48 h kan de activering worden bevestigd met behulp van een Microscoop; de geactiveerde cellen zullen groter zijn dan de cellen die geen anti-CD3/CD28 antilichamen tegenkwamen.

[plaats figuur 2 hier]

5. transductie van geactiveerde CD8 T-cellen (dagen 1 tot 3)

Opmerking: dit protocol maakt gebruik van een spin-transductie-methode. Een centrifuge met een uitzwaaiende rotor en weefselkweek plaat adapters die een inwendige temperatuur van 37 °C kunnen behouden is vereist. Om maximale efficiëntie te garanderen, op de dag van de transductie pre-warm de centrifuge tot 37 °C voor het verzamelen van het virus.

  1. Voorbereiding van humane fibronectin fragment gecoate platen (dag 1 tot en met dag 2)
    1. Voeg op dag 1 0,5 mL fibronectin (50 μg/mL in PBS) toe aan de putjes van een 24-Wells plaat en inincuberen 's nachts bij 4 °C.
      Opmerking: normaalgesproken zijn twee fibronectin-gecoate putten vereist per plaat van Getranssinfecteerde Phoenix-cellen.
    2. Op dag 2 de fibronectin-oplossing verwijderen en vervangen door 1 mL van 2% boviene serumalbumine (BSA) in PBS. Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om niet-specifieke bindingsplaatsen te "blokkeren".
    3. Was de behandelde putjes met 1 mL steriel PBS. Na het verwijderen van de reinigingsoplossing is de plaat klaar voor gebruik; of kan gedurende maximaal één week bij 4 °C worden verzegeld en bewaard.
  2. Verzameling van geactiveerde CD8 T-cellen (dag 2)
    1. Oogst de geactiveerde CD8 T-cellen, Tel en bereken de levensvatbaarheid van de cel met behulp van trypan Blue of een geschikt geautomatiseerd instrument.
    2. Verzamel cellen door centrifugeren en respenderen bij 5 x 106 levensvatbare cellen/ml voor transductie. Behoud een klein aantal cellen in de cultuur in het volledige T-celmedium in de CO2 -incubator om een controle te bieden voor daaropvolgende fluorescentie geactiveerde celsortering van de getransduceerde cellen (stap 6).
      Opmerking: na activering voor 48 h, het totale aantal cellen moet zijn toegenomen door ongeveer 1,5 vouwen, en hebben een levensvatbaarheid groter dan 95%.
  3. Transductie (dag 2)
    1. Voeg 100 μL geactiveerde CD8 celsuspensie per put (0,5 x 106 cellen) toe aan de fibronectin gecoate plaat. Voeg vervolgens 1,5 – 2 mL virusbevattende medium (vanaf stap 2,6) toe aan elk goed. Meng met een wervelende beweging om de cellen gelijkmatig te doseren (Figuur 2).
    2. Plaats de plaat in een plastic zak met rits en afdichting (om secundaire containment te bieden). Centrifugeer bij 2000 x g voor 90 min bij 37 °c.
    3. Verwijder de plaat uit de centrifuge. In de biologische veiligheid, de kast voorzichtig verwijderen van de plastic zak en ervoor te zorgen dat de buitenkant van de plaat is niet verontreinigd met een medium.
    4. Breng vervolgens de plaat over naar de speciale 37 °C CO2 -incubator. Na 4 uur, verwijder 1 mL van het medium van elke put en vervang met 1 mL voorverwarmde volledige T-cel medium. Vervang de plaat in de CO2 -incubator.
      Opmerking: Behandel alle media uit de getransduceerde cellen als besmettelijk afval.
  4. Tweede transductie (dag 3)
    1. In de speciale biologische veiligheidskast, hellend de plaat met de getransduceerde cellen door op het deksel te rusten en voorzichtig het grootste deel van het medium te verwijderen (laat 100 – 200 μL) om ervoor te zorgen dat u geen contact met de cellen op de bodem van de put.
    2. Voeg het in stap 2,7 verzamelde virus medium toe en herhaal stappen 5.3.2 – 5.3.4.
      Opmerking: in onze ervaring verbetert een derde transductie zelden de algehele efficiëntie. Bovendien zal de levensvatbaarheid van de cellen waarschijnlijk aanzienlijk dalen als een derde transductie wordt gebruikt. Als cellen worden verguld met een hogere concentratie dan 0,5 x 106/well, kunnen de T-cellen samenvloeiing bereiken na de nachtelijke incubatie na de tweede transductie stap. In dit geval, gespleten cellen na de 4 h incubatie op dag 3.
  5. Cellen wassen (dag 4)
    1. Verwijder 1 mL medium van elke put, hervat de cellen in het resterende medium en breng over naar een buis van 15 mL. Was de putjes met 1 mL volledig T-cel medium en voeg toe aan de buis met de gepoolde cellen van elke transductie.
    2. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 7 minuten, spoel vervolgens tweemaal door in 2 mL volledig T-cel medium en pelleting te resuspendigen. Eindelijk respenderen in 2 mL medium en bepaal het celnummer.
      Opmerking: als 1 x 106 cellen oorspronkelijk werden transduced, de opbrengst in dit stadium moet ~ 3 x 106.
  6. Overdracht
    1. Transfer aliquots van 0,5 – 1 x 106 cellen in 2 ml volledig T-cel medium naar de putjes van een nieuwe 24-Wells plaat en incuberen bij 37 °c. Ongeveer 48 – 72 h post-transductie de cellen zijn klaar voor auto-expressie analyse en celsortering.
      Opmerking: het aantal auto-T cellen verdubbelt meestal elke 24 h in dit stadium. Het is van cruciaal belang om ze nooit te laten overgroeien. Splits de cellen onmiddellijk als de dichtheid hoger is dan 2 x 106/ml (of als het medium ooit fel geel wordt). In onze ervaring vermenigvuldigen de auto-T-cellen in 24-en 12-put-platen meer robuust dan bij overdracht naar een groter schip.

