Ontwerp, synthese en fotochemische eigenschappen van aanklikbare gekooide verbindingen

Samenvatting

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de synthese en meting van de fotochemische eigenschappen van modulaire gekooide verbindingen met aanklikbare delen.

Samenvatting

Gekooide verbindingen maken de foto-gemedieerde manipulatie van de celfysiologie met hoge spatiotemporele resolutie. De beperkte structurele diversiteit van de momenteel beschikbare kooien-groepen en de moeilijkheden bij synthetische modificatie zonder afbreuk te doen aan de efficiëntieverbeteringen van fotolyse zijn echter belemmeringen voor het uitbreiden van het repertoire van gekooide verbindingen voor levende cellen Toepassingen. Aangezien de chemische modificatie van coumarin-type foto-caging groepen een veelbelovende benadering is voor de bereiding van gekooide verbindingen met diverse fysische en chemische eigenschappen, rapporteren we een methode voor de synthese van klikbare gekooide verbindingen die kunnen worden gewijzigd gemakkelijk met verschillende functionele units via de koper (I)-gekatalyseerde Huisgen cyclisering. Het modulaire platform molecuul bevat een (6-Broom-7-hydroxycumarine-4-yl) methyl (BHC) groep als een foto-caging groep, die een hoge fotolyse efficiëntie vertoont in vergelijking met die van de conventionele 2-nitrobenzyls. Er worden algemene procedures gepresenteerd voor het bereiden van klikbare gekooide verbindingen die aminen, alcoholen en carboxylaten bevatten. Extra eigenschappen zoals de oplosbaarheid in water en de mogelijkheid van de celtargeting kunnen gemakkelijk worden opgenomen in klikbare gekooide verbindingen. Bovendien werden de fysische en fotochemische eigenschappen, waaronder de fotolyse Quantum yield, gemeten en bleken ze superieur te zijn aan die van de corresponderende BHC gekooide verbindingen. Het beschreven protocol zou daarom kunnen worden beschouwd als een mogelijke oplossing voor het gebrek aan structurele diversiteit in de beschikbare gekooide verbindingen.

Inleiding

Gekooide verbindingen zijn ontworpen synthetische moleculen waarvan de oorspronkelijke functies worden tijdelijk gemaskeerd door covalent bijgevoegde foto-verwijderbaar bescherming groepen. Interessant is dat gekooide verbindingen van biologisch relevante moleculen een onmisbare methode vormen voor de spatiotemporele controle van de cellulaire fysiologie^{1,2,3,4,5 ,6}. In 1977 rapporteerden Engels en Schlaeger de 2-nitrobenzylester van cAMP als membraan permeabel en fotolabile derivaat van cAMP⁷. Het volgende jaar, Kaplan rapporteerde de 1-(2-nitrofenyl) ethyl ester van ATP (NPE-ATP) en noemde deze compound "gekooide" ATP⁸. Sindsdien, een reeks van fotochemisch verwisselbare bescherming groepen zoals 2-nitrobenzyls, p-hydroxyphenacyls⁹, 2-(2-nitrofenyl) ethyls^10,11, 7-nitroindolin-1-Yls^{12, 13}, en (coumarin-4-yl) methyls^14,15,16 zijn gebruikt voor de bereiding van gekooide verbindingen.

De synthese van gekooide verbindingen met wenselijk aanvullende eigenschappen zoals membraan permeabiliteit, oplosbaarheid in water, en cellulaire targeting vermogen zou worden verwacht dat het vergemakkelijken van de biologische toepassingen van de cel. Aangezien de fysische en fotochemische eigenschappen van deze moleculen voornamelijk afhangen van de chemische structuur van de fotochemisch verwijderbare beschermende groepen die worden gebruikt om ze voor te bereiden, is een divers repertoire van foto-caging groepen vereist. De structurele diversiteit van de momenteel beschikbare kooien-groepen die hoge fotolysisefficiënties vertonen, is echter beperkt. Dit kan een belemmering vormen voor het verhogen van het gebruik van gekooide verbindingen.

Om dit probleem aan te pakken, is het repertoire van foto-caging groepen uitgebreid door de chemische modificatie van bestaande fotoroemovable Bescherm groepen of het ontwerp van nieuwe fotolabile chromophores met superieure fotomophysical en fotochemische eigenschappen. Voorbeelden zijn nitrodibenzofuraan (ndbf^{) 17}, [3-(4, 5-dimethoxy-2-nitrofenyl) -2-butyl] (dmnpb^{) 18,19}, een calcium-gevoelige 2-nitrobenzyl photocage²⁰, gesubstitueerde coumarinylmethyls (DEAC450²¹ , Deadccm²², 7-azetidinyl-4-methylcumarin²³, en styryl coumarinen²⁴), cyanine derivaten (cyet-pan)²⁵, en bodipy derivaten^26,27.

