Galvanische vestibulaire stimulatie bij mensen vertoont verbeteringen in vestibulaire functie. Echter, het is onbekend hoe deze effecten optreden. Hier beschrijven we hoe sinusoïdale en stochastische elektrische ruis toe te passen en de juiste stimulus amplituden te evalueren in individuele mediale vestibulaire Nucleus neuronen in de C57BL/6-muis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Stochastic Noise-toepassing voor de beoordeling van mediale vestibulaire Nucleus neuron gevoeligheid in vitro
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er is aangetoond dat galvanische vestibulaire stimulatie (GVS) de balans maatregelen verbetert bij personen met een evenwichts-of vestibulaire handicap. Dit wordt voorgesteld te wijten zijn aan de stochastische resonantie (SR) fenomeen, die wordt gedefinieerd als de toepassing van een laag niveau/subdrempelwaarde stimulans om een niet-lineaire systeem te verhogen detectie van zwakkere signalen. Echter, het is nog onbekend hoe SR vertoont zijn positieve effecten op menselijke evenwicht. Dit is een van de eerste demonstraties van de effecten van sinusoïdale en stochastische ruis op individuele neuronen. Met behulp van de hele cel patch klem elektrofysiologie, sinusoïdale en stochastische ruis kan direct worden toegepast op individuele neuronen in de mediale vestibulaire Nucleus (MVN) van C57BL/6 muizen. Hier laten we zien hoe de drempel van MVN neuronen te bepalen om ervoor te zorgen de sinusoïdale en stochastische stimuli zijn subthreshold en vanaf deze, bepalen van de effecten die elk type van lawaai heeft op MVN neuronale winst. We tonen aan dat subdrempelige sinusoïdale en stochastische ruis de gevoeligheid van individuele neuronen in de MVN kan moduleren zonder de basale afvuren te beïnvloeden.
Inleiding
Het vestibulaire (of Balance) systeem regelt ons gevoel van evenwicht door het integreren van auditieve, Proprioceptive, somatosensorische en visuele informatie. Afbraak van het vestibulaire systeem is aangetoond dat het optreedt als een functie van leeftijd en kan resulteren in evenwichts tekorten1,2. Echter, therapieën gericht op de werking van het vestibulaire systeem zijn schaars.
Er is aangetoond dat galvanische vestibulaire stimulatie (GVS) de balans maatregelen, autonome werking en andere sensorische modaliteiten binnen de mens3,4,5,6verbetert. Deze verbeteringen zouden te wijten zijn aan de stochastische resonantie (SR) fenomeen, dat is de toename van de detectie van zwakkere signalen in niet-lineaire systemen via de toepassing van subthreshold lawaai7,8. Deze studies hebben aangetoond verbeteringen in statische9,10 en Dynamic11,12 balans, en vestibulaire output tests zoals oculaire teller Roll (OCR)13. Echter, veel van deze studies hebben gebruikt verschillende combinaties van stimulus parameters zoals witte ruis9, gekleurde ruis13, verschillende stimulus frequentiebereiken en drempelmethode technieken. Daarom blijven optimale stimulus-parameters onbekend en dit protocol kan helpen bij het bepalen van de meest effectieve parameters. Naast stimulus parameters, het type van stimulus is ook belangrijk in de therapeutische en experimentele werkzaamheid. Het bovenstaande werk bij de mens werd uitgevoerd met behulp van elektrische ruis stimuli, terwijl een groot deel van de in vivo dierlijk werk gebruikt mechanische14,15 of optogenetische16 ruis stimuli. Dit protocol zal elektrische ruis gebruiken om de effecten op vestibulaire kernen te onderzoeken.
Eerder werd de toepassing van GV'S voor het stimuleren van primaire vestibulaire afferenten uitgevoerd in vivo in Squirrel Monkeys17, chinchilla's18, kippen embryo's15 en cavia's14. Echter, slechts twee van deze studies onderzocht het effect GVS heeft op de winst van primaire vestibulaire afferents14,15. Deze experimenten werden uitgevoerd in vivo, wat betekent dat de precieze patronen van stimulatie die worden opgelegd aan vestibulaire kernen niet kunnen worden bepaald. Voor onze kennis heeft slechts één andere studie stochastische ruis toegepast op individuele enzymatisch gedisiteerde neuronen in het centrale zenuwstelsel19. Er zijn echter geen experimenten uitgevoerd in de centrale vestibulaire kernen om geschikte stimulus parameters en drempel technieken te beoordelen, waardoor dit protocol preciezer is bij het bepalen van stimulerende effecten op individuele neuronen binnen de vestibulaire Kernen.
