Methodenartikel

Modulatie van Tau Subcellulaire lokalisatie als een instrument om de uitdrukking van ziektegerelateerde genen te onderzoeken

DOI:

10.3791/59988

⸱

20 december 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau is een neuronale eiwit aanwezig zowel in het cytoplasma, waar het bindt microtubuli, en in de Nucleus, waar het oefent onconventionele functies, met inbegrip van de modulatie van de ziekte van Alzheimer-gerelateerde genen. Hier beschrijven we een methode om de functie van nucleaire tau te onderzoeken, terwijl alle interferenties uit cytoplasmatische tau worden uitgesloten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau is een microtubulus bindend eiwit uitgedrukt in neuronen en de belangrijkste bekende functie is gerelateerd aan het behoud van cytoskelet stabiliteit. Recent bewijs gaf echter aan dat tau ook aanwezig is in andere subcellulaire compartimenten, waaronder de Nucleus waar het betrokken is bij DNA-bescherming, in rRNA transcriptie, in de mobiliteit van retrotransposons en in de structuur organisatie van de Nucleolus. We hebben onlangs aangetoond dat nucleaire Tau is betrokken bij de uitdrukking van het VGluT1 gen, suggereren een moleculair mechanisme dat de pathologische toename van glutamaat vrijlating in de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer verklaren kan. Tot voor kort was de betrokkenheid van nucleaire tau bij het moduleren van de uitdrukking van doel genen relatief onzeker en dubbelzinnig vanwege technische beperkingen die de uitsluiting van de bijdrage van cytoplasmische tau of het effect van andere downstream-factoren die geen verband houden met nucleaire tau. Om deze onzekerheid te overwinnen, ontwikkelden we een methode om de expressie van doel genen te bestuderen die specifiek zijn gemoduleerd door het nucleaire Tau-eiwit. We werkten met een protocol dat koppels het gebruik van lokalisatie signalen en de subcellulaire fractionering, waardoor de uitsluiting van de interferentie van de cytoplasmatische tau moleculen. Met name is het protocol eenvoudig en bestaat uit klassieke en betrouwbare methoden die algemeen toepasbaar zijn om de nucleaire functie van tau in andere celtypen en cellulaire omstandigheden te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De functies van Tau-eiwit in de Nucleus hebben de afgelopen jaren aanzienlijke belangstelling gekregen, omdat is aangetoond dat het nauw geassocieerd is met nucleïnezuren1,2,3,4,5,6. Inderdaad, een recente genoom-brede studie toonde aan dat tau genic en intergene DNA-sequenties bindt in vivo7. Een rol in de nucleolar organisatie is voorgesteld8,9,10,11. Bovendien is tau voorgesteld om betrokken te zijn bij DNA-bescherming tegen oxidatieve en hyperthermische stress5,10,12,13, terwijl gemuteerde Tau is gekoppeld aan chromosoominstabiliteit en aneuploïdie14,15,16.

Tot nu toe bleven de uitdagingen bij het bestuderen van de functies van tau in het nucleaire compartiment bijna onopgelost vanwege de moeilijkheden bij het ontleden van de specifieke bijdrage van nucleaire tau uit de bijdrage van cytoplasmatische tau. Bovendien zijn de functies die aan tau-moleculen in het nucleaire compartiment worden toegeschreven tot nu toe slechts correlatief omdat ze geen eenduidige demonstratie hebben van de directe betrokkenheid van nucleaire tau-eiwitten. De betrokkenheid van Tau bij de mobiliteit van retrotransposons of in de transcriptie van de rRNA of in de DNA-bescherming11,12,17,18,19 kan ook worden verklaard door de bijdrage van cytoplasmatische tau of door het effect van andere downstream factoren die geen verband houden met nucleaire tau.