Bovendien, we eerder ontwikkeld de (6-Broom-7-hydroxycoumarin-4-yl) methyl (BHC) groep en met succes gesynthetiseerd verschillende gekooide verbindingen van neurotransmitters²⁸, tweede boodschappers^29,30, en oligonucleotiden^31,32,33 exposeren grote een-en twee-Fobe excitatie doorsneden. Als extra eigenschappen gemakkelijk kunnen worden geïnstalleerd in de kooien groepen zonder afbreuk te doen aan hun lichtgevoeligheid, dan kan het repertoire van gekooide verbindingen worden uitgebreid^{34,35,36, 37,38,39}. We hebben daarom modulaire gekooide verbindingen ontworpen die uit drie delen bestaan, namelijk de BHC-groep als een foto-responsieve kern, chemische handvatten voor de installatie van extra functionaliteiten, en de moleculen die moeten worden gemaskeerd^{40, 41}.

Dus, dit artikel biedt een praktische methode voor de bereiding van gekooide verbindingen van biologisch relevante moleculen. Het huidige protocol beschrijft methoden voor het opstellen van een klikbare platform voor foto-caging groepen, de invoering van extra functionaliteiten om het repertoire van gekooide verbindingen uit te breiden, de meting van hun fysische en fotochemische eigenschappen en het celtype selectieve targeting van een klikbare gekooide compound voor verdere mobiele toepassing.

Protocol

1. synthese van de modulaire kooien pabhc-groep voor aanklikbare gekooide verbindingen^28,41

1. Bereiding van (6-Broom-7-hydroxycumarine-4-yl) methylchloride (BHC-CH₂cl)
   1. Plaats 4-bromoresorcinol (9,742 g, 51,5 mmol) in een rondbodemkolf van 100 mL voorzien van een roerder.
   2. Voeg conc. H₂, dus₄ (98%, 30 ml) toe aan de kolf en roer het mengsel om te ontbinden.
   3. Voeg ethyl 4-chloroacetoacetaat (10 mL, 74 mmol) dropwise toe.
   4. Blijf het mengsel gedurende 5 dagen bij omgevingstemperatuur roeren.
   5. Plaats de gemalen ijsblokjes (~ 200 mL) apart in een erlenmeyer van 500 mL.
   6. Giet het reactiemengsel in het ijs en roer 30 minuten krachtig totdat er een fijn gepoederd precipitaat wordt verkregen.
   7. Vang het precipitaat op via vacuümfiltratie. Was het licht bruin precipitaat met water vijf keer.
   8. Droog het precipitaat onder vacuüm 's nachts om BhcCH₂cl te leveren als licht bruin poeder (13,57 g, 46,9 mmol).
2. Bereiding van (6-Broom-7-hydroxycumarine-4-yl) methanol (BhcCH₂Oh)
   1. Plaats de bereide BhcCH₂Cl (1,1440 g, 3,95 mmol) en 1 M HCl (300 ml) in een rondbodemkolf van 1 L, uitgerust met een Dimroth-condensor. Roer het mengsel gedurende 5 dagen bij 140 °C. Laat het mengsel na deze tijd afkoelen tot de omgevingstemperatuur.
   2. Verwijder het water uit de reactie door roterende verdamping onder vacuüm om BhcCH₂Oh (1) te leveren als een licht bruin poeder (1,0359 g, 3,82 mmol, 97% opbrengst).
      Opmerking: het gebruik van 250 mL van 1 M HCl per 1 g BhcCH₂cl geeft een bevredigend resultaat.
3. Voorbereiding van paBhcCH₂Oh (2) via de mannich-reactie
   1. Plaats Paraformaldehyde (446,4 mg, 14,9 mmol) in een rondbodemkolf van 50 mL. Voeg watervrij ethanol (5 mL) en N-methylpropargylamine (1,25 mL, 14,8 mmol) toe aan de kolf.
   2. Roer het mengsel bij omgevingstemperatuur gedurende 1 uur onder een AR-atmosfeer.
   3. Voeg BhcCH₂Oh (1) (1,367 g, 5,04 mmol) toe aan de kolf. Verwarm het mengsel tot 80 °C met een blok verwarmer apparaat en roer het mengsel gedurende 2 uur bij 80 °C in een AR-atmosfeer.
   4. Stop de blok verwarmer en laat het reactiemengsel afkoelen tot kamertemperatuur.
   5. Verzamel het resulterende licht bruin-geel precipitaat door vacuümfiltratie. Was het precipitaat tweemaal met een kleine hoeveelheid watervrij ethanol (1 mL elke keer).
   6. Verwijder de overtollige ethanol onder vacuüm naar opbrengst paBhcCH₂Oh (2) (1,393 g, 3,96 mmol).

