Modulatie van Tau Subcellulaire lokalisatie als een instrument om de uitdrukking van ziektegerelateerde genen te onderzoeken

Summary

Tau is een neuronale eiwit aanwezig zowel in het cytoplasma, waar het bindt microtubuli, en in de Nucleus, waar het oefent onconventionele functies, met inbegrip van de modulatie van de ziekte van Alzheimer-gerelateerde genen. Hier beschrijven we een methode om de functie van nucleaire tau te onderzoeken, terwijl alle interferenties uit cytoplasmatische tau worden uitgesloten.

Abstract

Tau is een microtubulus bindend eiwit uitgedrukt in neuronen en de belangrijkste bekende functie is gerelateerd aan het behoud van cytoskelet stabiliteit. Recent bewijs gaf echter aan dat tau ook aanwezig is in andere subcellulaire compartimenten, waaronder de Nucleus waar het betrokken is bij DNA-bescherming, in rRNA transcriptie, in de mobiliteit van retrotransposons en in de structuur organisatie van de Nucleolus. We hebben onlangs aangetoond dat nucleaire Tau is betrokken bij de uitdrukking van het VGluT1 gen, suggereren een moleculair mechanisme dat de pathologische toename van glutamaat vrijlating in de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer verklaren kan. Tot voor kort was de betrokkenheid van nucleaire tau bij het moduleren van de uitdrukking van doel genen relatief onzeker en dubbelzinnig vanwege technische beperkingen die de uitsluiting van de bijdrage van cytoplasmische tau of het effect van andere downstream-factoren die geen verband houden met nucleaire tau. Om deze onzekerheid te overwinnen, ontwikkelden we een methode om de expressie van doel genen te bestuderen die specifiek zijn gemoduleerd door het nucleaire Tau-eiwit. We werkten met een protocol dat koppels het gebruik van lokalisatie signalen en de subcellulaire fractionering, waardoor de uitsluiting van de interferentie van de cytoplasmatische tau moleculen. Met name is het protocol eenvoudig en bestaat uit klassieke en betrouwbare methoden die algemeen toepasbaar zijn om de nucleaire functie van tau in andere celtypen en cellulaire omstandigheden te bestuderen.

Introduction

De functies van Tau-eiwit in de Nucleus hebben de afgelopen jaren aanzienlijke belangstelling gekregen, omdat is aangetoond dat het nauw geassocieerd is met nucleïnezuren^1,2,3,4,5,6. Inderdaad, een recente genoom-brede studie toonde aan dat tau genic en intergene DNA-sequenties bindt in vivo⁷. Een rol in de nucleolar organisatie is voorgesteld^8,9,10,

Protocol

1. celcultuur

1. Cultuur SH-SY5Y cellen (menselijke neuroblastoom cellijn, CRL-2266) in het volledige medium (Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium: nutriënten mengsel F12 [DMEM/F-12] aangevuld met 10% foetaal runderserum [FBS], 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine). Houd de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂. Kweekcellen in 10 cm platen en splits bij Confluent.

2. celdifferentiatie

1. Om te differentiëren SH-SY5Y cellen, de dag na de plating, voeg 10 μM retinoïnezuur (RA) om het medium te voltooien voor 5 dagen.
2. De zesde dag vervangen medium met differentiati....

Results

De strategie voor het ontleden van de impact van nucleaire tau in genexpressie die de bijdrage van cytoplasmische tau-eiwitten vermijdt, is afgebeeld in Figuur 1. In het kort worden tau-eiwitten die met NLS of NES zijn gelabeld, samengevoegd in of uitgesloten van het nucleaire compartiment. Het functionele effect van deze onbalans is de verandering van de genexpressie, gemeten als het product van het VGluT1 gen.

Discussion

We beschrijven een methode om de impact van nucleaire tau-eiwitten op genexpressie te meten. Met dit protocol de bijdrage van cytoplasmatische Tau is sterk beperkt. Kritieke stappen van dit protocol zijn de volgende: de differentiatie van menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen, de subcellulaire fractionering en de lokalisatie van Tau-eiwit in het nucleaire compartiment.

Ten eerste is, zoals blijkt uit de representatieve resultaten sectie, de differentiatie van de SH-SY5Y cellen door het toevo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A21050	IF 1:500
anti Actin Antibody	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	anti-rabbit WB 1:10,000
anti GAPDH Antibody	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	anti-mouse WB 1:10,000
anti H2B Antibody	Abcam	ab1790	anti-rabbit WB 1:15,000
anti Tau-13 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody	Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	anti-mouse WB 1:5,000
anti VGluT1 Antibody	Sigma-Aldrich	AMAb91041	anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
Blotting-Grade Blocker	Biorad	1706404	Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose	Euroclone	ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8, 0.5 M
Foetal Bovine Serum	Euroclone	EC50182L
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	WB 1:1,000
Goat anti-rabbit IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1:1,000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western	MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide	nunc	177402
L-glutamine	Euroclone	ECB3000D	100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher Scientific	12566014	cationic lipid
Methanol	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL, 100 mL
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	OXOID	BR0014G
PhosStop	Roche	4906837001	phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163	Step 3.10
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells	Thermo Fisher Scientific	78840
Supported Nitrocellulose membrane	Biorad	1620097
TC-Plate 6well	SARSTEDT	833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope	Leica	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	15400054	0.50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems	Promega	A1330	Step 3.5