Hier beschrijven we hoe sinusoïdale en stochastische (elektrische) ruis rechtstreeks aan individuele neuronen in de mediale vestibulaire Nucleus (MVN) toe te passen, neuronale drempel te bepalen en veranderingen in Gain/gevoeligheid te meten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle beschreven experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de Universiteit van Sydney dierenethiek Commissie (goedgekeurd protocolnummer: 2018/1308).
1. dieren
Opmerking: Muizen werden verkregen uit het Australische knaagdier centrum (ARC; Perth, Australië) en gehouden op de Medical Foundation Building Animal Facility aan de Universiteit van Sydney.
- Houd de muizen op een normale licht/donkere cyclus van 12 uur met milieu verrijking.
- Gebruik mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 muizen (3 – 5 weken oud) voor alle experimenten.
2. voorbereiding van de oplossingen
- Bereid 1 L kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) samengesteld uit 29 mM NaHCO3, 11 mm glucose, 120 mm nacl, 3,3 mm kcl, 1,4 mm Nah2po4, 2,2 mM MgCl2, 2,77 mm CACL2.
- Bereid 200 mL sucrose-ACSF (sACSF) met 29 mM NaHCO3, 11 mm glucose, 241,5 mm sucrose, 3,3 mm kcl, 1,4 mm Nah2po4, 2,2 mM MgCl2, 2,77 mm CACL2. Voorafgaand aan de opname van CACL2 aan de acsf en sacsf, gas de oplossingen met Manager (95% O2 en 5% Co2) tot vaststelling van een pH van 7,4 en Vermijd calcium neerslag (vertroebeling).
- Bereid K+-gebaseerde intracellulaire oplossing samengesteld uit 70 mm kalium gluconaat, 70 mm KCl, 2 mm NaCl, 10 mm Hepes, 4 mm EGTA, 4 mm mg2-ATP, 0,3 mm na3-GTP; met een uiteindelijke pH van 7,3 (aangepast met behulp van KOH).
Opmerking: het wordt aanbevolen om intracellulaire oplossingen met 0,22 μm filters te filteren en 0,5 mL aliquots van de oplossing bij-20 °C op te slaan.
3. voorbereiding van de hersenstam
- Voorafgaand aan brain stem-extractie, evenwichts de sacsf met Manager en koel bij-80 °c gedurende 25 minuten, zodat een ijsslurry wordt gevormd.
- Anaesthetiseer de muis met Isofluraan (3 – 5%) verzadigd in zuurstof (3 mL/min). Zodra de achterpoot reflexen afwezig zijn, onthood de muis met scherpe RVS schaar.
- Bloot de schedel door het maken van een sagittale incisie in de huid met behulp van een scheermesje (#22 afgerond).
- Met behulp van het puntige uiteinde van een paar standaardpatroon schaar maakt u een kleine incisie bij de Lambda en snijdt u langs de longitudinale spleet.
- Reflecteren zorgvuldig de gekoppelde pariëtale botten en de occipitale botten met behulp van een paar ondiepe bocht Pearson Rongeurs.
Opmerking: Gedurende deze hele procedure wordt de hersenen voortdurend in situ gebaand met behulp van de eerder bereide ijskoude sACSF-slurry. - Isoleer de hersenstam van de voor hersenen en de benige omhulling met behulp van een scheermesje (#11 recht) om de parieto-occipitale Sulcus en bij de caudal Medulla te snijden.
- Monteer de geïsoleerde hersenstam ventrale op een eerder geslepen trapeziumvormig polystyreen blok. Verwijder overtollig vocht rond het ontleed weefsel met een lont van weefsel papier om een goede weefsel hechting aan de snij fase te garanderen.
Opmerking: Het polystyreen blok is geknipt in een trapezium vorm, om ervoor te zorgen dat het rostrale migratoire uiteinde van de veroorzaakt past en taps toelomen in het ruggenmerg. - Gebruik Cyanoacrylaat lijm om het polystyreen blok te fixeren met de bijgevoegde hersenstam rostrale migratoire tot aan de snij fase.