2. voorbereiding van klikbare gekooide verbindingen

Opmerking: de volgende procedures kunnen worden toegepast op de bereiding van andere klikbare gekooide verbindingen die hydroxyl, amino en carboxylaat functionele groepen bevatten.

1. Algemene procedure 1: voorbereiding van een klikbare gekooide amine
   1. Plaats paBhcCH₂Oh (2) (709,6 mg, 2,02 mmol) en n,n '-carbonyl diimidazol (CDI, 397,6 mg, 2,45 mmol) in een 30 ml rondbodemkolf. Voeg Dry CH₂cl₂ (6 ml) toe en roer de oplossing gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur.
   2. Voeg 4-dimethylaminopyridine (4-DMAP, 324,8 mg, 2,66 mmol) en tert-butyl (6-aminohexyl) carbamaat (533,1 mg, 2,46 mmol). Roer de oplossing bij omgevingstemperatuur gedurende 3 uur.
   3. Verwijder het oplosmiddel en andere vluchtige materialen met behulp van een roterende verdamper onder vacuüm. Reinig het residu rechtstreeks met behulp van silicagel Flash column chromatografie.
2. Algemene procedure 2: voorbereiding van een klikbare gekooide alcohol
   1. Plaats paclitaxel (PTX, 48,7 mg, 0,057 mmol) in een rondbodemkolf van 30 ml uitgerust met een drie-weg kraantje en een AR-ballon. Voeg Dry CH₂cl₂ (1 ml), 4-dmap (17,1 mg, 0,14 mmol) en 4-nitrofenyl chloroformaat (26,0 mg, 0,13 mmol) toe.
   2. Roer de oplossing bij omgevingstemperatuur voor 2,5 uur onder een AR-atmosfeer.
   3. Voeg 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) en paBhcCH₂Oh (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) aan de oplossing. Blijf het mengsel bij omgevingstemperatuur gedurende 17 uur roeren.
   4. Voeg CHCl₃ (10 ml) en 15% waterige NaHCO₃ (5 ml) toe aan het mengsel. Roer het mengsel krachtig gedurende ongeveer 3 min. Verwijder de waterige laag met een pipet.
   5. Voeg 0,5 M citroenzuur (5 mL) toe aan de kolf die de organische laag bevat. Roer het mengsel en verwijder de waterige laag zoals hierboven.
   6. Scheid de organische laag met behulp van een fase scheidings kolom. Verwijder de oplosmiddelen met een roterende verdamper onder vacuüm. Reinig het product met behulp van standaard silicagel-flits Kolomchromatografie.
3. Algemene procedure 3: voorbereiding van een klikbare gekooide carboxylzuur
   1. Los arachidonzuur (33,0 μL, 0,100 mmol), paBhcCH₂Oh (2) (39,6 mg, 0,112 mmol) en 4-dmap (14,1 mg, 0,115 MMOL) in droge l₂cl₂ (2 ml). Voeg n,n'-diisopropylcarbodiimide (Dipc, 17,0 μL, 0,110 mmol) toe en roer de oplossing bij omgevingstemperatuur gedurende 140 min.
   2. Verwijder het oplosmiddel onder vacuüm. Reinig het residu rechtstreeks met behulp van silicagel Flash column chromatografie.

3. installatie van een functionele eenheid in de klikbare gekooide verbindingen

1. Los koper (II) sulfaat-pentahydraat (249 mg) in ion-uitgewisseld water (IEW, 10 mL) op om een 0,1 M CuSO₄ -oplossing te geven.
2. Los 2 '-paBhcmoc-PTX (8,0 mg, 6,5 μmol), Tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA, 17,5 mg, 40,3 μmol), natrium l-ascorbaat (162,4 mg, 0,825 mmol), en 15-Chloro-3, 6, 9-trioxapentadecyl natriumazide (3,1 mg, 11 μmol) in een gemengd oplosmiddel van 0,1 M fosfaat buffer (2,5 mL, pH 7,2) en dimethylsulfoxide (DMSO, 0,5 mL).
3. Voeg de 0,1 M CuSO₄ -oplossing (81,2 μL, 8,1 μmol) toe aan het reactiemengsel. Roer het mengsel bij omgevingstemperatuur gedurende 80 min. Bewaak de voortgang van de reactie met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).
4. Los de precipitaten op door een 75% acetonitril/wateroplossing (3,5 mL) toe te voegen. Breng de resulterende oplossing rechtstreeks aan op het semi-preparatieve HPLC-systeem om het gewenste product te zuiveren.
   Opmerking: Solubilization van het reactiemengsel door toevoeging van tert-butanol kan de progressie van de reactie versnellen.

