Methodenartikel

Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

DOI:

10.3791/59989

⸱

13 oktober 2019

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Chemistry, High Point University, 3Biotechnology Program and the Department of Molecular Biomedical Sciences, North Carolina State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode is nuttig voor het kwantificeren van de vroege dynamiek van cellulaire adhesie en het verspreiden van verankerings afhankelijke cellen op het fibronectin. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de effecten van veranderde redox homeostase op celspreiding en/of celadhesie-gerelateerde intracellulaire signalering trajecten te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hechting en verspreiding van cellen op de extracellulaire matrix (ECM) zijn essentiële cellulaire processen tijdens de organismale ontwikkeling en voor de homeostase van volwassen weefsels. Interessant is dat oxidatieve stress deze processen kan veranderen en zo bijdraagt aan de pathofysiologie van ziekten zoals gemetastaseerde kanker. Daarom kan het begrijpen van het mechanisme (s) van hoe cellen hechten en zich verspreiden op de ECM tijdens verstoringen in redox status inzicht geven in de normale en ziektetoestanden. Hieronder beschreven is een stapsgewijs protocol dat een immunofluorescentietest gebruikt om specifiek celadhesie en verspreiding van vereeuwigd fibroblast cellen op fibronectin (FN) in vitro te kwantificeren. Kort, verankerings afhankelijke cellen worden vastgehouden in suspensie en blootgesteld aan de ATM kinase remmer Ku55933 voor het opwekken van oxidatieve stress. Cellen worden vervolgens geplateerd op een FN-gecoat oppervlak en mogen voor vooraf bepaalde perioden worden bevestigd. Cellen die bevestigd blijven, zijn vast en gelabeld met fluorescentie-antilichaam markers van hechting (bijv. paxiline) en verspreiden (bijv. F-actin). Gegevensverzameling en-analyse worden uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, waaronder een epifluorescentie Microscoop en gratis beschikbare Fiji-software. Deze procedure is zeer veelzijdig en kan worden aangepast voor een verscheidenheid aan cellijnen, ECM-eiwitten of remmers om een breed scala aan biologische vragen te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celmatrix verklevingen (d.w.z. focale verklevingen) zijn grote en dynamische multimoleculaire proteïne-complexen die de hechting en verspreiding van cellen bemedieren. Deze processen zijn essentieel voor weefsel ontwikkeling, onderhoud en fysiologische functie. Focale verklevingen zijn samengesteld uit membraan-gebonden receptoren, zoals integrinen, evenals steigers eiwitten die cytoskelet actine koppelen aan de extracellulaire matrix (ECM)1. Deze complexen zijn in staat om te reageren op fysiochemische signalen die aanwezig zijn in de extracellulaire omgeving door het activeren van verschillende signalering transductie trajecten. Als zodanig, focale adhesies dienen als signalering centra te propageren extracellulaire mechanische aanwijzingen in een aantal cellulaire processen, met inbegrip van gerichte migratie, celcyclus regulering, differentiatie, en overleving1,2. Een groep van signalering moleculen die reguleren en interactie met focale adhesies omvat leden van de familie van de Rho van kleine GTPases. Rho GTPases zijn belangrijke eiwitten die de Celmigratie en adhesie dynamiek reguleren via hun specifieke spatiotemporele activatie3. Niet verrassend, disregulatie van de Rho eiwit functie is betrokken bij een aantal menselijke pathologieën zoals metastase, angiogenese, en anderen. Van bijzonder belang, cellulaire redox status speelt een overheersende rol in de modulatie van de Celmigratie en adhesie. Veranderingen in redox homeostase, zoals stijgingen van de reactieve zuurstof soorten (Ros), zijn aangetoond dat het reguleren van de Rho-eiwit activiteit, evenals adhesie, in een aantal celtypen en menselijke ziekten4,5,6 ,7,8. Bijvoorbeeld, personen die lijden aan de neurologische aandoening ataxie-Telangiectasia (A-T), die wordt veroorzaakt door een mutatie in de DNA-schade herstel serine/Threonine kinase A-T-gemuleerd (ATM), hebben een verhoogd risico op gemetastaseerde kanker9, 10. Verlies van ATM kinase activiteit bij deze patiënten en cellijnen, hetzij door genetische mutatie of chemische remming, resulteert in hoge niveaus van oxidatieve stress als gevolg van disfunctie van de pentose fosfaat pathway7,11, 12. Bovendien hebben recente studies van het laboratorium een pathofysiologische rol voor ROS in A-T belicht door de cytoskelet dynamiek (d.w.z. adhesie en verspreiding) te veranderen als een direct gevolg van het activeren van de Rho familie GTPases in vitro5. Uiteindelijkkunnen deze veranderingen in de cytoskelet dynamiek veroorzaakt door de activering van de familie Rho leiden tot het verhoogde risico van gemetastaseerde kanker bij A-T patiënten5,13. Daarom kan het begrijpen van het samenspel tussen celmatrix interacties tijdens oxidatieve stress inzicht geven in de regulering van adhesie en verspreiding. Deze studies kunnen ook het podium voor verdere onderzoeken naar een mogelijke rol voor Rho familie GTPases in deze signalering processen.

