Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60019

⸱

29 juli 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie door het combineren van circulaire RT-PCR, kwantitatieve RT-PCR, RNA 5 ' poly hosphatase-Treatment, en Northern Blot. Dit protocol bevat een normalisatie stap om de invloed van onstabiel 5 ' trifosfaat te minimaliseren, en het is geschikt voor het discrimineren en in kaart brengen van de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn verzameld in maïs-mitochondrion.

Samenvatting

In de mitochondriën van de plant, sommige steady-state transcripten hebben 5 ' trifosfaat afgeleid van transcriptie initiatie (primaire transcripten), terwijl de anderen bevatten 5 ' monofosfaat gegenereerd post-transcriptioneel (verwerkte transcripties). Om onderscheid te maken tussen de twee soorten transcripties, zijn verschillende strategieën ontwikkeld, en de meeste ervan zijn afhankelijk van aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat. Echter, het trifosfaat op primaire 5 ' Termini is instabiel, en het belemmert een duidelijke discriminatie van de twee soorten transcripten. Om de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn opgebouwd in maïs mitochondrion systematisch te differentiëren en in kaart te krijgen, hebben we een circulaire RT-PCR (cRT-PCR)-gebaseerde strategie ontwikkeld door de combinatie van cRT-PCR, RNA 5 ' polyphoshpatase Treatment, kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR) en Northern Blot. Als een verbetering, deze strategie omvat een RNA normalisatie stap om de invloed van unstable 5 ' trifosfaat te minimaliseren.

In dit protocol wordt het verrijkte mitochondriale RNA voorbehandeld door RNA 5 ' polyphosphatase, dat 5 ' triphsophate naar monofosfaat converteert. Na circularisatie en omgekeerde transcriptie worden de twee Cdna's die zijn afgeleid van 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's genormaliseerd door maïs 26S volwassen rRNA, die een verwerkte 5 ' end heeft en ongevoelig is voor 5 ' poly fosfatase. Na normalisatie worden de primaire en verwerkte transcripten gediscrimineerd door het vergelijken van cRT-PCR-en RT-qPCR-producten die zijn verkregen uit de behandelde en niet-behandelde Rna's. Het transcript Termini wordt bepaald door het klonen en sequentiëren van de cRT-PCR-producten, en vervolgens geverifieerd door Northern Blot.

Door deze strategie te gebruiken, zijn de meeste steady-state transcripten in maïs mitochondrion vastgesteld. Vanwege het gecompliceerde transcript patroon van sommige mitochondriale genen, werden een paar steady-state Transcripten niet gedifferentieerd en/of in kaart gebracht, hoewel ze in een Northern Blot werden aangetroffen. We zijn er niet zeker van of deze strategie geschikt is om de steady-state transcripten in andere mitochondriën van de plant of in plastiden te discrimineren en in kaart te krijgen.

Inleiding

In de mitochondriën van de plant, veel volwassen en precursor rna's worden opgebouwd als meerdere isoforms, en de steady-state transcripten kunnen worden onderverdeeld in twee groepen op basis van het verschil op hun 5 ' eindigt1,2,3, 4. De primaire transcripten hebben 5 ' trifosfaat uiteinden, die zijn afgeleid van transcriptie initiatie. De verwerkte transcripten daarentegen hebben 5 ' monofosfaat gegenereerd door post-transcriptionele verwerking. Discriminatie en mapping van de twee soorten transcripten zijn belangrijk voor het ontrafelen van de moleculaire mechanismen onderliggende transcriptie en transcriptie einde rijping.