4. fotolytische uncaging-reactie van de gekooide verbindingen

1. Voorbereiding van de stockoplossingen
   1. Los de gewenste gekooide verbinding (5 μmol) in DMSO (500 μL) op om een stockoplossing van 10 mM te bereiden. Breng een aliquot van elke oplossing (10 μL) in een micro centrifugebuis van 1,5 mL en bewaar deze in een vriezer (− 20 °C) tot vlak voor gebruik.
   2. 6 mM K₃[FE (C₂O₄)₃] (100 ml): Los gerecrygekristalliseerd kalium ferrioxalaat (0,295 g, 0,675 mmol) op in 80 ml water. Voeg 0,5 M H₂dus₄ (10 ml) en een passende hoeveelheid IEW toe om het volume te maken tot 100 ml.
      Opmerking: kalium ferrioxalaat moet worden gezuiverd via herkristallisatie van heet water en opgeslagen in het donker. Gerecrgekristalliseerd kalium ferrioxalaat wordt verkregen als het Trihydraat; Daarom is de formule K₃[FE (C₂o₄)₃] · 3h₂o en een formule gewicht van 491,24 moet worden overwogen tijdens de bereiding van de stamoplossing. Controleer de zuiverheid van de 6 mM-oplossing door de absorptie bij 510 Nm te meten. Als de extinctie < 0,02 is, is deze geschikt voor gebruik in het experiment.
   3. 0,1% buffer-Phen (30 mL): ontbinden NaOAc · 3H₂O (7,35 g), 1, 10-phenanthroline (Phen) · H₂O (30 mg), en conc. H₂dus₄ (0,9 ml) in IEW (20 ml). Voeg IEW toe om het volume te maken tot 30 mL.
      Opmerking: de oplossing bevat 1,8 M NaOAc, 0,54 M H₂so₄en 0,1% 1, 10-phenanthroline.
2. Meting van het aantal fotonen met ferrioxalaat actinometrie
   1. Plaats 6 mM K₃[FE (C₂O₄)₃] (V₁ L) in een kwarts kuvette. Bestraleren de oplossing met 350 nm licht voor 5 sec.
   2. Breng de bestraalde oplossing over naar een Pyrex Cuvette met een l [cm] padlengte.
   3. Voeg 0,1% buffer-Phen (V₂ L) toe aan de bestraalde monsteroplossing en meng goed door pipetten. Meet de extinctie van het monster bij 510 Nm. Bereken de gemiddelde absorptie verandering per tijdseenheid (ΔA₅₁₀ [s^{− 1}]).
   4. Bereken het aantal mollen van gegenereerde Fe^{2 +} ionen per tijdseenheid volgens de volgende vergelijking:
      NFE^{2 +} [mol s^{− 1}] = ((V₁ + V₂) [l] × δa₅₁₀ [s^{− 1}])/(l [cm] × ε₅₁₀ [l mol^{− 1} cm^{− 1}]),
      waar (v₁ + v₂) het volume van het monster voor de absorptie meting is, l de optische weglengte van de cuvette, en ε₅₁₀ de molaire absorptie van de FE^{2 +}- Phen complex bij 510 Nm.
      Opmerking: in de typische experimentele omstandigheden zijn de waarden van v₁ = 2,0 ×^{10 − 3} l, v₂ = 0,33 × 10^{− 3} l, l = 1,0 cm, en ε₅₁₀ = 1,1 × 10⁴ L mol^{− 1} cm^{− 1} werden gebruikt.
   5. Bereken het aantal mollen van fotonen dat het monster bereikt (I₀) met behulp van de volgende formule:
      I₀ [Einstein cm^{− 2} s^{− 1}] = NFE^{2 +}/Φ₃₅₀
      waar Φ ₃₅₀ de kwantum efficiëntie is van de fotoreductie van het ferrioxalaat bij 350 nm.
      Opmerking: Hoewel de kwantum efficiëntie van de kaliumferrioxalaatactinometer bij 350 nm niet wordt gerapporteerd, werd de gerapporteerde waarde van 1,25⁴² bij 358 nm gebruikt.
3. Kwantum efficiëntie metingen bij 350 nm
   1. Verdun de monster voorraadoplossing (in DMSO, 10 μL) met K-MOPS buffer (pH 7,2, 10 mL) om een 10 μM oplossing te geven in K-MOPS met 0,1% DMSO.
      NB: K-MOPS buffer bestond uit 100 mM KCl en 10 mM 3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur (Mops) getitreerd naar pH 7,2 met Koh.
   2. Breng een aliquot van de oplossing (V₁ L) over in dezelfde Cuvette die wordt gebruikt in de fotororeactie van de chemische actinometer. Bestraleren de monsteroplossing met dezelfde instellingen als beschreven in stap 4.2.1.
   3. Verwijder periodiek een aliquot (50 μL) uit de bestraalde oplossing en analyseer met behulp van HPLC.
   4. Bepaal de doorstralings tijd in seconden, waarbij 90% van het uitgangsmateriaal reageerde (t_90%) door het aanbrengen van plots van de tijdafhankelijke verdwijning van het uitgangsmateriaal.
      NB: de extinctie van het bestraalde monster moet op < 0.1 worden gehandhaafd, zodat de binnenfiltering van de straling kan worden verwaarloosd. Het is wenselijk dat de fotolytische consumptie van het uitgangsmateriaal kan worden benaderd door één-exponentieel verval, zodat er geen ongewenst secundair effect is dat het fotolysisproces verstoort.
   5. Bereken de kwantum opbrengst van verdwijning (Φ_DIS) met behulp van de volgende vergelijking²⁸:
      Φ_DIS = 1/(t_90% × I₀ × σ₃₅₀)
      waarbij t_90% [s] de stralings tijd is waarin 90% van het uitgangsmateriaal werd verbruikt, I₀ [Einstein cm^{− 2} s^{− 1}] is het aantal mollen van fotonen en σ₃₅₀ [cm ² mol^{− 1}] is de decadische extinctiecoëfficiënt van het monster bij 350 nm.
      Noot: σ₃₅₀ [cm² mol^{− 1}] = 10³ε₃₅₀ [M^{− 1} cm^{− 1}].