Hierin beschreven is een protocol voor het bestuderen van de vroege cellulaire dynamiek van adhesie assemblage en verspreiding tijdens oxidatieve stress veroorzaakt door remming van ATM kinase activiteit. Deze test is gebaseerd op het goed gekarakteriseerde mechanisme van verankerings afhankelijke cellen adhesie aan het ECM-eiwit fibronectine (FN). Wanneer cellen in suspensie worden geplateerd op FN, coördineren verschillende Rho gtpases de controle van de actine cytoskelet remodellering3,14. Morfologische veranderingen worden waargenomen als cellen verschuiven van ronde en cirkelvormig in uiterlijk tot afgevlakt en uitgevouwen. Gelijktijdig met deze waarnemingen is de ontwikkeling van talrijke matrix verklevingen met de ECM. Deze veranderingen worden toegeschreven aan de bifasische activering van rhoa met Rac1 tijdens het eerste uur als cellen zich hechten en verspreiden 15,16.

Een verscheidenheid van methoden zijn gebruikt voor het onderzoeken van adhesie morfologie en dynamiek, alsmede de verspreiding van cellen. Deze methoden zijn echter gebaseerd op geavanceerde, op lange termijn, Live-Imaging totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) of confocale microscopie systemen. Gebruikers moeten dus toegang hebben tot gespecialiseerde apparatuur en software. Bovendien maakt de set-up tijd die nodig is voor deze bio-imagingsystemen het vastleggen van vroege adhesie gebeurtenissen uitdagend, vooral bij het testen van meerdere remmers of behandelings condities gelijktijdig.

De hier beschreven methoden bieden een eenvoudige, economische en toch kwantitatieve manier om parameters te beoordelen die de adhesie-assemblage beheersen en in vitro verspreiden. Het protocol wordt uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, zoals een epifluorescentie-Microscoop en een CCD-camera. Deze bepaling omvat het toepassen van verankerings afhankelijke cellen op een oppervlak met FN-coating na een periode van oxidatieve stress veroorzaakt door chemische remming van ATM kinase activiteit, die eerder is aangetoond5. Na het bekleden zijn cellen toegestaan om te hechten en zich te hechten voor gespecificeerde lengtes van tijd. Niet-bevestigde cellen worden weggespoeld, terwijl de bijgevoegde cellen zijn bevestigd en geëtiketteerd met fluorescentie-antilichamen tegen markers van hechting (bijv. paxiline) en verspreiden (bijv. F-actin)2,5. Deze eiwitten worden vervolgens gevisualiseerd en opgenomen met behulp van een epifluorescentie Microscoop. Daaropvolgende data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van gratis beschikbare Fiji-software. Bovendien kan deze methode worden aangepast om de adhesie dynamiek onder een breed scala aan omstandigheden te onderzoeken, waaronder verschillende ECM-eiwitten, behandeling met verschillende oxidanten/celkweek omstandigheden of een verscheidenheid aan verankerings afhankelijke cellijnen om een breed scala aan biologische vragen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparaten

Opmerking: het hieronder beschreven protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met REF52 cellen en ATM+/+ of ATM-/- menselijke fibroblasten. Voor andere celtypen is mogelijk verdere optimalisatie vereist, zoals beschreven in de sectie opmerkingen en probleemoplossing hieronder.