Hier bieden we een methode om dit probleem op te lossen door een klassieke procedure te benutten om het nucleaire compartiment te isoleren in combinatie met het gebruik van Tau-constructies 0N4R gelabeld met nucleaire lokalisatie (NLS) of nucleaire export signalen (NES). Deze aanpak elimineert de complexe problemen met betrekking tot mogelijke artefacten als gevolg van de overloop van tau moleculen uit het cytoplasmische compartiment. Bovendien veroorzaken tau-NLS en tau-NES constructies de verrijking of uitsluiting van tau-moleculen uit het nucleaire compartiment, en leveren zij positieve en negatieve controles op de betrokkenheid van nucleaire tau-moleculen in een specifieke functie. Het protocol is technisch eenvoudig en bestaat uit klassieke en betrouwbare methoden die algemeen toepasbaar zijn om de nucleaire functie van tau in andere celtypen te bestuderen, gedifferentieerd of niet, zoals kankercellen die tau-expressie20,21opnieuw activeren. Bovendien, het kan ook worden toegepast op andere eiwitten die aanwezig zijn in zowel het cytoplasma en de Nucleus om te ontleden van biologische functies die verband houden met verschillende compartimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. celcultuur

  1. Cultuur SH-SY5Y cellen (menselijke neuroblastoom cellijn, CRL-2266) in het volledige medium (Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium: nutriënten mengsel F12 [DMEM/F-12] aangevuld met 10% foetaal runderserum [FBS], 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine). Houd de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Kweekcellen in 10 cm platen en splits bij Confluent.

2. celdifferentiatie

  1. Om te differentiëren SH-SY5Y cellen, de dag na de plating, voeg 10 μM retinoïnezuur (RA) om het medium te voltooien voor 5 dagen.
  2. De zesde dag vervangen medium met differentiatie medium: DMEM/F-12 aangevuld met 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamine. Voeg geen FBS of antibiotica toe.
  3. Kweek de cellen in differentiatie medium gedurende 3 dagen.

3. Chimeric Construteert klonen

  1. Bouw tau-NLS construct door het klonen door beperking enzym spijsvertering in frame aan de 3 ' einde van Tau sequentie 0N4R (383aa) de 3xNLS (SV40NLS): 5 '-CCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3 '
    Opmerking: De 3xNLS aan het 3 ' einde van Tau wordt gekloond in de pCMV-tau plasmide voor zoogdier uitingen die de sites van XhoI en BamHI beperken tot de multicloning-site (MCS).
  2. Het genereren van Tau-NES construct door het klonen door beperking enzym spijsvertering in frame aan de 3 ' einde van Tau sequentie 0N4R (383aa) de NES sequentie: 5 '-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTCGTACAA-3 '.
    Opmerking: De NES aan het 3 ' einde van Tau worden gekloond in de pCMV-tau plasmide voor zoogdier uitingen die de EcoRI-en BamHI-beperkings sites exploiteren in de MCS.
  3. Transformeer DH5alpha E. coli stam met 100 ng van DNA uit stap 3,1 of 3,2 en plaat cellen op lb-agar platen met 100 mg/ml ampicillaire. Laat u 's nachts groeien op 37 °C.
  4. Kies een enkele kolonie en Spike de cellen in 5 mL LB met ampicillaire. Laat de cellen groeien bij 37 °C in agitatie 's nachts.
  5. Extract plasmide met een DNA miniprep (tabel van materialen) en sequentie om de constructies te controleren.
  6. Transformeer DH5alpha E. coli stam met de sequentie geverifieerde constructies en plaat cellen op lb-agar platen met ampicillaire. Laat u 's nachts groeien op 37 °C.
  7. Kies een enkele kolonie en Spike de cellen in 5 mL LB met ampicillaire. Laat de cellen groeien bij 37 °C in agitatie gedurende 2 uur.
  8. Plaats de cellen van stap 3,7 in 200 mL LB met ampicillaire. Laat u 's nachts groeien op 37 °C.
  9. Pellet de cellen bij 3.500 x g gedurende 10 min bij 4 °c.
  10. Extract plasmide met een DNA maxiprep (tabel van de materialen).