Om onderscheid te maken tussen de primaire en verwerkte transcripten in de mitochondrion van de fabriek, zijn vier belangrijke strategieën ontwikkeld. De eerste strategie is het pre-behandelen van de mitochondriale Rna's met tabaks zuur pyrofosfatase (TAP), die 5 ' trifosfaat naar monofosfaat converteert en maakt het mogelijk primaire transcripten om te worden gecircuariseerd door RNA ligase. De transcriptie van de door tap behandelde en niet-behandelde RNA-monsters wordt vervolgens vergeleken met een snelle versterking van de cDNA-uiteinden (RAS) of de circulaire RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. In de tweede strategie worden verwerkte transcripten in de eerste plaats uitgeput van mitochondriale rna's met behulp van Terminator 5 '-fosfaat-afhankelijke exonuclease (tex), en de primaire transcripten links worden vervolgens in kaart gebracht door de primer extensie analyse5,6 . De derde strategie is de pre-Cap van de primaire transcripten met guanylyl transferase, en dan is de positie van trifosfated 5 ' Termini wordt bepaald door primer uitbreiding samen met ribonuclease of S1 Nuclease bescherming analyse7,8 ,9. Verschillend van die afhankelijk van de aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat, de vierde strategie combineert in vitro transcriptie, site-gerichte mutagenese, en primer extensie analyse om de putende promotors karakteriseren en bepalen de transcriptie initiatie plaatsen8,10,11. Door het gebruik van deze strategieën, veel primaire en verwerkte transcripten zijn vastgesteld in de mitochondriën van de plant.

Echter, verschillende studies hebben gemeld dat de 5 ' trifosfaat van primaire transcripten waren instabiel, en ze werden gemakkelijk omgezet in monofosfaat voor onbekendereden2,4,12,13. Dit probleem belemmert een duidelijke discriminatie van de twee soorten transcripties met behulp van technieken, afhankelijk van de aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat, en eerdere pogingen om systematisch onderscheid te maken tussen de primaire en verwerkte transcripten in plant mitochondriën mislukte2,12.

In dit protocol combineren we cRT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase Treatment, RT-qPCR en Northern Blot om systematisch de primaire en verwerkte transcripten te onderscheiden die stabiel zijn opgebouwd in maïs (Zea mays) mitochondrion (Figuur 1). cRT-PCR maakt gelijktijdige mapping mogelijk van 5 ' en 3 ' extremiteiten van een RNA-molecuul, en het is meestal aangepast aan de map transcript Termini in planten2,12,14,15. RNA 5 ' poly fosfatase kan twee fosfaten uit het trifosfaat 5 ' Termini verwijderen, waardoor de primaire transcripten beschikbaar zijn voor zelf-ligatie door RNA ligase. Eerdere studies toonden aan dat volwassen 26s rRNA in maïs 5 ' eindpunt had verwerkt en ongevoelig was voor RNA 5 ' poly fosfatase1,16. Om de invloed van unstable trifosfaat op primaire 5 ' Termini te minimaliseren, worden de 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's genormaliseerd door volwassen 26s rRNA, en de primaire en verwerkte transcripten worden vervolgens gedifferentieerd door het vergelijken van de cRT-PCR-producten verkregen uit de twee RNA-monsters. De cRT-PCR-mapping en de discriminatie resultaten worden gecontroleerd door respectievelijk Northern Blot en RT-qPCR. Tot slot worden alternatieve primers gebruikt om die transcripten die in Northern Blot zijn gedetecteerd, maar niet door cRT-PCR, te versterken. Door deze cRT-PCR-gebaseerde strategie te gebruiken, zijn de meeste steady-state transcripten in maïs mitochondrion gedifferentieerd en toegewezen1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. ontwerp van de primer