  1. Maak 500 mL volledig celkweekmedium voor REF52 cellen. Tot 500 mL hoge glucose bevattende Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) toevoegen 10% FBS, 2 mM L-glutamine, en 100 eenheden/mL penicillaire-streptomycine.
  2. Bereid een 25 μg/mL oplossing van fibronectin (FN) door 300 μL van 1 mg/mL FN-oplossing toe te voegen aan 12 mL steriele 1x fosfaat gebufferde Saline (PBS), pH 7,4. Meng goed.
  3. Bereid een 0,5% (w/v) penitentiaire (d.w.z. vetzuur vrij) bovine serumalbumine (dlbsa) oplossing in serumvrij DMEM celkweekmedium. Voeg 0,5 g dlBSA toe aan 100 mL serum vrije DMEM medium. Meng de oplossing goed, maar niet Vortex. Steriel filter de oplossing in een nieuwe steriele container met een spuit filter van 0,22 μM voor gebruik. Bewaren bij 4 °C.
  4. Maak 3,7% Paraformaldehyde oplossing door 3,7 g Paraformaldehyde op te lossen in 100 mL 1x PBS. Gebruik zachte hitte en roeren om de Paraformaldehyde in oplossing te krijgen.
    Opmerking: de Paraformaldehyde-oplossing is lichtgevoelig en moet worden beschermd tegen licht. Het is goed voor maximaal een week wanneer opgeslagen bij 4 °C.
    VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is giftig, ontvlambaar, corrosief en een gevaar voor de gezondheid. Lees vóór gebruik het veiligheidsinformatieblad voor Paraformaldehyde. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren, inclusief oogschild, gelaatsscherm, deeltjes masker met volledige gezichtsbehandeling, handschoenen en Labcoat.
  5. Bereid de permeabilization oplossing met 0,2% niet-ionische oppervlakteactieve stof in 1x PBS (v/v). Voeg voor 100 mL langzaam 0,2 mL Triton X-100 toe aan 100 mL 1x PBS, terwijl je roeren.
  6. Maak de immunofluorescentie blokkerende buffer met 2,5% BSA, 5% geit serum en 0,05% niet-ionische oppervlakteactieve stof (w/v/v) opgelost in 1x PBS-oplossing. Voeg voor 100 mL 5 mL geit serum, 2,5 g BSA en 0,05 mL Triton X-100 toe in ~ 95 mL 1x PBS, terwijl het roeren.
  7. Groei REF52 cellen in DMEM complete kweekmedium in een 10 cm2 (of een andere grootte van het vat) cel cultuur behandelde plaat in een cel cultuur incubator bij 37 °c en 5% Co2.

2. coating celkweek platen met de extracellulaire matrix proteïne fibronectin

Opmerking: Voer deze sectie uit met aseptische techniek en steriele reagentia in een BSL-2 gecertificeerde laminaire stroom afzuigkap. Zie afbeelding 1a voor een overzicht van belangrijke stappen vóór het begin.