4. celtransfectie

  1. Zaad 400.000 cellen uit stap 1,1 in 6-well platen of 20.000 cellen in 8-well kamer dia's. Plaat vier monsters: controle cellen die met een lege Vector moeten worden getransffecteerd, cellen die met niet-gelabelde tau worden getransffecteerd, cellen die met tau-NLS en cellen moeten worden getransffecteerd met tau-NES.
  2. De dag na het zaaien transfect 400 ng van het DNA voor elke put met behulp van de kationische lipiden (tabel van de materialen) in 6-well platen of 200 ng van DNA voor elke put voor 8-well kamer dia's, volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Inbroed het DNA en de kationische lipiden afzonderlijk in 250 μL (voor 6-well-platen) of 25 μL (voor 8-well kamer glaasjes) van verlaagd serum medium gedurende 5 minuten bij RT. Combineer ze vervolgens om het DNA-lipide complex te genereren en inincuberen gedurende 20 minuten.
    2. Vervang het kweekmedium door 2 mL (voor 6-well platen) of 250 μL (voor 8-well kamer glaasjes) van vers compleet kweekmedium. Voeg het DNA-lipide complex toe aan de cellen en inincuberen bij 37 °C 's nachts.
  3. Alternatief, transfect DNA met de kationische reagens polyethylenimine (PEI).
    1. Meng 2 μg DNA en 6 μL PEI met 200 μL volledig kweekmedium (voor elk goed in 6-well platen), of 1 μg DNA en 3 μL PEI met 100 μL volledig kweekmedium (voor elke put in 8-well kamer glaasjes) , Vortex en incuberen gedurende 10 minuten bij RT.
    2. Voeg de mix toe aan de cellen en voeg 1,8 mL volledig kweekmedium per put toe in 6-well platen of 150 μL volledig kweekmedium per put in 8-well kamer dia's om het plating volume te bereiken.
  4. Verander het medium de dag na transfectie en voeg de differentiatie media toe zoals beschreven in stap 2,2.

5. immunofluorescentie

  1. Verwijder het kweekmedium en spoel de cellen af met 1x PBS. Repareer cellen met 100% ijskoude methanol gedurende 3 minuten zonder te schudden. Verwijder de bevestigingsoplossing en spoel kort met 1x PBS.
  2. Permeabilize met 0,1% niet-ionische oppervlakteactieve stof in 1x PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Kort, wassen met 1x PBS, 3 keer.
  3. Inincuberen cellen met blokkerende buffer (0,1% Tween 20 en 1% BSA in PBS) gedurende 30 minuten bij RT op een rondschudapparaat.
  4. Inbroed met geschikte primaire antilichamen (bijv. muis monoklonaal anti-Tau13 antilichaam) verwaterde 1:500 in blokkerende buffer 's nachts bij 4 °C op een rondschudapparaat. Verwijder de antilichaam oplossing en was kort met 1x PBS.
  5. Inincuberen met secundaire antilichamen geconjugeerd aan de (bijv. geit anti muis antilichamen geconjugeerd aan Alexa Fluor 633) verdund 1:500 in blokkerende buffer voor 1 uur bij RT. Verwijder de antilichaam oplossing en was kort met 1x PBS 3 keer.
  6. Om kernen te vlekken, inincuberen met DAPI verdund 1:20000 in blokkerende buffer gedurende 10 min bij RT. wassen met 1x PBS 3 keer. Monteer de dekstroken op een glijbaan met anti fade-afdekmedium.