6. zuivering van getransduceerde cellen door fluorescentie-geactiveerde cel-sortering (FACS) (dag 5 of dag 6)

  1. Verzamel de cellen.
    1. Regeer de cellen door meerdere malen op en neer te pipetteren (zorg ervoor dat u geen frothing veroorzaakt), breng over naar 15 mL tubes en centrifuge bij 350 x g gedurende 5 minuten.
    2. Respenderen in de sorteer buffer (2% BSA in steriele PBS bevattende gentamicine) bij 1 x 106 cellen/ml. Oogst ook de controle (un-transduced) CD8 T-cellen uit stap 5,2).
      Opmerking: van 1 x 106 cellen op dag 2, een rendement van ~ 2 x 107 getransduceerde cellen wordt verwacht op dit moment.
  2. Was de cellen eenmaal met de sorteer buffer door centrifugeren bij 350 x g gedurende 5 minuten en respendeer bij 1 x 107 cellen/ml in de sorteer buffer. Verwijder een klein aliquot voor de Foxp3GFP compensatie controle (te gebruiken in stap 6.4.1) en beits de rest met gelabelde anti-muis CD8 (kloon 53-6.7; 0,2 μg antilichamen/5 x 106 cellen) door gedurende 20 minuten bij 4 °c te brokken.
    1. Op dezelfde manier, vlek een aliquot van de niet-transduced CD8 T cellen om een compensatie controle te bieden voor de de labelen van de anti-CD8-antilichamen.
      Opmerking: Vermijd het toevoegen van natrium natriumazide aan een buffer, omdat dit giftig voor de cellen is.
  3. Was de gelabelde cellen tweemaal met de sorteer buffer, respendeer in koude Sorteer buffer bij 1 x 107 cellen/ml.
  4. Sorteer de cellen.
    1. Sorteer CD8 GFP+ positieve cellen in voorgekoelde complete T-cel medium (Figuur 3b). Neem een klein aliquot voor analyse na sortering om de zuiverheid te bepalen.
      Opmerking: om de zuiverheid van de gesorteerde cellen te maximaliseren, moeten strakke hekken worden gebruikt. Gebruik een 100 μm nozzle om een hoge cellevens vatbaarheid te garanderen. Minimaliseer de hoeveelheid tijd dat de gesorteerde cellen op ijs worden gehouden. T-cellen die langer dan 3 uur op ijs zijn gehouden, nemen veel langer in beslag dan cellen die minder dan 2 uur gekoeld zijn. Dus, als 3 getransduceerde cellijnen moeten sorteren, verzamelen en labelen van de tweede regel, terwijl de eerste wordt gesorteerd, enzovoort, in plaats van het hebben van de tweede en derde lijnen besteden een langere tijd bij 0 ° c. De uitdrukking van andere T-celmarkeringen zoals CD28 en CD3 kan ook worden bewaakt (figuur 3c), maar is niet essentieel voor sorteer doeleinden.
    2. (Alternatieve Sorteer strategie) Voordat kleuring de bulk populatie, analyseren van de CD8 uitdrukking van een kleine populatie van de getransduceerde T cellen. Als de zuiverheid > 99% is, kan de bulk populatie veilig worden gesorteerd uitsluitend op basis van GFP-expressie.