  1. Gebruik een door een weefselkweek gecertificeerde 24-put plaat en plaats een glazen dekglaasje (12-CIR-1) in elke put. Label de plaat volgens Figuur 1b.
  2. Pipetteer 500 μL van de FN-oplossing van 25 μg/mL op elke put van een 24-put plaat.
  3. Pipetteer de oplossing over elke afdek een paar keer om een gelijkmatige coating en volledige onderdompeling te garanderen. Plaats het deksel terug op de plaat.
  4. Inculeer de plaat in een cel kweek incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor 1 uur.
    Opmerking: u ook overnachten bij 4 °C.
  5. Na 1 h, verwijder de plaat uit de incubator en aspireren de FN-oplossing uit de putten.
  6. Spoel putten driemaal met 500 μL 1x PBS. Aspirate de laatste Wash van 1x PBS.
  7. Blok putten met 500 μL 0,5% dlBSA-oplossing voor een minimum van 15 min bij 37 °C en 5% CO2.
  8. Aspirate de dlBSA-oplossing voorafgaand aan het plateren van cellen in stap 3 hieronder.
    Opmerking: Voeg bij het opslaan van de platen 500 μL 1x PBS toe aan elke afdekplaat na de aspiratie van de dlBSA-oplossing. De platen kunnen dan gedurende maximaal één week bij 4 °C worden bewaard.

3. voorbereiding van verankerings afhankelijke cellen voor de adhesie test

Opmerking: Voer deze sectie uit met aseptische techniek en steriele reagentia in een BSL-2 gecertificeerde laminaire stroom afzuigkap.

  1. Ten minste 30 minuten voorafgaand aan de celplating, pre-warm de volgende oplossingen: DMEM complete medium, dlBSA oplossing, 1x PBS, 0,5% trypsine-EDTA oplossing, en trypsine neutraliserend serum (TNS) in een 37 ° c waterbad.
  2. Beginnend met een confluente monolaag van REF52 cellen in een 10 cm2 -schaal, was de cellen tweemaal met 6 ml warm 1x PBS. Serum verhongeren de cellen gedurende ten minste 1 uur (afhankelijk van het celtype) in 6 mL warme dlBSA-oplossing bij 37 °C en 5% CO2.
  3. Spoel cellen met 6 ml opgewarmde 1x PBS, aspiraat PBS en voeg 1,5 ml warme 0,5% trypsine-EDTA-oplossing toe.
  4. Plaats cellen in een celkweek incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor ~ 2 min.
  5. Observeer de cellen onder een lichte Microscoop om ervoor te zorgen dat de loslating is voltooid. Als de cellen na het tikken op de plaat op het tafelblad nog steeds vastzitten, keer dan nog 2 minuten terug naar de incubator van 37 °C om de cellen zo weinig tijd te geven als nodig is.
  6. Pipetteer 1,5 mL warme trypsine neutraliserende oplossing (TNS) naar de schaal om trypsinoisatie te stoppen en losgekoppelde cellen te verzamelen. Pipetteer de oplossing meerdere malen op en neer over de bodem van de plaat om alle overgebleven aanhandige cellen te verwijderen. Als cellen clumpy lijken, verder wrijf de celsuspensie door zachtjes pipetteren op en neer over de achterkant van het gerecht.
  7. Tel cellen met behulp van trypan blauwe uitsluiting en een hemocytometer onder een lichte Microscoop. U ook een geautomatiseerde cel teller gebruiken.
  8. Verwijder een geschikte hoeveelheid cellen om een 1,0-3,0 x 104 cellen/ml celsuspensie in 5 ml dlbsa in een conische buis van 15 ml te maken.
  9. Centrifugeer cellen bij ~ 300 x g gedurende 5 minuten met een vaste hoekrotor in een tafel-top centrifuge.
  10. Zuig de supernatant van de celpellet en rebreng de cellen in een totaal van 7 mL warme dlBSA oplossing. Laat de cellen niet te confluente zijn bij het bekleden van dekslip, maar gelijkmatig verdeeld met weinig cellen die elkaar raken.
  11. Verdeel de celsuspensie gelijkmatig in 2 15 mL conische buizen, één voor het voertuig alleen controle (DMSO) en één voor Ku55933 (ATM kinase remmer, oxidant)5. Zorg ervoor dat elke buis 3,5 mL van de celsuspensie bevat.
  12. Met behulp van een buis Rotator, draaien de buizen op 37 ° c voor 90-120 min in een cel cultuur incubator.
  13. 30 min voor het beplating, voeg een eindconcentratie van 10 μM Ku55933 en DMSO (1:1000) toe aan elke respectieve buis. Plaats de celsuspensie weer op de Rotator voor de resterende tijd.
  14. Onmiddellijk voorafgaand aan het beplating van de cellen, haalt u de 24-put plaat uit de incubator en aspireren de dlBSA oplossing.
  15. Na het draaien van de celsuspensie voor 90-120 min, verwijder 500 μL celsuspensie van elke behandelingsgroep en voeg toe aan één FN gecoate afdek in de 24-put plaat uit stap 2 zoals afgebeeld (Figuur 1b). Retourneer de plaat naar de 37 °C en 5% CO2 celkweek incubator en de celsuspensie terug naar de rotatie.
  16. Na het beplating van de celsuspensie op de FN bedekte-dekstroken, toestaan cellen te houden voor de gewenste lengte van de tijd (bijv., 10 min, 15 min, 20 min, 30 min) en dan onmiddellijk overgaan tot stap 4.