- Gebruik een voorschot snelheid van 0,16 mm/s en een trillingsamplitude van 3,00 mm, bereid 200 μm dwarse segmenten van de MVN.
Opmerking: De locatie van de MVN wordt bepaald met behulp van Paxinos en Franklin Mouse Brain Atlas (figuren 79 – 89)20. De MVN (vermeld als MVe in Atlas) ligt onmiddellijk ventrolaterale naar de 4e ventrikel en is grootste recht voor de bevestiging van het cerebellum (tussen de inferieure colliculi en de OBEX). - Gebruik een pipet met kunststof-bies voor het overbrengen van plakjes op een filtreerpapier schijf in een carbogenated ACSF bij 25 °C gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan de opname.
4. instrumenten
- Gebruik een standaard elektrofysiologische Setup om whole-Cell Patch clamp-technieken uit te voeren21.
- Micropipetten bereiden met behulp van een tweestapsprotocol (Heat Step 1:70; Heat Step 2:45) op een pipet-trekker (Zie de tabel met materialen). Micropipetten moeten een eindweerstand hebben van 3 – 5 MΩ met een interne oplossing wanneer ze in het bad worden geplaatst.
Opmerking: De gebruikte instellingen kunnen variëren afhankelijk van de temperatuur in de kamer en kunnen heel vaak veranderen.
5. whole-Cell patch klem elektrofysiologie
- Voor het verkrijgen van volledige-celpatch klem opnames van individuele neuronen in de MVN wordt een op K+gebaseerde interne oplossing gebruikt binnen de Recording pipetten.
- Breng een enkel weefsel segment over van de incubatie kamer naar de opname kamer en bevestig het segment met een nylon draad op een U-vormig gewicht. Parfumeer de opname kamer continu met carbogenated-ACSF bij 25 °C bij een debiet van 3 mL/min.
- Na het vullen van een micro pipet met interne oplossing, lokaliseer de MVN met een laag vermogen (10x) objectief objectief. Met behulp van een High-Power (40x) doelstelling, kunnen individuele neuronen binnen de MVN worden gevestigd.
Opmerking: Celkwaliteit is essentieel voor het waarborgen van kwaliteits opnames en duurzaamheid van de cel wanneer wordt geprobeerd de configuratie van de hele cel te bereiken. Een goede cel zal bolvormige vorm, een reflecterend celmembraan en een onzichtbare kern aantonen. Een slechte cel zal een grote zichtbare kern (ei-achtig) en een gezwollen/gekrompen uiterlijk hebben. - Voordat u het weefsel met de pipet schendt, moet u een kleine hoeveelheid positieve druk toepassen om vuil van de pipetpunt weg te duwen.
- Beweeg de pipet met behulp van de micromanipulator naar het gekozen neuron en een kleine Dimple moet zich op het neuronale membraan vormen. Laat positieve druk los en breng een kleine hoeveelheid negatieve druk aan.
- Zodra een 1 GΩ-afdichting is bereikt, breng dan zachte korte en scherpe positieve druk aan op de pipet houder via de zuig poort om het membraan te breken en een gehele celconfiguratie te creëren.
- Maak opnames van de hele cel stroomtang met behulp van standaardtechnieken21,22.
6. het toepassen van sinusvormige en stochastische ruis op individuele mediale vestibulaire Nucleus neuronen
- Breng de stochastische en sinusoïdale ruis in een reeks amplituden van 3 tot 24 pA om te bepalen van de neuronale drempel en de snelheid van het vuur.
- Bepaal de sensorische drempel door lagere en hogere stimulus intensiteiten te groeperen en een ANOVA uit te voeren om eventuele verschillen te observeren (zoals weergegeven in aanvullend figuur 1).
- Bereken de gemiddelde vuursnelheid over de 10 s-periode waarin de depolariserende stroom stap werd/zal worden geïnjecteerd voor elk afzonderlijk huidig niveau (d.w.z. 7 totale afleveringen; Figuur 1).
- Gebruik de waarden van de gemiddelde afvuren snelheid om een vuursnelheid te genereren ten opzichte van de huidige plot en voer een lineaire regressieanalyse uit om het verloop van de lijn van de beste pasvorm te bepalen. De helling van de lijn van de beste pasvorm is indicatief voor de neuronale Gain22.