  1. Ontwerp genspecifieke primers voor reverse transcriptie (RT) met behulp van PCR-primer ontwerp software (Inhoudsopgave) op basis van de algemene regels van Primer design17.
    Opmerking: RT-primers zijn zeer specifiek voor de doel transcripten, en ze zijn over het algemeen verankerd op het 5 ' deel van programmeer sequenties (volwassen Mrna's en precursor Rna's), of ~ 500 – 600 NT stroomafwaarts van de verwachte 5 ' end (18S en 26S rRNAs).
  2. Ontwerp paren van uiteenlopende primers om de gecircuariseerde transcripten te versterken door cRT-PCR.
    Opmerking: de gepaarde divergente primers flankeren de 5 '-3 ' kruising van de circularized transcripten en hun posities variëren tussen de geanalyseerde doel transcripties (figuur S1). Sommige transcripten hebben lange UTRs; bijvoorbeeld, nad2-1 5 ' UTR en rps4-1 3 ' UTR zijn 1.985 en 1826/1834 NT, respectievelijk1. Als beide primers zijn verankerd in de coderende regio, zal het moeilijk zijn om de doel transcripten te versterken. Daarentegen zijn sommige UTRs kort; bijvoorbeeld, de 3 ' UTRs van nad2-1 en nad4-1 zijn 34/35 en 29 – 31 NT, respectievelijk1. Als de gekoppelde primers zich ver van de codeer sequenties bevinden, zal de PCR mislukken. Over het algemeen zijn twee paren van uiteenlopende primers ontworpen voor elke doel transcripten, terwijl meerdere paren nodig kunnen zijn om diegenen in kaart te stellen waarvan de transcript patronen ingewikkeld zijn en/of UTRs erg lang zijn.
  3. Ontwerp paren van convergerende primers voor het bereiden van RNA-sondes voor Northern Blot.
    Opmerking: De gekoppelde primers bevinden zich op de codeer regio van het doel-gen en de grootte van het PCR-product moet in het bereik van 100 tot 1.000 BP liggen. Elke voorwaartse primer moet een restrictie-enzym site bevatten om vector sequenties in de resulterende probes te minimaliseren.

2. bereiding van de ruwe mitochondrion van maïs die kernels ontwikkelt

  1. Steriliseren van pestels, mortels, glazen trechters, tubes en tips van autoclaaf, en droog ze in de oven.
  2. Voer alle procedures uit bij 4 °C of op ijs en pre-cool alle oplossingen.
  3. Bereid 100 mL extractiebuffer (EB), samengesteld uit 0,3 M sucrose, 5 mM Tetrasodium diphosphate pyrofosfaat, 10 mM KH2po4, 2 mm EDTA, 1% [w/v] Polyvinylpyrrolidon 40, 1% [w/v] boviene serumalbumine, 5 mm L-cysteïne en 20 mm ascorbinezuur. Breng aan op pH 7,3 met KOH en steriliseren door filtratie.
  4. Bereid 100 mL wasbuffer (WB) bestaande uit 0,3 M sucrose, 1 mM EGTA en 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur). Aan te passen aan pH 7,2 met NaOH en steriliseren door filtratie.
    Opmerking: Er wordt voorgesteld om EB en WB te bereiden met DEPC-behandeld gedeïoniseerd H2O.
  5. Verzamel 20 g ontwikkelende kernels bij 11 – 20 dagen na bestuiving (DAP) naar een buis van 50 mL, geplaatst op ijs, en breng vervolgens de kernels over naar voorgekoelde mortels.
    Opmerking: Gebruik een verhouding van 100 mL EB tot 20 g maïs pitten.
  6. Voeg 10 – 20 mL ijskoud EB toe aan elke mortel en slijp de pitten volledig.
  7. Voeg meer EB toe en filtreer de grond weefsels door twee lagen filterdoek (tabel met materialen).
  8. Centrifugeer het filtraat bij 8.000 x g gedurende 10 minuten en gooi de pellet weg.
  9. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis en Centrifugeer het gedurende 10 minuten op 20.000 x g .
  10. Giet het supernatant af en regeef de pellet in 6 mL WB.
  11. Aliquot de suspensie tot vijf 1,5 mL RNase-vrije buizen en centrifugeer ze gedurende 5 minuten op 14.000 x g .
  12. Gooi het supernatant weg, Vries de mitochondriale pellet in vloeibare stikstof en bewaar bij-80 °C.