7. uitbreiding van gesorteerde auto-T-cellen (dag 5 tot 10)

  1. CAR-T-celuitbreiding
    1. Was de gesorteerde auto-T-cellen één keer, dan respendeer in voorverwarmde complete T-cel medium 2,5 – 5 x 105 cellen/ml, en plaat 2 ml aliquots in 24-Well platen.
    2. Tel en Splits de cellen elke 1 – 2 dagen. Meestal verdubbelt het celnummer elke dag tot ~ dag 10, met een levensvatbaarheid die boven de 95% blijft.
      Opmerking: zonder re-stimulatie zullen de auto-T cellen niet meer rond dag 10 en uiteindelijk sterven. Zo moeten T-cel Functionele assays en adoptie overdrachten dienovereenkomstig worden gepland.
  2. Alternatieve uitbreidingsstrategie
    1. Na sortering, cultuur de auto-T cellen in volledige T cel medium met rhIL-2 op 100 U/mL in plaats van 200 U/mL.
      Opmerking: de auto-T-cellen vermenigvuldigen in dit medium een iets trager tempo. Echter, ze zullen vaak blijven vermenigvuldigen tot dagen 11 aan 13 zonder re-stimulatie. Dus, hoewel deze alternatieve uitbreidingsstrategie geen hoger aantal cellen genereert, biedt het een iets langer tijdvenster voor downstream assays die moeten worden uitgevoerd.

8. verificatie van de specificiteit van het antigeen en de functionaliteit van de auto T-cellen.

Opmerking: de bindende specificiteit van auto T-cellen gericht op peptide/MHC-complexen kan worden geverifieerd door tetrameer kleuring7,23. Evenzo kan hun functionaliteit worden bevestigd door het meten van cytokine secretie of cytotoxiciteit na stimulatie door hun verwant liganden. De NIH Tetramer core Facility (TCF) van de Emory University is een aanbevolen bron van "tetramers" en relevante kleurings protocollen.