6. Western Blot

  1. Om de celpellet van stap 4,4 te verzamelen, verwijdert u het medium en wast u cellen met PBS. Inincuberen met 500 μL 0,1% trypsine gedurende 4 min bij 37 °C. Voeg een gelijk volume aan volledige medium en respendeer cellen toe.
  2. Verzamel cellen in een buis en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant aan het einde van de centrifugeren. Voeg 1 mL PBS toe, centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant. Bewaar celpellets op ijs voor onmiddellijk gebruik of bevriezing bij-80 °C voor langdurige opslag.
  3. Voor totaal eiwitextracten, inbroed de celpellet voor 30 min op ijs in lysisbuffer (20 mM tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glycerol, 1% octylfenoxy poly (ethyleeneoxy) ethanol, vertakte (tabel van materialen), 10 mm EDTA) aangevuld met protease en fosfatase remmers. Gebruik volgens de overvloed van de pellet 50 μL tot 100 μL lysisbuffer.
    1. Centrifugeer het extract bij 16.000 x g gedurende 15 min. Verzamel het supernatant en Kwantificeer de eiwitconcentratie met een standaard kwantificerings test. Bereid de eiwit monsters voor op de SDS-PAGE door 20 μg eiwitten te mengen met 5 μL 4x Laemmli buffer in een totaal volume van 20 μL en kook bij 100 °C gedurende 5 minuten.
      Opmerking: Het monster kan bij-20 °C worden bewaard.
  4. Voor subcellulaire fractionaties, respendeer cellen uit stap 6,2 in het volledige medium en verzamel 1 x 106 cellen per monster. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 10 minuten om celpellets te verkrijgen voor de volgende stappen.
    1. Om subcellulaire compartimenten te isoleren, fractioneren volgens de specificaties van de kit. Om elke breuk te isoleren, inbroed de celpellet van stap 6,4 met de corresponderende buffer, centrifugeer, verzamel het supernatant en voeg de volgende buffer toe aan de pellet zoals beschreven in 6.4.1.1-6.4.1.5. Voeg in volgorde cytoplasmische extractiebuffer, membraan extractiebuffer, nucleaire extractiebuffer, nucleaire extractiebuffer aangevuld met 5 mM CaCl2 en 3 U/μL micrococcal Nuclease en cytoskelet extractiebuffer.
      Opmerking: Alle buffers moeten worden aangevuld met proteaseremmers. Schaal buffer volumes op basis van het volume van de celpellet.
      1. Om de cytosolische fractie te isoleren, incuberen celpellets in 100 μL ijskoude cytoplasmische extractiebuffer aangevuld met proteaseremmers bij 4 °C met zacht mengen gedurende 10 min. Centrifugeer bij 500 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten en breng de supernatant over naar voorgekoelde buizen.
      2. Voeg 100 μL ijskoude membraan extractiebuffer aangevuld met proteaseremmers aan de pellet uit stap 6.4.1.1, en inbroed bij 4 °C met voorzichtige menging gedurende 10 min. Centrifugeer bij 3.000 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten en verzamel het supernatant.
      3. Voeg voor de oplosbare kern fractie 50 μL kern extractiebuffer, aangevuld met proteaseremmers, toe aan de pellet uit stap 6.4.1.2 en Vortex. Inbroed bij 4 °C gedurende 30 minuten, centrifugeer op 5.000 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten en verzamel het supernatant.
      4. Voeg voor de onoplosbare kern fractie 50 μL kern extractiebuffer toe, aangevuld met proteaseremmers, CaCl2 en micrococcal Nuclease aan de pellet uit stap 6.4.1.3, en Vortex. Inincuberen bij 37 °C gedurende 5 minuten en vervolgens weer Vortex. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT met 16.000 x g en verzamel het supernatant.
      5. Voor de cytoskelet breuk, voeg 50 μL cytoskelet extractiebuffer aangevuld met proteaseremmers aan de pellet uit stap 6.4.1.4, en Vortex. Inbroed 10 min bij RT. Centrifugeer de buis bij 16.000 x g gedurende 5 minuten, verzamel het supernatant en gooi de pellet weg.
        Opmerking: Schaal buffer volumes op basis van het celvolume, zoals aangegeven in het Kit-protocol. Raadpleeg het Kit-protocol voor meer informatie over incubatie en centrifugeren tijd en temperatuur22,23,24,25,26,27,28,29. U ook standaardmethoden gebruiken30 die, door het gebruik van detergenten en door het verhogen van Ionische sterkte en centrifugeersnelheid, de cytosolische, de membraan-gebonden, het cytoskelet en de nucleaire fracties scheidt. De oplosbare nucleaire Fractie en de onoplosbare kern fractie scheiden door de standaard nucleaire extractie buffers te exploiteren. Het monster kan bij-20 °C worden bewaard.
    2. Voeg voor de SDS-PAGE 7 μL 4x Laemmli-buffer toe aan 20 μL subcellulaire fracties verkregen uit stap 6.4.1.1 − 6.4.1.5, kook bij 100 °C gedurende 5 minuten.
  5. Laad monsters op een acrylamidegel en voer elektroforese uit met een constante spanning van 120 V. Breng de eiwitten over naar nitrocellulose membraan bij 250 mA gedurende 90 min.
  6. Controleer de juiste proteïne-gel elektroforese en succesvolle blotting door het membraan gedurende 5 minuten in Ponceau kleurings oplossing te inbroed. Spoel het membraan in gedestilleerd water totdat de achtergrond schoon is. Verwijder de vlek door verder te wassen met tris-gebufferde zoutoplossing met tween 20 (TBST) gedurende 10 minuten op een shaker.
  7. Inbroed het membraan met blokkerende oplossing (5% melk in TBST) gedurende 1 uur bij RT op Shaker. Was 3 keer met TBST gedurende 5 min.
  8. Hybridiseren van het membraan met het primaire antilichaam in blokkerende oplossing (1% melk in TBST) 's nachts bij 4 °C. Was 3 keer met TBST gedurende 5 min.
  9. Hybridiseer het membraan met het HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam in blokkerende oplossing voor 1 uur bij RT. was 3 keer met TBST gedurende 5 min.
  10. Detecteer de proteïne band met behulp van chemiluminescentie. Kwantificeer de intensiteit van de Western Blot-bands door ImageJ. Normaliseer eiwit expressie op het product van een huishoudelijk gen: Histon H2B voor de nucleaire oplosbare en onoplosbare Fractie, gapdh voor de cytoplasmische Fractie en voor totale extracten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De strategie voor het ontleden van de impact van nucleaire tau in genexpressie die de bijdrage van cytoplasmische tau-eiwitten vermijdt, is afgebeeld in Figuur 1. In het kort worden tau-eiwitten die met NLS of NES zijn gelabeld, samengevoegd in of uitgesloten van het nucleaire compartiment. Het functionele effect van deze onbalans is de verandering van de genexpressie, gemeten als het product van het VGluT1 gen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode om de impact van nucleaire tau-eiwitten op genexpressie te meten. Met dit protocol de bijdrage van cytoplasmatische Tau is sterk beperkt. Kritieke stappen van dit protocol zijn de volgende: de differentiatie van menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen, de subcellulaire fractionering en de lokalisatie van Tau-eiwit in het nucleaire compartiment.