3. extractie van mitochondriaal RNA

  1. Extract mitochondriale RNA met een commercieel reagens (tabel van de materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    Let op: Dit reagens bevat fenol en guanidine isothiocyanaat. Werk ermee in een rook afzuigkap en draag een labjas en handschoenen.
  2. Los het geïsoleerde mitochondriale RNA op in DEPC-behandeld gedeïoniseerd H2O en schat de RNA-concentratie en zuiverheid met een spectrofotometer (tabel met materialen).
    Opmerking: In het algemeen, ~ 250 μg mitochondriale RNA wordt verkregen uit 20 g van 15-DAP maïs kernels.
  3. Bereid één agarose gel samengesteld uit 1x TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur, 1mM EDTA), 1,5% agarose (tabel van de materialen), en 1x nucleaire kleuring Dye (tabel van de materialen).
  4. Voeg een geschikt volume van 10x laad buffer (0,5% broomfenolblauw, 0,5% xyleen cyanol FF en 50% glycerol), en load mitochondriale RNA/laden buffer mengsel op de 1,5% agarose gel.
  5. Voer de gel in 1x TAE buffer bij 5 – 6 V/cm gedurende 20 – 25 minuten en evalueer de mitochondriale RNA-integriteit door de gel te voorzien van een gel-documentatiesysteem (tabel met materialen).
    Opmerking: De aanwezigheid van twee verschillende bands (~ 3.510 en ~ 1.970 NT voor maïs mitochondriale 26S en 18S rRNAs, respectievelijk) is een acceptabele standaard voor intact mitochondriaal RNA. Om mogelijke degradatie uit te sluiten, moet de RNA-integriteit worden onderzocht tijdens de meervoudige stappen van een circularized RNA-preparaat (Figuur 2).

4. RNA 5 ' poly fosfatase behandeling

  1. Stel RNA 5 ' poly hosphatase (tafel en materiaal) behandeling (tabel1) in en Inbroed bij 37 °c gedurende 30 – 60 minuten.
  2. Herstel het 5 ' poly fosfatase-behandelde RNA met een RNA zuiverings pakket (tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Herhaal de stappen 3,3 tot en met 3,5.

5. RNA Circularisatie

  1. Bereid twee circularisatie reacties met dezelfde hoeveelheden van 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde mitochondriale Rna's (tabel 2), en incureer beide reacties bij 16 °c gedurende 12 – 16 uur.
  2. Herstel de twee sets zelfdragende Rna's met dezelfde Kit als in stap 4,2.
    Opmerking: Opgemerkt moet worden dat slechts een fractie van mitochondriaal RNA zelf wordt geligeerd, en het herstelde RNA een mengsel van lineaire en circularized transcripten zal zijn.
  3. Herhaal de stappen 3,3 tot en met 3,5.

6. omgekeerde transcriptie

  1. Synthetiseren twee sets Cdna's uit dezelfde hoeveelheden circularized 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's (200 ng).
  2. Maak een primer mengsel door een gelijke verhouding van 26S-CRT en tot 7 andere RT-primers toe te voegen.
    Opmerking: De uiteindelijke concentratie van het primer mengsel moet 1 μM zijn.
  3. Bereid twee voor mengsels door de in tabel 3vermelde reagentia te combineren, inbroed bij 65 °c gedurende 5 minuten en ontspan vervolgens 2 minuten op ijs.
  4. Monteer twee RT-reactie systemen (tabel 4) en inbroed ze bij 42 °c gedurende 50 min.
  5. Verwarm beide RT-reacties bij 70 °C gedurende 5 minuten en chill ze vervolgens op ijs.

7. normalisering

  1. Bereid twee PCR-reacties voor door hetzelfde volume sjabloon Cdna's toe te voegen, afgeleid van 5 ' polyphosphatase-behandelde of niet-behandelde Rna's, afwijkende primers die de 5 '-3 ' kruising van circularized 26S rRNA (d.w.z. 26S-CF1 en-CR1), etc. (tabel 5) flaneren.
  2. Voer de twee reacties uit in een thermische cycler (tabel met materialen) onder de in tabel 6beschreven omstandigheden.
  3. Bereid een agarose gel samengesteld uit 1x TAE buffer, 1,0% agarose en 1x Nuclear kleuring Dye.
  4. Voeg 2 μL 10x laad buffer (0,5% broomfenolblauw, 0,5% xyleen cyanol FF en 50% glycerol) toe aan elk van de twee PCR-producten en laad ze op de gel.
  5. Voer de gel in 1x TAE buffer bij 5 – 6 V/cm voor 30 – 40 min, en beeld het met behulp van hetzelfde gel-documentatiesysteem als stap 3,5.
  6. Vergelijk de overvloed van de twee PCR-producten met behulp van computer software (tabel met materialen, figuur 4a) en Optimaliseer de normalisatie door de bedragen van de sjabloon cdna's zo nodig te wijzigen.

