Murine model van gecontroleerde corticale impact voor de inductie van traumatisch hersenletsel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor de inductie van muriene traumatisch hersenletsel via een open-Head gecontroleerd corticale impact.

Samenvatting

De centra voor ziektebestrijding en letselpreventie schatten dat bijna 2.000.000 mensen elk jaar in de Verenigde Staten een traumatisch hersenletsel (TBI) ondersteunen. In feite is TBI een factor die bijdraagt tot meer dan een derde van alle letsel-gerelateerde sterfte. Niettemin worden de cellulaire en moleculaire mechanismen die aan de pathofysiologie van TBI liggen, slecht begrepen. Zo zijn preklinische modellen van TBI die in staat zijn om de schade mechanismen die relevant zijn voor TBI bij menselijke patiënten te repliceren, een kritische Onderzoeksbehoefte. Het gecontroleerde corticale impact (CCI) model van TBI maakt gebruik van een mechanisch apparaat om de blootgestelde cortex direct te beïnvloeden. Hoewel geen enkel model de uiteenlopende schade patronen en heterogene aard van TBI bij menselijke patiënten volledig kan recapituleren, is CCI in staat om een breed scala aan klinisch toepasbare TBI te induceren. Bovendien is CCI eenvoudig gestandaardiseerd, zodat onderzoekers resultaten kunnen vergelijken tussen experimenten en onderzoeksgroepen. Het volgende protocol is een gedetailleerde beschrijving van het toepassen van een ernstige CCI met een commercieel beschikbaar beïnvloedingapparaat in een muriene model van TBI.

Inleiding

De centra voor ziektebestrijding en letselpreventie schatten dat ongeveer 2.000.000 Amerikanen ondersteunen een traumatisch hersenletsel (TBI) elk jaar^1,2. In feite, TBI draagt bij aan meer dan 30% van alle letsel gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten met zorgkosten nadert $80.000.000.000 jaarlijks en bijna $4.000.000 per persoon per jaar het overleven van een ernstige TBI^3,4,5. De impact van TBI wordt benadrukt door de aanzienlijke lange termijn Neurocognitieve en neuropsychiatrische complicaties die worden ondervonden door de overlevenden met het verraderlijke begin van gedrags-, cognitieve en motorische beperkingen, genaamd chronische traumatische encefalopathie (CTE) ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10}. zelfs subklinische concussieve gebeurtenissen — die effecten die niet resulteren in klinische symptomen — kan leiden tot langdurige neurologische disfunctie^11,12.

Diermodellen voor de studie van TBI zijn in dienst sinds de late jaren 1800¹³. In de jaren tachtig werd een pneumatisch botslichaam ontwikkeld met het oog op modellering van TBI. Deze methode wordt nu aangeduid als gecontroleerde corticale impact (CCI)¹⁴. De controle en reproduceerbaarheid van CCI leidde onderzoekers om het model aan te passen voor gebruik bij knaagdieren¹⁵. Ons laboratorium gebruikt dit model om TBI te induceren via een in de handel verkrijgbaar botslichaam en elektronisch bedieningsapparaat^16,17. Dit model is in staat om een breed scala van klinisch relevante TBI-toestanden te produceren, afhankelijk van de biomechanische parameters die worden gebruikt. Histologische evaluatie van TBI-hersenen na een ernstig letsel dat in ons laboratorium is geïnduceerd, toont significant ipsilateraal corticale en hippocampal verlies, evenals contralateraal oedeem en vervorming. Bovendien, CCI produceert een consistente beperking in motorische en cognitieve functie zoals gemeten door gedragstesten¹⁸. Beperkingen voor CCI omvatten de noodzaak van craniotomie en de kosten van het verwerven van het botslichaam en de Bedien inrichting.