Ten eerste is, zoals blijkt uit de representatieve resultaten sectie, de differentiatie van de SH-SY5Y cellen door het toevo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door subsidies van Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgGLife TechnologiesA21050IF 1:500
anti Actin AntibodyBETHYL LABORATORIEA300-485Aanti-rabbit WB 1:10.000
anti GAPDH AntibodyFitzgerald Industries International10R-G109aanti-mouse WB 1:10.000
anti H2B AntibodyAbcamab1790anti-rabbit WB 1:15.000
anti Tau-13 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-21796anti-mouse WB 1:1.000; IF 1:500
anti Tubulin alpha AntibodyThermo Fisher ScientificPA5-16891anti-mouse WB 1:5.000
anti VGluT1 AntibodySigma-AldrichAMAb91041anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay KitEurocloneEMPO14500
BDNFAlomone LabsB-250
Blotting-Grade BlockerBiorad1706404Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMINSigma-AldrichA4503-50g
cOmplete MiniRoche11836170001protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 wellBiorad5678093
DAPIThermo Fisher Scientific62247
DMEM/F-12GIBCO21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low GlucoseEurocloneECM0060L
EDTASigma-Aldrich0390-100mlpH = 8, 0,5 M
Foetal Bovine SerumEurocloneEC50182L
GlycerolSigma-AldrichG5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2005WB 1:1.000
Goat anti-rabbit IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2004WB 1:1.000
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50mlOctylfenoxy poly(ethyleenoxy)ethanol
Immobilon WesternMERCKWBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slidenunc177402
L-glutamineEurocloneECB3000D100X
Lipofectamine 2000 transfection reagentThermo Fisher Scientific12566014cationic lipid
MethanolSigma-Aldrich322415-6X1L
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
NaClSigma-AldrichS3014-1kg
Opti-MEM reduced serum mediumGibco31985070
PEISigma-Aldrich40.872-7
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific1514012210.000 U/mL, 100 mL
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)OXOIDBR0014G
PhosStopRoche4906837001fosfatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen12163Stap 3.10
Retinoic acidSigma-AldrichR2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cellsThermo Fisher Scientific78840
Supported Nitrocellulose membraneBiorad1620097
TC-Plate 6wellSARSTEDT833.920
TCS SP2 laser scanning confocal microscopeLeicaN/A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500mlNon-ionogene oppervlakteactieve stof
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific154000540,50%
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification SystemsPromegaA1330Stap 3.5

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91(2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70(2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577(2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1(2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nucleaire tau functiesubcellulaire fractioneringWestern blot analyseTau NLS Tau NESSH SY5Y cellijncytosolische nucleaire fractiesvesiculaire glutamaattransporteurimmunofluorescentiedetectiechemiluminescentie kwantificering

Gerelateerde artikelen