4. celfixatie en antilichaam kleuring voor immunofluorescentie

Opmerking: de volgende stappen worden uitgevoerd onder niet-steriele omstandigheden en bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld.

  1. Na de gewenste tijd voor hechting is verstreken, aspireren de cel oplossing van elke dekslip in de plaat.
  2. Breng met behulp van de zijkanten van de put 500 μL 3,7% Paraformaldehyde oplossing op elke dekslip en wacht 10-15 min.
  3. Verwijder de Paraformaldehyde oplossing en was elke dekslip met 500 μL 1x PBS voor een totaal van twee keer.
    Opmerking: het afval van Paraformaldehyde op verantwoorde wijze afvoeren volgens het milieubeschermings-en veiligheidsplan van de instelling.
  4. Aspireren van de PBS, en permeabilize cellen op elke afdek met 500 μL 0,2% Triton X-100 in 1x PBS (v/v) voor 10-15 min bij kamertemperatuur.
  5. Was elke dekslip met 500 μL 1x PBS driemaal.
  6. Blokkeer cellen op elke dekslip met 500 μL immunofluorescentie blokkerende buffer met 5% geit serum, 2,5% BSA en 0,05% Triton X-100 opgelost in een 1 X PBS-oplossing gedurende 30-60 minuten.
  7. Verdun de primaire anti-paxillin antilichaam (1:250) in de blokkerende buffer. Meng goed en voeg 200 μL van de antilichaam oplossing toe aan elke dekslip. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
    Opmerking: als alternatief kan de primaire antilichaam oplossing 's nachts bij 4 °C worden geïnineerd. Er zijn veel gemeenschappelijke focale adhesie markers die kunnen worden gebruikt voor kleurings adhesie complexen en daaropvolgende FA-analyse. Deze omvatten antilichamen tegen de volgende eiwitten: integrine subeenheden (β1, Α5, of αV), Talin, of vinculin2.
  8. Aspireren de antilichaam oplossing, en was elke dekslip met 500 μL 1x PBS driemaal gedurende 10 min elk. Bescherm de monsters tegen licht vanaf dit punt naar voren.
  9. Verdun de phalloidin F-actin-sonde die is geconjugeerd met de rode fluorescerende Alexa 594 Dye (1:1000) en de geit-anti-muis 488 fluorescerend secundair antilichaam (1:400) in dezelfde blokkerende bufferoplossing. Meng goed en voeg gedurende 30 minuten 200 μL van de antilichaam oplossing toe aan elke dekslip.
    Opmerking: er kunnen ook Fluorescendig geconjugeerde secundaire antilichamen van andere soorten worden gebruikt. Het gebruik van antilichamen van andere soorten zal echter moeten worden gewijzigd in het blokkerende buffer serum.
  10. Aspireren de antilichaam oplossing, en was elke dekslip met 500 μL 1x PBS driemaal gedurende 10 min elk.
  11. Zuig de 1x PBS op en spoel één keer met 500 μL dIH2O.
  12. Monteer de dekstroken op Microscoop-dia's met behulp van een anti-fade-bevestigings medium met DAPI.
  13. Laat de Microscoop-dia's 's nachts in het donker op kamertemperatuur zetten.
  14. Bewaar Microscoop glaasjes in het donker bij 4 °C voor de lange termijn opslag en tot beeldvorming.
    Opmerking: afbeelding met behulp van standaard immunofluorescentie technieken. Het wordt aanbevolen om een krachtige olie-onderdompeling 60x objectief lens te gebruiken om te zorgen voor voldoende resolutie om de focale verklevingen en perifere ruches bij celranden op te merken. Verzamel afbeeldingen van 20-30 cellen in meerdere weergave gebieden voor elke dekslip onder elke behandelings voorwaarde en-tijd. Van gecombineerde replicaten moet dit ten minste 60 cellen opleveren om statistische analyses uit te voeren. Bewaar en exporteer fluorescentie beelden als een. TIFF-bestand met een resolutie van minimaal 300 dpi.