  1. Peptide-MHC Tetramer kleuring.
    1. Label aliquots van 2 x 105 getransduceerde Car-T-cellen in 100 μL van de sorteer buffer door te bebroeden met ~ 0,6 μg fluorescentiet gelabelde antigeen-specifieke en controle-tetramers bij 37 °c gedurende 2 uur.
    2. Pellet de cellen door centrifugeren gedurende 5 min bij 350 x g, dan twee keer spoelen door te resuspenderen in 0,5 ml van de sorteer buffer en opnieuw centrifugeren. Tot slot, respendeer de cellen in 300 μL van de sorteer buffer en analyseer door Flowcytometrie (Figuur 4).
      Opmerking: voor deze onderzoeken gebruiken we meestal BV421-GELABELDE IAG7-B:9-23 (re) (test) en IAG7-hel (Control) tetramers. In plaats daarvan kan echter een combinatie van fluorophore/tetramer die geschikt is voor de te onderzoeken auto ('s) worden gebruikt. In dit geval moeten de concentratie-en kleurings tijd voor elke gebruikte tetrameer worden geoptimaliseerd. Zowel gesorteerde als niet-gesorteerde auto-T-cellen kunnen worden gebruikt voor tetrameer kleuring.
  2. Specificiteit meting door ligand stimulatie.
    1. Incuberen 2 x 105 GESORTEERDE auto-t-cellen in 200 μL cytokine vrij T-celmedium met geschikte plaat gebonden of cellulaire liganden.
    2. Na 6 – 24 h de productie van cytokine door ELISA of intracellulaire kleuring meten met behulp van de protocollen van de fabrikant.
      Opmerking: voor onze studies van IAG7-b:9-23 omgeleid T cellen, we cultuur de cellen 's nachts met M12C3 Murine B-cell lymfoom cellen uitdrukkenIA G7-b:R3 of "lege"IA G724,25, Verzamel vervolgens de supernatanten en meet uitgescheiden Mouse interferon gamma (IFN-γ) door Elisa26 (Figuur 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meestal is de transductie-efficiëntie met behulp van dit protocol ~ 60-90%. In het experiment getoond in Figuur 3, voorafgaand aan het sorteren van ongeveer, 70% van de CD8 T cellen co-uitgedrukt GFP. Ze hebben ook CD28 en CD3 (figuur 3c) uitgedrukt. Belangrijk is dat alle "test" GFP+ -cellen ook samen met IAG7-b:R3-tetramers worden gekleurd, maar niet met de Control tetrameer (Figuur 4<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor de productie van antigeen-specifieke CD8 CAR-T-cellen door retrovirale transductie. De transductie-efficiëntie van ons protocol is meestal hoog en de robuuste uitdrukking van de auto wordt in het algemeen waargenomen. De uitgebreide auto T-cellen behouden de essentiële kenmerken van de ouder geactiveerde T-cellen en de specificiteit van het antilichaam, en zijn geschikt voor zowel in vitro als in vivo gebruik. We hebben AB-CAR CD8 T-cellen toegepast bij het opnieuw prog...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAb287 en zijn derivaten worden beschermd door een US Patent uitgegeven in 2014.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd gesteund door JDRF subsidies 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-b, en SRA-2-S-2018-648-S-B, een diabetes onderwijs en actie Award, en het Caroline Wiess Law Fund voor onderzoek in moleculaire geneeskunde aan Baylor College of Medicine. Celsortering werd ondersteund door de Cytometrie-en Celsorteerkern op Baylor College of Medicine met financiering van de NIH (S10RR024574 en P30CA125123). Alle peptide-MHC tetramers werden verkregen van de NIH Tetramer core faciliteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-Mercaptoethanol (50mM)Gibco21985-02350 μM
5’ RACE PCRClontech634859
anti-mouse CD28 antibodieseBioscience14-0281-86finale concentratie van 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibodyeBioscience145-2C11finale concentratie van 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γBD Biosciences554410Werkende concentratie van 0.5 µg/ml
BSASigmaA7030
Endo-free Maxi-Prep kitQiagen12362
GentamicinGibco15750-060Eindconcentratie van 50 µg/ml.
Heat inactivated FCSHycloneSH30087.03Eindconcentratie van 10% FCS
HEPES (100X)Gibco15630-0801X
IAg7-CLIP tetramer-BV421NIH tetramer Facility at Emoryper goedkeuringWerkende concentratie van 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421NIH tetramer Facility at Emoryper goedkeuringWerkende concentratie van 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)ThermoFisher51500056Eindconcentratie is 1x
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Separation BufferMiltenyi Biotec130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation KitMiletenyi Biotec Inc130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation KitMiltenyi Biotec130-104-075
Opti-MEM mediumThermoFisher31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)ThermoFisher1507006350 U/ml
Phoenix-ECO cellsATCCCRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco10010-023
pMIG IIAddgene52107
pMSCV-IRES-GFP IIAddgene52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γBD Biosciences551216Werkende concentratie van 3 µg/ml
Red cell lysis bufferSigmaR7767
RetroNectinTakaraT100AWerkende concentratie van 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentratie 105 IU/ul)Peprotech200-02Eindconcentratie van 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentratie 50ng/ul)R&D407-ML-005Eindconcentratie van 0.5ng/ml
RPMI-1640Gibco11875-093
Sterile Cell StrainersFisher Scientific22-363-548
TrypleGibco12605-028

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
  2. Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
  3. Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
  4. Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).
  5. Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).
  6. Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
  7. Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
  8. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
  9. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
  10. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
  11. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  12. Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
  13. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
  14. Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).
  15. Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).
  16. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).
  17. Johnstone, A., Thorpe, R. Immunochemistry in practice. , 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).
  18. Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. Lymphocytes: a practical approach. , 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).
  19. Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).
  20. Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).
  21. Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8 (3), e59701(2013).
  22. Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).
  23. Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).
  24. Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).
  25. Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).
  26. Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Antigeenspecifieke T cellenCAR T celtherapieretrovirale transductieisolatie van primaire cellenflowcytometrische analysetype 1 diabetesmodelbehandeling van auto immuunziektenchimere antigeenreceptorenT celexpansie

Gerelateerde artikelen