5. targeting van een klikbare gekooide verbinding met een HaloTag ligand

Opmerking: onderhoud de HeLa-cellen in het gemodificeerde Eagle medium van Dulbecco (DMEM, low glucose, natriumpyruvate, l-glutamine), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) met 1% antibiotica (streptomycine sulfaat, penicillaire G en Amfotericine) bij 37 °C en 5% CO₂.

1. Verwijder het medium en trypsinoseer de cellen door te behandelen met trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 1 mL) bij 37 °C gedurende 1 minuut. Voeg DMEM (4 mL) toe aan de cellen en onderbreek de cellen opnieuw door ze zachtjes te pipetteren. Zaad ongeveer 5 × 10⁵ cellen per schotel in 35 mm glasbodem gerechten in DMEM (2 ml) 24 h voor Transfectie.
2. Verdun voor vier gerechten in een micro centrifugebuis van 1,5 mL het plasmide DNA (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) in het gereduceerde serum medium (700 μL). Verdun het lipofection-reagens (5 μL) in het gereduceerde serum medium (150 μL) afzonderlijk in elk van de vier buisjes en laat ze gedurende 5 minuten op de omgevingstemperatuur staan.
3. Voeg een deel van het verdunde plasmide DNA (150 μL) toe aan elk van de verdunde lipofection-reagens monsters. Inincuberen bij omgevingstemperatuur gedurende 5 min.
4. Na het onderhouden van de cellen bij 37 °C en 5% CO₂ voor 24 uur, aspireren de DMEM en spoel de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 2 ml). Voeg het verlaagde serum medium (1,5 mL) toe.
5. Voeg het plasmide-lipofection reagens (150 μL) complex toe aan elk gerecht. Houd de cellen bij 37 °C en 5% CO₂ voor 48 h.
6. Aspirate het medium, voeg een portie vers bereide DMEM (1 mL) met 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo, en inbroed de cellen bij 37 ° c en 5% CO₂ gedurende 30 min.
7. Aspirate het medium dat de gekooide verbinding bevat en spoel de cellen tweemaal met PBS + (1 mL per spoeling) om ongebonden verbindingen te verwijderen. Voeg het verlaagde serum medium (500 μL) toe en inbroed de cellen bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 30 minuten om de verbindingen te verwijderen die de cellen hebben ingevoerd.
   Opmerking: PBS + is fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met 2 mM CaCl₂ en 1 mm MgCl₂.
8. Verwijder het medium en spoel de cellen tweemaal af met PBS + (1 mL). Voeg een gedeelte van een medium (1 mL) toe dat geen fenolrood bevat. Neem fluorescentie beelden op door middel van laser scanning confocale fluorescentiemicroscopie.

6. fotomediated modulatie van een kinase lokalisatie met behulp van een klikbare gekooide compound

Let op: voor gebruik, onderhoud de CHO-K1-cellen in Ham's F-12 medium aangevuld met 10% FBS bij 37 °C en 5% CO₂.