Figuur 1: Diagrammatische profielen van controle-, sinusoïdale en stochastische ruis protocollen. A) opMVN-neuronen toegepaste (geen ruis) protocollen. B) sinusoïdale ruis protocol met een frequentie van 2 Hz.C) stochastische geluids protocollen waarbij de meerderheid van het vermogensspectrum ≤ 2 Hz is. Elk protocol dat hier wordt gepresenteerd heeft een amplitude van ± 6 pA met een 10 s depolariserende stroom die stijgt met 10 pA tot 50 pA. De ware stimulus heeft geen depolariserende huidige stap en is daarom de eerste aflevering van deze protocollen om neuronale versterkings veranderingen te bepalen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Initiële opnames kunnen informatie verschaffen over de effecten die sinusoïdale en stochastische ruis hebben op basale afvuren snelheden van individuele MVN-neuronen en hoe de stimuli de versterking van neuronen effect hebben. Figuur 2 toont aan dat noch sinusoïdale noch stochastische ruis basale afvuren snelheden van MVN neuronen veranderen in vergelijking met controle (geen ruis) opnames. Deze informatie is cruciaal voor het bepalen van de drempelwaarde van de afzonderl...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De effecten van galvanische vestibulaire stimulatie (gv's) op het vestibulaire systeem zijn in vivo gemarkeerd bij mensen3,13,23, cavia's14, knaagdieren18 en niet-menselijke primaten24. Echter, geen van deze studies hebben de directe impact van elektrische ruis op de gevoeligheid van individuele neuronen in het vestibulaire systeem beoordeeld. Hier demonstre...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
SPS werd gesteund door de University of Sydney postgraduaat Research beurs.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CaCl | Scharlau | CA01951000 | Gebruikt voor ACSF en sACSF |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Gebruikt voor ACSF en sACSF |
| EGTA | Sigma | E0396-25G | Gebruikt voor K-gebaseerde intracellulaire oplossing |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | Gebruikt voor K-gebaseerde intracellulaire oplossing |
| KCl | Chem-supply | PA054-500G | Gebruikt voor ACSF, sACSF en intracellulaire oplossing |
| K-gluconaat | Sigma | P1847-100G | Gebruikt voor K-gebaseerde intracellulaire oplossing |
| Mg-ATP | Sigma | A9187-500MG | Gebruikt voor K-gebaseerde intracellulaire oplossing |
| MgCl | Chem-supply | MA00360500 | Gebruikt voor ACSF en sACSF |
| Na3-GTP | Sigma | G8877-100MG | Gebruikt voor K-gebaseerde intracellulaire oplossing |
| NaCl | Chem-supply | SO02270500 | Gebruikt voor ACSF en intracellulaire oplossing |
| NaH2PO4•2H2O | Ajax | AJA471-500G | Gebruikt voor ACSF en sACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761-1KG | Gebruikt voor ACSF en sACSF |
| Sucrose | Chem-supply | SA030-500G | Gebruikt voor sACSF |
| Isofluraan | Henry Schein | 1169567762 | Gebruikt voor anesthesie van muizen |
| UITRUSTING | |||
| Borosilicat glas capillairen | Warner instruments | GC150T-7.5 | 1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm lengte |
| Data acquisitie software | Axograph | Gebruikt voor elektrofysiologie en analyse | |
| Friedmen-Pearson Rongeurs | World precision instruments | 14089 | Gebruikt voor dissectie |
| Micropipet puller | Narishige | PP-830 | Gebruikt voor micropipet |
| Multiclamp versterker | Axon instruments | 700B | Gebruikt voor elektrofysiologie |
| pH meter | Sper scientific | 860033 | Gebruikt voor interne oplossing |
| Standaard patroon schaar | FST | 14028-10 | Gebruikt voor dissectie |
| Sutter micromanipulator | Sutter | MP-225/M | Gebruikt voor elektrofysiologie |
| Staande microscoop | Olympus | BX51WI | Gebruikt voor elektrofysiologie |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Gebruikt voor het snijden van hersenweefsel |
Referenties
- Amiridis, I. G., Hatzitaki, V., Arabatzi, F. Age-induced modifications of static postural control in humans. Neuroscience Letters. 350 (3), 137-140 (2003).