8. PCR-versterking

  1. Bereid paren van PCR-reacties voor door het juiste volume van de genormaliseerde Cdna's toe te voegen en een paar afwijkende primers flankerende 5 '-3 ' kruising van de doel transcripten (tabel 7).
    Opmerking: De hoeveelheid sjabloon cDNAs die wordt gebruikt voor PCR-amplificatie van de doel transcripten, wordt bepaald door het 26S rRNA normaliserings resultaat.
  2. Voer de PCR-reacties uit volgens het programma dat wordt beschreven in tabel 8.
  3. Herhaal de stappen 7,3 tot en met 7,5.
  4. Ga naar geneste divergente primers en verifieer de eerste ronde PCR-resultaten door de stappen 8,1 en 8,2 te herhalen.
  5. Herhaal de stappen 7,3 tot en met 7,5.
  6. Herstel de prominente bands die kunnen worden herhaald in twee rondes van PCR-versterking met behulp van een gel DNA-herstel Kit (tabel met materialen).

9. bepaling van het transcript Termini

  1. Kloon de gel-gezuiverde PCR-producten in een Blunt-end vector (tabel met materialen) met behulp van standaardtechnieken.
  2. Voer Colony PCR uit om positieve klonen met de doel inserts te selecteren en deze commercieel te sequenties.
    Opmerking: Positieve klonen met wisselplaten met variabele grootte worden meestal gedetecteerd uit een enkele herstelde band omdat veel steady-state transcripten in de mitochondriale plant heterogene 5 ' en/of 3 ' eindigt1,12.
  3. Lijn de sequentiaire gegevens uit met maïs mitochondriale genoom met behulp van Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) van het National Center for Biotechnology Information (NCBI). Kies organisme "maïs (taxid: 4577)", en zoekdata base "nucleotide collectie (nr/NT)".
  4. Zoek de 5 '-3 ' kruising van de circularized transcript, en bepaal de posities van 5 ' en 3 ' Transcript Termini.
  5. Bereken de grootte van doel transcripten.

10. verificatie van de cRT-PCR-mapping resultaten door RNA gel Blot-hybridisatie

Opmerking: RNA gel Blot hybridisatie wordt uitgevoerd met behulp van een commerciële Kit (tabel van materialen), die de reagentia bevat voor transcriptie-LABELING van RNA met digoxigenin (dig) en T7 RNA polymerase, hybridisatie en immunologische detectie. Raadpleeg de protocollen die in deze kit worden meegeleverd voor meer informatie. Zorg ervoor dat alleen RNase gratis apparatuur wordt gebruikt voor de hele procedure.