Verschillende aanvullende modellen van TBI bestaan en zijn goed gevestigd in de literatuur, met inbegrip van de laterale vloeistof percussie model, gewicht druppel model, en Blast letsel model^19,20,21. Terwijl elk van deze modellen hebben hun eigen duidelijke voordelen hun belangrijkste nadelen zijn gemengde letsel, hoge sterfte en gebrek aan standaardisatie, respectievelijk²². Bovendien bieden geen van deze modellen de nauwkeurigheid, precisie en reproduceerbaarheid van CCI. Door het aanpassen van de biomechanische parameters input in de Bedien inrichting, geeft het CCI-model de onderzoeker precieze controle over de grootte van het letsel, de diepte van het letsel en de kinetische energie die op de hersenen wordt toegepast. Dit geeft onderzoekers de mogelijkheid om het gehele spectrum van TBI toe te passen op specifieke gebieden van de hersenen. Het maakt ook de grootste reproduceerbaarheid van experiment om te experimenteren.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door het noordwestelijke universiteits Comité voor dierenverzorging en-gebruik. C57BL/6 muizen werden gekocht bij het Jackson laboratorium en groep gehuisvest in een barrière faciliteit in het centrum voor vergelijkende geneeskunde bij Northwestern University (Chicago, IL). Alle dieren werden ondergebracht in 12/12 h licht/donkere cyclus met gratis toegang tot voedsel en water.

1. anesthesie induceren

1. Anesthetiseer de muis met ketamine (125 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) geïnjecteerd intraperitoneaal.

2. vitale functies bewaken elke 15 min

1. Controleer de temperatuur, de ademhalingsfrequentie en de huidskleur. De muis moet warm aanvoelen. De huid moet roze en goed perfused verschijnen. Ademhalingsfrequentie moet variëren 50 – 70 ademhalingen per minuut.

3. pre-chirurgische ingrepen

1. Weeg alle muizen op de dag voorafgaand aan de blessure inductie.
2. Steriliseren één set chirurgische instrumenten door autoclaven voor elk experimenteel onderwerp. Steriliseer het impact apparaat voor gebruik.
3. Maak een herstel kooi door een schone kooi te plaatsen over een elektrisch verwarmingskussen ingesteld op "laag" en zo gepositioneerd dat de muizen na ambulante afstand van de hitte kunnen afgaan.
4. Stel het operatie theater in binnen een gesteriliseerde laminaire stroom afzuigkap.
   1. Het stereo taxic besturings frame positioneren.
   2. Bevestig het impact apparaat aan het stereotaxic frame.
   3. Stel het bedienorgaan in met de gewenste biomechanische parameters voor snelheid en verblijfstijd.
      Opmerking: in dit protocol wordt een ernstig hersenletsel beschreven met behulp van een 3 mm diameter effect tip via een 5 mm diameter craniectomie met de snelheid ingesteld op 2,5 m/s en een dwelltijd van 0,1 s. Er kan een breed scala aan biomechanische parameters worden gebruikt om het volledige spectrum van TBI te induceren.
5. Trek nieuwe persoonlijke beschermingsmiddelen en steriele handschoenen aan.
6. Scheer de vacht van de operatieve site met behulp van elektrische tondeuses.
7. Breng beschermende opthalmische zalf aan op de ogen van de muis om corneale letsel en drogen te voorkomen.
8. Plaats de muis in het bedienings theater.
9. Bereid de huid voor met een op jodium gebaseerde chirurgische scrub die driemaal wordt afgewisseld met alcohol.

