Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie

Samenvatting

We presenteren een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie door het combineren van circulaire RT-PCR, kwantitatieve RT-PCR, RNA 5 ' poly hosphatase-Treatment, en Northern Blot. Dit protocol bevat een normalisatie stap om de invloed van onstabiel 5 ' trifosfaat te minimaliseren, en het is geschikt voor het discrimineren en in kaart brengen van de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn verzameld in maïs-mitochondrion.

Samenvatting

In de mitochondriën van de plant, sommige steady-state transcripten hebben 5 ' trifosfaat afgeleid van transcriptie initiatie (primaire transcripten), terwijl de anderen bevatten 5 ' monofosfaat gegenereerd post-transcriptioneel (verwerkte transcripties). Om onderscheid te maken tussen de twee soorten transcripties, zijn verschillende strategieën ontwikkeld, en de meeste ervan zijn afhankelijk van aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat. Echter, het trifosfaat op primaire 5 ' Termini is instabiel, en het belemmert een duidelijke discriminatie van de twee soorten transcripten. Om de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn opgebouwd in maïs mitochondrion systematisch te differentiëren en in kaart te krijgen, hebben we een circulaire RT-PCR (cRT-PCR)-gebaseerde strategie ontwikkeld door de combinatie van cRT-PCR, RNA 5 ' polyphoshpatase Treatment, kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR) en Northern Blot. Als een verbetering, deze strategie omvat een RNA normalisatie stap om de invloed van unstable 5 ' trifosfaat te minimaliseren.

In dit protocol wordt het verrijkte mitochondriale RNA voorbehandeld door RNA 5 ' polyphosphatase, dat 5 ' triphsophate naar monofosfaat converteert. Na circularisatie en omgekeerde transcriptie worden de twee Cdna's die zijn afgeleid van 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's genormaliseerd door maïs 26S volwassen rRNA, die een verwerkte 5 ' end heeft en ongevoelig is voor 5 ' poly fosfatase. Na normalisatie worden de primaire en verwerkte transcripten gediscrimineerd door het vergelijken van cRT-PCR-en RT-qPCR-producten die zijn verkregen uit de behandelde en niet-behandelde Rna's. Het transcript Termini wordt bepaald door het klonen en sequentiëren van de cRT-PCR-producten, en vervolgens geverifieerd door Northern Blot.

Door deze strategie te gebruiken, zijn de meeste steady-state transcripten in maïs mitochondrion vastgesteld. Vanwege het gecompliceerde transcript patroon van sommige mitochondriale genen, werden een paar steady-state Transcripten niet gedifferentieerd en/of in kaart gebracht, hoewel ze in een Northern Blot werden aangetroffen. We zijn er niet zeker van of deze strategie geschikt is om de steady-state transcripten in andere mitochondriën van de plant of in plastiden te discrimineren en in kaart te krijgen.

Inleiding

In de mitochondriën van de plant, veel volwassen en precursor rna's worden opgebouwd als meerdere isoforms, en de steady-state transcripten kunnen worden onderverdeeld in twee groepen op basis van het verschil op hun 5 ' eindigt^{1,2,3, 4}. De primaire transcripten hebben 5 ' trifosfaat uiteinden, die zijn afgeleid van transcriptie initiatie. De verwerkte transcripten daarentegen hebben 5 ' monofosfaat gegenereerd door post-transcriptionele verwerking. Discriminatie en mapping van de twee soorten transcripten zijn belangrijk voor het ontrafele....

Protocol

1. ontwerp van de primer

1. Ontwerp genspecifieke primers voor reverse transcriptie (RT) met behulp van PCR-primer ontwerp software (Inhoudsopgave) op basis van de algemene regels van Primer design¹⁷.
   Opmerking: RT-primers zijn zeer specifiek voor de doel transcripten, en ze zijn over het algemeen verankerd op het 5 ' deel van programmeer sequenties (volwassen Mrna's en precursor Rna's), of ~ 500 – 600 NT stroomafwaarts van de verwachte 5 ' end (18S en 26S rRNAs).
2. Ontwerp paren van uiteenlopende primers om de gecircuariseerde transcripten te versterken door cRT-PCR.
   Opmerking: de gepaarde....

Resultaten

Schatting van mitochondriale RNA circularisatie efficiëntie

In een eerdere studie werden zowel totale als mitochondriale Rna's gebruikt voor cRT-PCR-mapping van mitochondriale transcript Termini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), en de twee soorten rna's gaven vergelijkbare mapping resultaten¹². In eerste instantie gebruikten we ook Total Rna's voor cRT-PCR-mapping v.......