5. kwantificeren van stress vezels, celcirculariteit en focale adhesie vorming

Opmerking: de volgende beeld analyses worden uitgevoerd met de nieuwste versie van het open source Imaging processing pakket Fiji is just image J (Fiji), dat gratis kan worden gedownload op (http://fiji.sc/).

  1. Algemene beeldverwerking
    Opmerking: alle afbeeldingen moeten worden voorbereid voor computationele analyses door stappen 5.1.1-5.1.5 hieronder uit te voeren (Figuur 2). Daarna kunnen alle of alle daaropvolgende kwantificerings procedures worden geselecteerd.
    1. Open de. TIFF fluorescentie beeld met behulp van Fiji. Zorg ervoor dat de afbeeldingen 8-bits en grijstinten zijn.
    2. Selecteer beeld-aanpassen-venster/niveau en selecteer automatisch (afbeelding 2a).
    3. Selecteer proces-aftrekken achtergrond om de achtergrond fluorescentie af te trekken. Controleer glijdende paraboloïde en selecteer de optie van een rollende kogel straal van 50 pixels (Figuur 2b).
      Opmerking: als u de juiste grootte voor de RADIUS van de Rolling Ball wilt controleren, selecteert u het gereedschap lijn en tekent u een straal op de grootste hechting in de afbeelding. Selecteer meting om de lengte van de getekende lijn te controleren. Als de waarde van de straal te groot is, zullen functies zoals verklevingen verloren gaan in de afbeelding. Als de straal te klein is, zal het aanleiding geven tot artefacten in de verwerkte afbeelding als gevolg van achtergrondruis.
    4. Selecteer beeld-aanpassen-helderheid/contrast om de intensiteit van de hechting over de achtergrond te controleren. Indien nodig aanpassen.
      Opmerking: als u de helderheid/het contrast wilt optimaliseren en het signaal niet wilt verzaken, gebruikt u het opzoek gereedschap van de afbeelding om het histogram te bekijken om de helderheid/het contrast aan te passen.
    5. Selecteer de volgende parameters onder analyseren-set metingen: gebied, gemiddelde grijswaarde, vorm descriptors en geïntegreerde dichtheid.
  2. Stress Fiber vorming analyse
    Opmerking: stress vezels kunnen op meerdere manieren worden gekwantificeerd, afhankelijk van het fenotype.
    1. Tel het aantal cellen met stress vezels als een percentage over het totale aantal cellen. Deze analyse is het beste als er visuele verschillen in het aantal stress vezels gevormd onder verschillende experimentele omstandigheden.
    2. Tel het aantal stress vezels die de cel dwars door de cellen. Deze analyse zorgt voor de vergelijking van het aantal stress vezels gevormd per cel.
    3. Meet de totale intensiteit van de fluorescentie die door de phalloidine (bijv. F-actin) wordt gegeven per cel17,18. Deze methode zal drastische verhogingen/dalingen in de intensiteit van de fluorescentie als gevolg van F-actin kleuring markeren.
      1. Stel de parameters voor de meting in stap 5.1.5 hierboven.