4. toepassing van de gecontroleerde corticale impact

1. De hoofdhuid 1 cm in de middellijn insnijden met een scalpel die de schedel bloot.
2. Plaats de muis binnen een stereotaxaal besturings frame door de bilaterale temporale botten tussen miniatuur oorstaven te beveiligen en de snijtanden binnen een snijtanden-klem te vergrendelen, waardoor een stabiele drie-punts-Hold op de muis kop ontstaat.
3. Trek de hoofdhuid weg van de operatieve plaats met een hemostat of vergrendel tang om ervoor te zorgen dat de hoofdhuid niet in contact komt met de boor tijdens craniectomie.
4. Identificeer de sagittale en coronale hechtingen op de blootgestelde schedel.
   Opmerking: dit protocol centreert de craniectomie 2 mm links van de sagittale hecht en 2 mm rostrale migratoire naar de coronale hecht.
5. Voer een craniectomie uit met een boor met een trefine boor.
   1. Om de craniectomie uit te voeren, Activeer eerst de boor op maximale snelheid en breng vervolgens de genoemd boor loodrecht op de schedel op de plaats van de craniectomie.
   2. Breng zachte, gelijkmatige druk aan op de boor zodra contact is gemaakt met de schedel. Een lichte "geven" zal worden gevoeld zodra de boor door de schedel dringt. Niet doordringen in de onderliggende Dura.
      Opmerking: dit protocol maakt gebruik van een 5 mm genoemd boor om de craniectomie uit te voeren.
6. Gebruik een tang en een kleine gauge hypodermische naald om de botflap te verwijderen, waardoor de onderliggende dura mater volledig wordt blootgesteld.
7. Draai het botslichaam uiteinde in het operatieve veld en verlaag het totdat het contact maakt met de blootgestelde dura mater. Zodra het contact is gemaakt, zal de contact sensor van het instrument een hoorbare Toon maken om de chirurg te waarschuwen dat contact is gemaakt. Hiermee markeert u het nulpunt van waaruit de vervormings diepte is ingesteld.
   Opmerking: dit protocol maakt gebruik van een 3 mm impact tip om een ernstig letsel te genereren. Uiteinden van 1 mm kunnen worden gebruikt om meer gelokaliseerd letsel toe te passen.
8. Trek de impact tip uit en stel de gewenste effect diepte in door de positie van het botslichaam op het stereotaxic frame te verlagen.
   Opmerking: in dit protocol beschrijven we een ernstig letsel door de vervormings diepte in te stellen op 2 mm.
9. De verwonding door het activeren van het botslichaam op het bedieningsorgaan.
10. Draai het effectapparaat uit het veld en verwijder het dier uit het stereotaxsche frame.

5. sluiting van de chirurgische site

1. Controle bloeden uit de schedel en gewonde corticale oppervlak met directe druk van een steriele katoen getipt applicator.
2. Droog de schedel met een steriele katoen getipt applicator.
3. Sluit de hoofdhuid over de craniectomie met behulp van een in de handel verkrijgbare chirurgische lijm of monofilament hechtmiddel.
   Opmerking: in dit protocol wordt een veterinaire chirurgische lijm gebruikt om de hoofdhuid te sluiten. De botflap wordt niet vervangen en wordt weggegooid.

6. postoperatieve verzorging en monitoring

1. Het toedienen van postoperatieve analgesie (bijv. aanhoudende afgifte buprenorfine 0,1 – 0,5 mg/kg subcutaan toegediend, met 72 h aanhoudende analgesie).
2. Plaats het dier in de laterale decubitus herstel positie in een schone voorverwarmde kooi.
3. Observeer de dieren totdat ze wakker en mobiel zijn, en keer vervolgens elke muis terug naar zijn huis kooi.
4. Zorg voor gratis toegang tot voedsel en water. Normale voedsel-en water inname worden doorgaans binnen één tot twee uur na het letsel hervat.
5. Meet het lichaamsgewicht elke drie dagen tijdens het experiment.

Resultaten

Het botslichaam wordt direct op het stereotaxic frame gemonteerd, waardoor er maar liefst 10 μm resolutie is voor de controle van het inslagpunt, de diepte en de penetratie. De gebruikte elektromagnetische krachten kunnen de impact snelheden van 1,5 – 6 m/s weer delen. Dit zorgt voor ongeëvenaarde precisie en reproduceerbaarheid over het gehele bereik van klinisch relevante TBI. Onderzoekers kunnen proef experimenten uitvoeren om de letsel parameters te wijzigen, zoals de grootte van het botslichaam, de botssnelheid en d...

Discussie

Er zijn verschillende stappen die essentieel zijn voor het toepassen van een betrouwbaar en consistent letsel. Ten eerste moet de muis een diep vlak van chirurgische anesthesie bereiken die geen beweging garandeert tijdens de uitvoering van de craniectomie. Terwijl talrijke anesthetica regimes kunnen worden gebruikt voor het opwekken van algemene anesthesie bij knaagdieren, verdoving die induceren respiratoire depressie zoals inhalatieve anesthetica kan resulteren in ademhalingsstilstand wanneer gecombineerd met een erns...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.	5939911020
Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL	Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA	BSRLAB0.5-182012
High Speed Rotary Micromotor KiT0	Foredom Electric Company	K.1070
Imapact one for Stereotaxix CCI	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39463920
Ketathesia Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein, Inc	56344
Mouse Specific Stereotaxic Base	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39462980
Trephines for Micro Drill	Fine Science Tools, Inc	18004-50