1. Bereid een 100 × werkoplossing (1 mM) van paBhc-AA (5) in DMSO.
   Opmerking: een 10 mM stockoplossing van de verbinding wordt bereid en opgeslagen in een vriezer (-20 °C).
2. Zaad ongeveer 5 × 10⁵ cellen per schotel in 35 mm glasbodem gerechten in DMEM (2 ml) 24 h voor Transfectie.
3. De CHO-K1-cellen worden getransfect met een plasmide codering voor GFP-DGKγ 48 h vóór de uncaging-experimenten.
   Opmerking: transfectie wordt uitgevoerd volgens de stappen 5.2 – 5.5.
4. Vervang het medium door een verlaagd serum medium (2 mL). Voeg de 100 × paBhc-AA-oplossing (20 μL) toe en inincuberen de cellen bij 37 °C en 5% CO₂ voor tussen 5 min en 1 uur.
   Opmerking: de laadtijd is afhankelijk van de gebruikte verbinding.
5. Plaats de cellen op de objectieve fase van een omgekeerde fluorescerende Microscoop uitgerust met een dubbele lichtbron fluorescentie-illuminator.
6. Neem een fluorescerende afbeelding elke 10 s. Bestralt de cellen met 330 – 385 nm licht door een Microscoop doelstelling gedurende een geschikte tijd. U de cellen ook met 405 nm licht bestreren met behulp van een XE lamp door middel van flexibele kwarts vezels.
7. Ga door met het opnemen van fluorescerende beelden gedurende 10 minuten.

Resultaten

Klikbaar gekooide verbindingen van sommige biologisch interessante moleculen, met inbegrip van arachidonzuur en paclitaxel, werden met succes gesynthetiseerd (Figuur 1)^28,41. Aanvullende eigenschappen zoals de oplosbaarheid in water en cellulaire targeting werden in paBhcmoc-PTX geïntroduceerd via de koper (I)-gekatalyseerde Huisgen cyclisatie ("Klik"-reactie) (Figuur 2). Deze klikbare gekooide PTXs werden vervolgens gefotolyseerd om hun ouder PTXs te produceren bij bestraling bij 350 nm (Figuur 3), en de fysische en fotochemische eigenschappen van de klikbare gekooide verbindingen zijn samengevat in tabel 1. De kwantum opbrengsten van klikbare gekooide verbindingen 2 '-GLC-paBhcmoc-PTX (φ_DIS 0,14) en pabhc-AA (φ_DIS 0,083) waren meer dan tweemaal die van conventionele BHC gekooide verbindingen 2 '-bhcmoc-PTX (φ_DIS 0,040) en BHC-AA (Φ_dis 0,038)⁴³. Bovendien werd een verbeterde oplosbaarheid in water waargenomen voor 2 '-GLC-paBhcmoc-PTX, die een glucose groep bevat.

Bij Live-celexperimenten werd de targeting van paBhc-hex-FITC/Halo op de gekweekte zoogdiercellen met een transitieve uitdrukking van een fusie-eiwit van een HaloTag-eiwit en epidermale groeifactor receptor (EGFR) succesvol bereikt. Er werd een groene fluorescentie van het fluoresceïne deel van pabhc-hex-FITC/Halo waargenomen op het celmembraan (Figuur 4). Foto-gemedieerde modulatie van de subcellulaire lokalisatie van een kinase werd bereikt met behulp van een paBhc gekooide compound. De translocatie van diacylglycerolkinase γ (DGKγ) is gemeld om te worden geactiveerd in de aanwezigheid van arachidonzuur (AA)⁴⁴. De CHO-K1-cellen met een transitieve uitdrukking van GFP-DGKγ werden behandeld met AA of paBhc-AA (5). Toevoeging van AA veroorzaakte de modulatie van de subcellulaire lokalisatie van DGKγ (Figuur 5A, B). Vergelijkbare veranderingen in de lokalisatie van DGKγ werden waargenomen voor de paBhc-AA-behandelde cellen na blootstelling aan UV-licht (Figuur 5C, D).