  1. Vergroot het DNA-fragment dat wordt gebruikt om de RNA-sonde voor te bereiden en kloon het naar dezelfde vector als in stap 9,1, die een T7 Promoter 17 BP stroomopwaarts van de insertie site bevat.
  2. Linearize de constructie met behulp van de juiste restrictie enzym, herstellen van de gelineariseerde plasmide door een DNA-zuiverings pakket (tabel van de materialen), en los het op in dePC behandeld gedeïoniseerd H2O.
  3. Label RNA probes met DIG-11-UTP door een commerciële Kit (tabel van de materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Bereid 500 mL 10x MOPS buffer (0,2 M MOPS, 50 mM natriumacetaat en 10 mM EDTA) met DEPC behandeld gedeïoniseerd H2O. Breng aan op pH 7,0 door NaOH, en steriliseren door filtratie.
  5. Voeg 2 – 3 volumes van de laad buffer (50% formamide, 6,2% formaldehyde, 1x Mops, 10% glycerol en 0,1% broomfenolblauw) toe aan het mitochondriale RNA dat is bereid in stappen 3.1 – 3.3.
  6. Denatureren het RNA monster/loading buffer mengsel bij 65 °C gedurende 10 minuten, en vervolgens chill op ijs gedurende 1 minuut.
  7. Bereid een gedenatureerde agarose-gel (2% formaldehyde, 1,2% agarose en 1x MOPS) en laad het RNA monster/loading buffer mengsel in de gel (1 – 2 μg mitochondriaal RNA per put).
  8. Run de gel in 1x MOPS bij 3 – 4 V/cm voor ~ 4 h.
  9. Bereid 2 L van 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitraat, pH 7,0). Behandel het met 0,1% DEPC 's nachts en steriliseer door autoclaaf.
  10. Spoel de gel twee keer in 20x SSC (15 min elke keer), en overdracht gel RNA naar een nylon membraan (tabel van materialen) door capillaire overdracht met 20x SSC voor 10 – 16 h.
  11. Bevestig het RNA aan het membraan door gedurende 30 minuten te bakken bij 120 °C.
  12. Voer RNA-hybridisatie en immunologische detectie uit met een commerciële Kit (tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.

11. discriminatie van primaire en verwerkte 5 ' einden

  1. Discrimineert de primaire en verwerkte 5 ' uiteinden door de cRT-PCR-producten te vergelijken die zijn verkregen uit de genormaliseerde 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's.
    Opmerking: Voor primaire Transcripten is de overvloed aan PCR-producten uit 5 ' poly fosfatase-behandeld RNA veel hoger dan die van niet-behandelde tegenhanger (Figuur 1, ' Gene A ' en figuur 4a). Voor verwerkte transcripten zou echter een vergelijkbaar niveau van PCR-producten worden versterkt uit de twee sets van mitochondriale Rna's (Figuur 1, ' Gene B ').
  2. Ontwerp RT-qPCR-primers op basis van de cRT-PCR-toewijzingsresultaten.
  3. Controleer de resultaten van cRT-PCR-discriminatie door RT-qPCR.
    Opmerking: De twee cDNA-monsters die zijn afgeleid van 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's worden genormaliseerd door de RT-qPCR-producten van 26S mature rRNA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Schatting van mitochondriale RNA circularisatie efficiëntie