Discussie

In een eerdere studie werden de totale en mitochondriale Rna's van celsuspensie cultuur van Arabidopsis gebruikt om de mitochondriale transcriptie Termini door CRT-PCR in kaart te krijgen, en vergelijkbare resultaten werden behaald¹². Echter, alleen verrijkt mitochondriaal RNA werd gebruikt voor het in kaart te gaan van de mitochondriale transcript Termini in vele andere studies^1,2,3,<.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Azijnzuur	Aladdin, China	A112880	Voor het bereiden van 1x TAE-buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Thermische cycler voor PCR-amplificatie
Ascorbicumzuur	Sigma-aldrich, USA	V900134	Voor het bereiden van extractiebuffer
Biowest Agarose	Biowest, Spain	9012-36-6	Voor het oplossen van PCR-producten en RNA's
Rundserumalbumine	Sigma-aldrich, USA	A1933	Voor het bereiden van extractiebuffer
Broomfenolblauw	Sigma-aldrich, USA	B8026	Voor het bereiden van laadbuffer voor agarosegelelektroforese en Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	Deactivering van RNase
DIG Northern starter kit	Roche, USA	12039672910	Voor DIG-RNA-labeling en Northern blot. Deze kit bevat de reagentia voor transcriptie-labeling van RNA met DIG en T7 RNA-polymerase, hybridisatie en chemiluminescente detectie.
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	Voor het bereiden van extractiebuffer en 1x TAE-buffer
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	Voor het bereiden van wasbuffer
Geldocumentatiesysteem	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	Om de agarosegel te beeldhouwen
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	Voor het bereiden van laadbuffer voor agarosegelelektroforese
GoldView II (5.000x)	Solarbio,. China	G8142	DNA-kleuring
Hybond-N+, Nylon membraan	Amersham Biosciences, USA	RPN119	Voor Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Beeld gel en vergelijk de overvloed aan PCR-producten.
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	Voor het bereiden van extractiebuffer
KOH	Aladdin, China	P112284	Voor het bereiden van extractiebuffer
L-cysteïne	Sigma-aldrich, USA	V900399	Voor het bereiden van extractiebuffer
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	Om extractie- en wasbuffers steriel te maken door filtratie
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	Om de gemalen kerneltjes te filteren
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	Voor het bereiden van lopende buffer voor Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	Voor RNA-concentratie en zuiverheidstest
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	Voor het bereiden van wasbuffer
pEASY-Blunt simple cloning vector	TransGen Biotech, China	CB111	Klonering van de uit de gel herstelde band. Het bevat een T7-promotor enkele bps stroomopwaarts van de insertieplaats.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase	Vazyme, China	P505	DNA-polymerase voor PCR-amplificatie
Polyvinylpyrrolidon 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	Voor het bereiden van extractiebuffer
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	Om primers te ontwerpen voor reverse transcriptie en PCR-amplificatie
PrimeScript II reverse transcriptase	Takara, Japan	2690	Om de eerste streng cDNA te synthetiseren
PureLink RNA Mini kit	Thermo Fisher Scientific, USA	12183025	Voor RNA-zuivering
RNA 5' polyfosfatase	Epicentre, USA	RP8092H	Om 5' trifosfaat om te zetten in monofosfaat
RNase-remmer	New England Biolabs, UK	M0314	Een component van RNA zelf-ligatie en 5' polyfosfatase behandeling reacties, en het wordt gebruikt om de activiteit van RNase te remmen.
Natriumacetaat	Sigma-aldrich, USA	V900212	Voor het bereiden van lopende buffer voor Northern blot
Natriumchloride	Sigma-aldrich, USA	V900058	Om 20x SSC te bereiden
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	Voor RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	Voor RNA-circulerisatie
Tetranatriumpyrofosfaat	Sigma-aldrich, USA	221368	Voor het bereiden van extractiebuffer
TIANgel midi zuiveringskit	Tiangen Biotech, China	DP209	Om DNA-fragmenten uit agarosegel te zuiveren
Tris	Aladdin, China	T110601	Om 1x TAE-buffer te bereiden
TRIzol-reagens	Invitrogen, USA	15596026	Om mitochondriale RNA te extraheren.
Universele DNA-zuiveringskit	Tiangen Biotech, China	DP214	Om gelinieriseerde plastmieden te herstellen uit de restrictie-enzymdigestiereactie
Xyleen cyanol FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	Voor het bereiden van laadbuffer voor agarosegelelektroforese