- Iwasaki, S., Yamasoba, T. Dizziness and imbalance in the elderly: age-related decline in the vestibular system. Aging and disease. 6 (1), (2015).
- Fujimoto, C., et al. Noisy galvanic vestibular stimulation induces a sustained improvement in body balance in elderly adults. Scientific Reports. 6, 37575(2016).
- Breen, P. P., et al. Peripheral tactile sensory perception of older adults improved using subsensory electrical noise stimulation. Medical Engineering & Physics. 38 (8), 822-825 (2016).
- Yamamoto, Y., Struzik, Z. R., Soma, R., Ohashi, K., Kwak, S. Noisy vestibular stimulation improves autonomic and motor responsiveness in central neurodegenerative disorders. Annals of Neurology. 58 (2), 175-181 (2005).
- Soma, R., Nozaki, D., Kwak, S., Yamamoto, Y. 1/f noise outperforms white noise in sensitizing baroreflex function in the human brain. Physical Review Letters. 91 (7), 078101(2003).
- Wiesenfeld, K., Moss, F. Stochastic resonance and the benefits of noise: from ice ages to crayfish and SQUIDs. Nature. 373 (6509), 33-36 (1995).
- Moss, F., Ward, L. M., Sannita, W. G. Stochastic resonance and sensory information processing: a tutorial and review of application. Clinical Neurophysiology. 115 (2), 267-281 (2004).
- Goel, R., et al. Using low levels of stochastic vestibular stimulation to improve balance function. PloS one. 10 (8), e0136335(2015).
- Inukai, Y., et al. Effect of noisy galvanic vestibular stimulation on center of pressure sway of static standing posture. Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 11 (1), 85-93 (2018).
- Mulavara, A. P., et al. Using low levels of stochastic vestibular stimulation to improve locomotor stability. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 117(2015).
- Iwasaki, S., et al. Noisy vestibular stimulation increases gait speed in normals and in bilateral vestibulopathy. Brain stimulation. 11 (4), 709-715 (2018).
- Serrador, J. M., Deegan, B. M., Geraghty, M. C., Wood, S. J. Enhancing vestibular function in the elderly with imperceptible electrical stimulation. Scientific Reports. 8 (1), 336(2018).
- Kim, J., Curthoys, I. S. Responses of primary vestibular neurons to galvanic vestibular stimulation (GVS) in the anaesthetised guinea pig. Brain Research Bulletin. 64 (3), 265-271 (2004).
- Flores, A., et al. Stochastic resonance in the synaptic transmission between hair cells and vestibular primary afferents in development. Neuroscience. 322, 416-429 (2016).
- Huidobro, N., et al. Brownian Optogenetic-Noise-Photostimulation on the Brain Amplifies Somatosensory-Evoked Field Potentials. Frontiers in Neuroscience. 11, 464-464 (2017).
- Goldberg, J., Ferna, C., Smith, C. Responses of vestibular-nerve afferents in the squirrel monkey to externally applied galvanic currents. Brain Research. 252 (1), 156-160 (1982).
- Baird, R., Desmadryl, G., Fernandez, C., Goldberg, J. The vestibular nerve of the chinchilla. II. Relation between afferent response properties and peripheral innervation patterns in the semicircular canals. Journal of Neurophysiology. 60 (1), 182-203 (1988).
- Remedios, L., et al. Effects of Short-Term Random Noise Electrical Stimulation on Dissociated Pyramidal Neurons from the Cerebral Cortex. Neuroscience. 404, 371-386 (2019).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Gulf professional publishing. (2004).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. Journal of Neurophysiology. 95 (5), 3208-3218 (2006).
- Camp, A., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170 (1), 348-360 (2010).
- Iwasaki, S., et al. Effect of Noisy Galvanic Vestibular Stimulation on Ocular Vestibular-Evoked Myogenic Potentials to Bone-Conducted Vibration. Front in Neurology. 8, 26(2017).
- Goldberg, J., Smith, C. E., Fernandez, C. Relation between discharge regularity and responses to externally applied galvanic currents in vestibular nerve afferents of the squirrel monkey. Journal of Neurophysiology. 51 (6), 1236-1256 (1984).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