In een eerdere studie werden zowel totale als mitochondriale Rna's gebruikt voor cRT-PCR-mapping van mitochondriale transcript Termini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), en de twee soorten rna's gaven vergelijkbare mapping resultaten12. In eerste instantie gebruikten we ook Total Rna's voor cRT-PCR-mapping v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In een eerdere studie werden de totale en mitochondriale Rna's van celsuspensie cultuur van Arabidopsis gebruikt om de mitochondriale transcriptie Termini door CRT-PCR in kaart te krijgen, en vergelijkbare resultaten werden behaald12. Echter, alleen verrijkt mitochondriaal RNA werd gebruikt voor het in kaart te gaan van de mitochondriale transcript Termini in vele andere studies1,2,3,<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation van China (Grant No. 31600250, Y.Z.), Science and Technology Projects van Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.) en het China Agricultural Research systeem (Grant No. AUTO'S-04-PS09, H.N.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurAladdin, ChinaA112880Voor het bereiden van 1x TAE-buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal CyclerThermo Fisher Scientific, USA4359659Thermische cycler voor PCR-amplificatie
AscorbicumzuurSigma-aldrich, USAV900134Voor het bereiden van extractiebuffer
Biowest AgaroseBiowest, Spain9012-36-6Voor het oplossen van PCR-producten en RNA's
RundserumalbumineSigma-aldrich, USAA1933Voor het bereiden van extractiebuffer
BroomfenolblauwSigma-aldrich, USAB8026Voor het bereiden van laadbuffer voor agarosegelelektroforese en Northern blot
DEPCSigma-aldrich, USAV900882Deactivering van RNase
DIG Northern starter kitRoche, USA12039672910Voor DIG-RNA-labeling en Northern blot. Deze kit bevat de reagentia voor transcriptie-labeling van RNA met DIG en T7 RNA-polymerase, hybridisatie en chemiluminescente detectie.
EDTASigma-aldrich, USAV900106Voor het bereiden van extractiebuffer en 1x TAE-buffer
EGTASigma-aldrich, USAE3889Voor het bereiden van wasbuffer
GeldocumentatiesysteemBio-Rad, USAGel Doc XR+Om de agarosegel te beeldhouwen
GlycerolSigma-aldrich, USAG5516Voor het bereiden van laadbuffer voor agarosegelelektroforese
GoldView II (5.000x)Solarbio,. ChinaG8142DNA-kleuring
Hybond-N+, Nylon membraanAmersham Biosciences, USARPN119Voor Northern blot
Image LabBio-Rad, USAImage Lab 3.0Beeld gel en vergelijk de overvloed aan PCR-producten.
KH2PO4Sigma-aldrich, USAV900041Voor het bereiden van extractiebuffer
KOHAladdin, ChinaP112284Voor het bereiden van extractiebuffer
L-cysteïneSigma-aldrich, USAV900399Voor het bereiden van extractiebuffer
MillexMillipore, USASLHP033RBOm extractie- en wasbuffers steriel te maken door filtratie
MiraclothCalbiochem, USA475855-1ROm de gemalen kerneltjes te filteren
MOPSSigma-aldrich, USAV900306Voor het bereiden van lopende buffer voor Northern blot
NanoDropThermo Fisher Scientific, USA2000CVoor RNA-concentratie en zuiverheidstest
NaOHSigma-aldrich, USAV900797Voor het bereiden van wasbuffer
pEASY-Blunt simple cloning vectorTransGen Biotech, ChinaCB111Klonering van de uit de gel herstelde band. Het bevat een T7-promotor enkele bps stroomopwaarts van de insertieplaats.
Phanta max super-fidelity DNA polymeraseVazyme, ChinaP505DNA-polymerase voor PCR-amplificatie
Polyvinylpyrrolidon 40Sigma-aldrich, USAV900008Voor het bereiden van extractiebuffer
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, USAPrimer Premier 6.24Om primers te ontwerpen voor reverse transcriptie en PCR-amplificatie
PrimeScript II reverse transcriptaseTakara, Japan2690Om de eerste streng cDNA te synthetiseren
PureLink RNA Mini kitThermo Fisher Scientific, USA12183025Voor RNA-zuivering
RNA 5' polyfosfataseEpicentre, USARP8092HOm 5' trifosfaat om te zetten in monofosfaat
RNase-remmerNew England Biolabs, UKM0314Een component van RNA zelf-ligatie en 5' polyfosfatase behandeling reacties, en het wordt gebruikt om de activiteit van RNase te remmen.
NatriumacetaatSigma-aldrich, USAV900212Voor het bereiden van lopende buffer voor Northern blot
NatriumchlorideSigma-aldrich, USAV900058Om 20x SSC te bereiden
SsoFas evaGreen supermixesBio-Rad, USA1725202Voor RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1New England Biolabs, UKM0437Voor RNA-circulerisatie
TetranatriumpyrofosfaatSigma-aldrich, USA221368Voor het bereiden van extractiebuffer
TIANgel midi zuiveringskitTiangen Biotech, ChinaDP209Om DNA-fragmenten uit agarosegel te zuiveren
TrisAladdin, ChinaT110601Om 1x TAE-buffer te bereiden
TRIzol-reagensInvitrogen, USA15596026Om mitochondriale RNA te extraheren.
Universele DNA-zuiveringskitTiangen Biotech, ChinaDP214Om gelinieriseerde plastmieden te herstellen uit de restrictie-enzymdigestiereactie
Xyleen cyanol FFSigma-aldrich, USAX4126Voor het bereiden van laadbuffer voor agarosegelelektroforese

Referenties

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

RNA 5'-polyfosfatasemitochondriale RNA-extractiekwantitatieve RT-PCRNorthern blotmapping van -terminiprimaire verwerkte transcriptenRNA-normalisatiedivergente primers
Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.