Figuur 1: voorbereiding van de klikbare gekooide verbindingen.
A) reagentiaen condities: A. ethyl 4-chloroacetoacetaat/conc. H₂dus₄/RT/7 dagen/91% opbrengst, b. 1 M HCl/reflux/3 dagen/97% opbrengst. c. N-methylpropargylamine/HCHO/EtOH, vervolgens toevoegen (1) en warmte bij reflux voor 17 h/79% opbrengst. B) syntheses van het klikbare gekooide AMINE, PTX en arachidonzuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: installatie van functionele eenheden in aanklikbare gekooide verbindingen.
A) synthesevan een in water oplosbare GEKOOIDE PTX via de koper (I)-gekatalyseerde huisgen cyclisering. B) structuren van aanklikbare gekooide verbindingen die de ligand van halotag bevatten voor cellulaire targeting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Photolysis van 2 '-GLC-paBhcmoc-PTX (6).
Monsters (10 μM) in K-MOPS-oplossing (pH 7,2) werden bestraald bij 350 nm. A) typische HPLC-sporen voor de fotolyse van 6 (gemeten bij 254 nm). Monsters werden geanalyseerd op de gespecificeerde stralings tijd. B) tijdsverloop voor de fotolyse van 6. Blauwe cirkels tonen het verbruik van 6. De ononderbroken lijn toont de kleinste kwadraten curve geschikt voor een eenvoudige rottende exponentiële voor 6. Rode vierkantjes geven de opbrengst van PTX weer. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (± SD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: fluorescentie beelden van gekweekte zoogdiercellen, geïnhaleerd met paBhc-hex-FITC/Halo (8).
Cellen die met pcDNA3-Halo-EGFR zijn gefuseerd, werden gedurende 30 minuten geïnhaleerd met een 2 μM-oplossing van compound 8 bij 37 °c. De beelden werden verkregen na herhaald wassen met PBS +. Mock-behandelde HEK293T cellen (A: differentiële interferentie contrast (DIC) afbeelding en D: fluorescentie beeld). HEK293T cellen (b en E) en HeLa-cellen (C en f) die een transitieve uitdrukking geven aan Halo-EGFR (b en C: dic-afbeeldingen en E en f: fluorescentie beelden). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Afbeelding 5: fluorescentie beelden na UV-bestraling van de CHO-K1-cellen geïnineerd met BHC gekooide arachidonzuur. De CHO-K1-cellen werden met een fusie proteïne DGKγ-EGFP getransffecteerd.
A) eenfluorescentie beeld van de in het transport geperfectioneerde cellen. B) 100 s na de toevoeging van een 10 μM-oplossing van arachidonzuur. C) cellen werden geïnincubeerd met een 10 μM-oplossing van pabhc-AA (5) bij 37 °c gedurende 5 min. (D) 100 s na 20-s UV-bestraling (330 – 385 nm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Verbindingen	λMax (nm)a	εMax (M-1 cm-1)b	φDISc	εφDISd	Oplosbaarheid (μM)e
Ptx					1,0
2 '-bhcmoc-PTX	340	10500	0,040	400	55
2 '-paBhcmoc-PTX	359	9300	0,059	670	8,3
2 '-GLC-Bhcmoc-PTX	373	12300	0,14	1280	650
BHC-AA	341	10800	0,038	390
paBhc-AA	366	10300	0,083	750

Tabel 1: fysische en fotochemische eigenschappen van de klikbare gekooide verbindingen.
a. absorptiemaximum (nm), b. molaire absorptiviteit bij λ_Max (M^{− 1} cm^{− 1}), c. kwantum opbrengst van het verdwijnen van de uitgangsmaterialen bij 350 nm, d. Het product van molaire absorptiviteit en de kwantum opbrengst van verdwijning bij 350 nm, e. De concentratie van de verzadigde oplossing in K-MOPS (pH 7,2) (μg mL^{− 1}).

Discussie

We ontwikkelden eerder BHC gekooide verbindingen van verschillende biologisch actieve moleculen die hoge fotolytische efficiënties vertonen^28,45,46,47. Met als doel het uitbreiden van het repertoire van BHC kooien groepen, rapporteerden we ook platforms van modulaire gekooide verbindingen die gemakkelijk kunnen worden gewijzigd door de introductie van verschillende functionele eenheden^32,40,41. Het huidige protocol vertegenwoordigt daarom een methode voor de synthese van een klikbare precursor van BHC kooien groepen die kan worden gewijzigd via de koper (I)-gekatalyseerde huisgen cyclisering. De synthese van de klikbare precursor, paBhcCH₂Oh (2), werd bereikt via een vier stappen-reactie sequentie beginnend bij de in de handel verkrijgbare 4-bromoresorcinol (Figuur 1a). Het voordeel van dit protocol is dat er geen moeizame zuiveringsstappen nodig zijn (bijv. kolom chromatografische scheidingen).

Als klikbaar precursor paBhcCH₂Oh (2) kan worden gebruikt om verschillende functionele groepen te maskeren, klikbaar gekooide verbindingen van amines, alcoholen, en carbonzuren werden gesynthetiseerd met behulp van 2 als de precursor (Figuur 1b). Amines werden gewijzigd als hun carbamaten terwijl alcoholen werden gemodificeerd als hun carbonaten. In algemene procedures 1 en 2 werd CDI gebruikt voor de bereiding van klikbare carbamaten, terwijl 4-nitrofenyl chloroformaat werd gebruikt voor de bereiding van carbonaten. Zoals aangegeven door het reactiemechanisme, kunnen beide reagentia worden gebruikt voor de bereiding van carbamaten en carbonaten. Er moet ook worden opgemerkt dat de opbrengst van de gewenste gekooide verbinding afhankelijk is van de chemische structuur van het molecuul dat moet worden gekooide. Andere voorbeelden zijn te zien in onze vorige rapporten^28,30,33,48.