      2. Selecteer het gereedschap FreeHand in de werkbalk van Fiji en traceer handmatig de cel (en) die van belang is. Selecteer analyseren-meten. Er wordt een nieuw venster weergegeven met de geselecteerde Meetparameters.
      3. Selecteer het gereedschap FreeHand in de werkbalk van Fiji en traceer handmatig een lege ruimte zonder dat er cellen aanwezig zijn. Selecteer analyseren-meten. Deze meting zal dienen als achtergrond fluorescentie.
      4. Gebruik de onderstaande vergelijking om de totale F-actin fluorescentie per cel te bepalen:
        figure-protocol-1
        Opmerking: de resulterende meting kan worden genormaliseerd en vergeleken met andere cellen om F-actin fluorescentie per cel te geven.
  3. Celcirculariteit analyse
    Opmerking: informatie over het celgebied (een indicator van het verspreiden van cellen na verloop van tijd), evenals, de circulariteit kan ook worden opgenomen. Deze meting wordt gegeven als een verhouding tussen 0 en 1 als een manier om cellen te kwantificeren die langwerpig zijn tot ronde, respectievelijk.
    1. Selecteer het gereedschap FreeHand in de werkbalk van Fiji en traceer een afzonderlijke cel. Selecteer afbeelding-meet en noteer het celgebied en de omtrek metingen voor elke cel. Herhaal deze procedure voor elke cel.
      Opmerking: onder de functie metingen instellen wordt circulariteit geleverd als de meting van de vorm descriptors (stap 5.1.5).
    2. Tel handmatig met actin verrijkte ruffling of uitsteeksels per cel zoals afgebeeld in Figuur 3 en Figuur 4.
  4. Analyse van de focale hechting
    Opmerking: voordat u de focale adhesie analyse uitvoert, installeert u de Mexican Hat filter plugin op de nieuwste versie van Fiji. Het volgende protocol is gewijzigd uit eerdere onderzoeken19,20,21.
    1. Selecteer proces-verbeter lokaal contrast (Clahe) met een blokgrootte van 19, histogram bakken 256 en een maximale helling van 6, zonder masker en niet snel. (Figuur 2c)
    2. Selecteer process-filters-Gaussiaanse vervaging met een Sigma (straal) van 2,0 om de afbeelding te filteren (figuur 2D).
    3. Selecteer plugins-Mexican Hat filter (MHF) met een straal van 2,0 (figuur 2e).
    4. Run Threshold en selecteer donkere achtergrond en over/onder met behulp van Huang of ISODATA als de drempelwaarde methode. Selecteer automatische drempelwaarde.
      Opmerking: deze stap zorgt ervoor dat verklevingen worden gemarkeerd, maar ook verschillend van elkaar.
    5. Selecteer Analyseer-Analyseer deeltjes met de volgende parameters geselecteerd: grootte = 20, pixels-oneindig en circulariteit = 0.00-0.99. Controleer de contouren om de juiste detectie en scheiding van focale verklevingen te garanderen.
      Opmerking: deze resultaten leveren het aantal, het gebied en de vorm beschrijving van individuele focale verklevingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een algemeen schema van de experimentele opstelling