Klik op modificatie werd vervolgens uitgevoerd met een lichte wijziging van de gerapporteerde procedure⁴⁹. De toevoeging van tris (triazolylmethyl) amine-gebaseerde liganden is noodzakelijk om de gewenste producten te verkrijgen in goede tot hoge opbrengsten. Aangezien een verscheidenheid van aziden gemakkelijk beschikbaar zijn zowel uit commerciële bronnen als uit literatuur procedures, kunnen we verschillende modulaire gekooide verbindingen met extra eigenschappen, zoals oplosbaarheid in water en cellulaire targeting vermogen (Figuur 2) voorbereiden.

De kwantum opbrengst van fotolyse werd vervolgens gemeten volgens een gerapporteerde procedure^28,50. Figuur 3 toont aan dat de fotolytische consumptie van 2 'glc-paBhcmoc-PTX en de vrijlating van PTX werden benaderd door single-exponentiële verval en stijging, respectievelijk, suggereren geen innerlijke filtering van de straling of ongewenste secundaire effecten. Er werden verbeterde fotolyse kwantum opbrengsten (Φ) en fotolysisefficiënties (εφ) waargenomen voor de klikbare pabhc gekooide verbindingen in vergelijking met die van de eerder gerapporteerde BHC gekooide verbindingen (tabel 1)^{41, 43}. aangezien de efficiëntie van fotolyse (εφ) van BHC gekooide verbindingen meer dan 100 maal hoger is dan die van 2-nitrobenzyl-type gekooide verbindingen⁴⁸, is de duidelijke verbetering als gevolg van de aanwezigheid van pabhc kooien groepen duidelijk een voordeel voor dit systeem.

Als proof-of-concept-experiment werd een hydrofiele groep geïntroduceerd in 2-paBhcmoc-PTX (4) en een cellulaire targeting ligand werd geïntroduceerd in Compound 3 (Figuur 2). De oplosbaarheid in water van 2 'glc-paBhcmoc-PTX was 650 maal hoger dan die van de ouder PTX (tabel 1). Selectieve cellulaire targeting werd bereikt met behulp van een tag-probe-systeem, en paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) met het halotag ligand werd met succes getarget op het celmembraan van gekweekte zoogdiercellen die het halotag/EGFR-fusie-eiwit uitdrukken ( Figuur 4). Foto-gemedieerde modulatie van de subcellulaire lokalisatie van een kinase werd ook bereikt met behulp van een klikbare gekooide compound 5 (Figuur 5).

Concluderend hebben we met succes een methode gedemonstreerd voor de voorbereiding van klikbare platformen voor fotogekooide verbindingen van biologisch interessante moleculen die gemakkelijk kunnen worden gewijzigd met extra eigenschappen, zoals oplosbaarheid in water en een cellulaire targetingmogelijkheid. Aangezien de pabhc kooien groep kan worden gebruikt om moleculen met veranderbare functionele groepen voor te bereiden, is de toepassing van dit protocol niet beperkt tot de hierin beschreven moleculen. Met behulp van een modulair platform, namelijk de pabhc kooien groep, kunnen de gewenste gekooide verbindingen gemakkelijk worden voorbereid, en hun fysische en chemische eigenschappen kunnen worden gemoduleerd via Klik modificatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
acetonitrile, EP	Nacalai	00404-75
acetonitrile, super dehydrated	FUJIFILM Wako	010-22905
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Thermo Fisher	15240062
4-bromoresorcinol	TCI Chemicals	B0654
N,N’-carbonyldiimidazole	FUJIFILM Wako	034-10491
chloroform	Kanto	07278-71
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9%	FUJIFILM Wako	032-12511
dichloromethane, dehydrated	Kanto	11338-05
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC)	TCI Chemicals	D0254
4-dimethylaminopyridine	TCI Chemicals	D1450
dimethylsulfoxide, dehydrated -super-	Kanto	10380-05
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Sigma	D6046-500ML
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW	Olympus
Ethanol (99.5)	FUJIFILM Wako	054-07225
Ethyl 4-Chloroacetoacetate	TCI Chemicals	C0911
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red	FUJIFILM Wako	087-08335
hydrochloric acid	FUJIFILM Wako	087-01076
inverted fluorescent microscope IX-71	Olympus
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL	Biotage	120-1906-D
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt	FUJIFILM Wako	196-01252
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81	Olympus
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher	11668027	lipofection reagent
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Dojindo	345-01804	MOPS
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC)	TCI Chemicals	C1400
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Thermo Fisher	11058021	reduced serum medium contains no phenol red
1,10-Phenanthroline Monohydrate	Nacalai	26707-02
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps	Rayonet
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate	FUJIFILM Wako	W01SRM19-5000
Sodium Acetate Trihydrate	Nacalai	31115-05
Sodium Bicarbonate	FUJIFILM Wako	199-05985
Sulfuric Acid, 96-98%	FUJIFILM Wako	190-04675
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)	ALDRICH	762342-100MG
tri-Sodium Citrate Dihydrate	Nacalai	31404-15
Xenon light source, MAX-303	Asahi Spectra