Figuur 1 vertegenwoordigt het algemene schema voor de celadhesie en het verspreidings protocol beginnend met de serum verhongering van REF52 cellen en eindigend met computationele analyse van verworven fluorescentie beelden. De belangrijkste stappen in het protocol worden geïllustreerd in de tijdlijn. Opmerking, stap 2 van het protocol beschrijft de bereiding van de FN-gecoate dekstroken, die gelijktijdig moeten wo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol is een veelzijdige en voordelige manier om snel een aantal verankerings afhankelijke celtypen te schermen voor dynamische cytoskelet-remodellering tijdens het verspreiden van cellen. In het bijzonder onderzoekt deze methode kwantitatief stress vezels en focale adhesie vorming tijdens oxidatieve stress wanneer cellen zich houden aan FN (Figuur 1a). Bovendien kunnen deze cellulaire fenotypes een regelgevende rol suggereren voor leden van de familie Rho van kleine g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken drs. Scott R. Hutton en Meghan S. Blackledge voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de High Point University Research en gesponsorde programma's (MCS) en het biotechnologie programma aan de North Carolina State University (MCS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% Trypsin-EDTA (1x)Gibco by Life Technologies25300-054celldissociatie
10 cm2 schaaltjesCell Treat229620steriel, behandeld voor weefselkweek
15 mL conische buisjesFisher Scientific05-539-5steriele
1X Fosfaat Buffered SalineCorning Cellgro21-031-CVPBS, steriele, vrij van Mg2+ en Ca2+
24-well schaaltjes behandeld voor weefselkweekFisher Scientific07-200-740steriele, behandeld voor weefselkweek
4°C koelkastFisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primaire antilichaam (clone 165)BD Transduction Laboratories610620marker van focale adhesies
AspiratorArgosEV310
BioveiligheidskastNuairNU-477-400Klasse II, Type A, serie 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) PoederFisher ScientificBP9704-100dlBSA
Dimethyl SulfoxideFisher ScientificBP231-100organisch oplosmiddel om Ku55933 op te lossen
Dulbecco's Modified Eagle Media, Hoge GlucoseFisher Scientific11965092REF52 basiscelkweekmedium
Fetaal bovien serumFisher Scientific16000044gecertificeerd, aanvulling op celkweekmedium
FijiNational Institutes of Healthhttp://fiji.sc/beeldanalyseprogramma
Filter spuitFisher Scientific6900-25020.2 µM, steriele
Glazen deksels (12-Cir-1.5)Fisher Scientific12-545-81autoclaveer in folie om te steriliseren
Geit anti-muis IgG secundair antilichaam Alexa Fluor 488InvitrogenA11001fluorescent secundair antilichaam, lichtgevoelig
GeitenserumGibco by Life Technologies16210-064onderdeel van blokkeringsoplossing voor immunofluorescentie
HemocytometerFisher Scientific22-600-107voor celtelling
Human Plasma FibronectinGibco by Life Technologies33016-015FN
IX73 Fluorescerende Inverteerde MicroscoopOlympusmicroscoop om fluorescentie, celmorfologie, telling en dissociatie te visualiseren
Ku55933Sigma-AldrichSML1109-25MGATM kinase remmer, inducer van reactieve zuurstofsoorten
L-glutamineFisher Scientific25-030-081aanvulling op celkweekmedium
Monochrome CMOS 16 bit cameraOptimos
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500GPFA, fixatief voor immunofluorescentie
Penicilline-streptomycineFisher Scientific15-140-122P/S, antibioticaoplossing voor kweekmedium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin sonde)InvitrogenA12381marker van F-actin, lichtgevoelig
ProLong Gold Anti-fade reagens met DAPIInvitrogenP36941bevestigingsmiddel voor deksels inclusief nucleaire kleurstof DAPI, lichtgevoelig
REF52 cellenGraham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Roerplaat met warmtecontroleCorning IncorporatedPC-420D
SpuitBD Biosciences30965360 mL spuit
WeefselkweekincubatorNuair
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent gebruikt om celmembranen te permeabiliseren
Trypan Blue OplossingFisher Scientific15-250-061voor celtelling
Trypsine Neutraliserende Oplossing (1x)Gibco by Life TechnologiesR-002-100TNS, neutraliseert trypsine in plaats van fetaal bovien serum
buisjesrotatieapparaatFisher Scientific11-676-341
waterbadFisher ScientificFSGPD02

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
  3. Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958(2014).
  4. Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
  5. Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
  6. Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
  8. Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579(2014).
  9. Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
  10. Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
  11. Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
  12. Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
  13. Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
  14. Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
  15. Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
  16. Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
  17. Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
  18. Fitzpatrick, M. Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html (2014).
  19. Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025(2011).
  20. Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
  21. Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393(2014).
  22. Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
  23. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
  24. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  25. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  26. Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231(2016).
  27. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  28. Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
  29. Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CelspreidingFibronectine coatingImmunofluorescentie assayPaxilline kleuringF actine sondeEpifluorescentiemicroscopieFiji softwareKu55933 behandeling

Gerelateerde artikelen