Gerichte antilichamen blokkering door een Dual-functioneel conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetics (DCAF)

Samenvatting

De ontwikkeling van een Dual-functioneel conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetica (DCAF) is een roman voor de eliminatie van schadelijke antilichamen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de synthese van DCAF1 molecuul, dat selectief 4G2 antilichamen kan blokkeren om antilichaam afhankelijke verbeterings effecten te elimineren tijdens een Denguevirus infectie.

Samenvatting

Eliminatie van schadelijke antilichamen tegen organismen is een waardevolle aanpak voor de interventie van met antilichamen geassocieerde ziekten, zoals dengue hemorragische koorts en auto-immuunziekten. Aangezien duizenden antilichamen met verschillende epitopen in het bloed circuleren, werd er geen universele methode gerapporteerd, met uitzondering van het dubbele functionele conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetica (DCAF), om specifieke schadelijke antilichamen aan te richten. De ontwikkeling van DCAF moleculen levert een aanzienlijke bijdrage aan de voortgang van gerichte therapie, die werden aangetoond dat het elimineren van het antilichaam afhankelijke verbetering (ADE) effect in een Denguevirus (DENV) infectie model en ter bevordering van de acetylcholine receptor activiteit in een myasthenia gravis model. Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van een DCAF-molecuul (DCAF1), dat selectief 4G2-antilichamen kan blokkeren om het ADE-effect te verzachten tijdens een dengue-virus infectie en de binding van DCAF1 tot 4G2-antilichaam door een ELISA-test te illustreren. In onze methode wordt DCAF1 gesynthetiseerd door de conjugatie van een hydrazine derivaat van een FC-III peptide en een recombinant uitgedrukt lange α-helix met antigene sequentie door inheemse chemische ligatie (NCL). Dit protocol is met succes toegepast op DCAF1 en andere DCAF moleculen voor de targeting van hun verwant antilichamen.

Inleiding

Antilichamen spelen een belangrijke rol in de humorale immuunrespons voor de neutralisatie van pathogene bacteriën en virussen¹. Sommige antilichamen vertonen echter schadelijke effecten op de organismen, zoals kruisreactieve antilichamen in het ade-effect tijdens denv-infectie en overmatige reactieve antilichamen in myasthenia gravis, een auto-immuunziekte^2,3. ADE-effect wordt gemedieerd door de kruisreactieve antilichamen die de brug maken om denv en FC-receptor met cellen^4,5te verbinden, terwijl myasthenia gravis wordt veroorzaakt door de overmatige antilichamen die acetylcholine-receptoren aanvallen tussen de cel-cel knooppunten in spierweefsel^6,7. Hoewel er gedeeltelijk effectieve benaderingen zijn ontwikkeld voor de behandeling van deze ziekten^8,9, zou ongetwijfeld directe eliminatie van deze schadelijke antilichamen vooruitgang voor de interventies.

Onlangs, DCAF moleculen, die hebben dual-functionele groepen, zijn ontwikkeld voor gerichte antilichamen blokkering¹⁰. DCAF is een lange peptide die bestaat uit 3 delen: 1) een antigeen deel dat specifiek kan herkennen de verwant antilichaam, 2) een FC-III of FC-III-4c-tag voor sterk binden aan de FC-regio van het antilichaam voor de remming van ofwel FC receptor of complement component eiwitten , 3) een lange α-spiraalvormige linker die deze twee functionele groepen¹⁰conjugaten. Het linker deel, ontworpen vanuit Moesin FERM domein, werd geoptimaliseerd door Rosseta software om ervoor te zorgen dat het antigeen deel en FC-III deel in een DCAF molecuul kan binden aan de Fab en FC regio's van IgG tegelijkertijd. Vier DCAF moleculen zijn gesynthetiseerd om te richten op 4 verschillende antilichamen, onder hen DCAF1 werd gebruikt om te elimineren 4G2 antilichamen, dat is een cross-reactieve antilichaam tijdens DENV-infectie om bij te dragen aan ADE-effect; en DACF4 is ontworpen voor de redding van acetylcholine-receptoren door het blokkeren van mab35 antilichaam in myasthenia gravis¹⁰.

In de huidige studie, genomen DCAF1 als het voorbeeld, we toonden de protocollen voor de synthese van DCAF molecuul en de detectie van de interactie tussen een DCAF en haar verwant antilichamen. De DCAF1 wordt semi-gesynthetiseerd door NCL-aanpak^11,12,13,14, die het hydrazine derivaat van een FC-III-peptide en de uitgedrukte linker-antigeen delen samen conjugaten. De NCL aanpak heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van volledig chemische synthese en volledig recombinant expressie voor DCAF1 synthese, omdat beide methoden leiden tot lage opbrengst en hoge kosten. De huidige aanpak is niet alleen de meest kosteneffectieve manier om de volledige DCAF te krijgen, maar kan ook de conformatie van de linker deel vergelijkbaar als zijn oorspronkelijke vorm te handhaven. Aangezien verschillende DCAF moleculen vergelijkbare sequenties hebben, met uitzondering van de antigeen onderdelen, kunnen onze methoden voor DCAF1 synthese en de interactie test tussen DCAF1 en 4g2 antilichaam worden toegepast op andere DCAF moleculen om hun verwant antilichamen ook te blokkeren.

Protocol

1. chemische synthese van het hydrazine derivaat van een FC-III peptide

1. 2-cl-(TRT)-cl-hars omzetten in 2-cl-(TRT)-NHNH₂ -hars
   1. Weeg 625 mg 2-cl-(TRT)-cl Resin (0,25 mmol) in een 25 mL peptide synthese vat.
   2. Voeg 5 mL N, N-dimethylformamide (DMF) toe aan de hars van de bovenkant van het vat, zet de dop terug, schud het vat zachtjes gedurende 15 sec. en giet het vervolgens af. Herhaal DMF-wassing nog twee keer.
   3. Voeg 5 mL dichloormethaan (DCM) toe aan het vat, zet de dop terug, schud het vat zachtjes gedurende 15 sec. en giet het vervolgens af. Herhaal DCM wassen nog twee keer.
   4. Herhaal stap 1.1.2 drie keer.
   5. Gebruik 6 mL van 50% (vol/vol) DMF/DCM om de hars gedurende 30 minuten te laten opzwellen en vervolgens af te tappen.
   6. Overdracht 6 mL 5% (vol/vol) NH₂NH₂ in DMF schud het mengsel met 120 TPM, 30 °c gedurende 30 minuten en giet de oplossing vervolgens af met een vacuümpomp.
      Opmerking: Voeg 0,3 mL hydrazine hydraat toe aan 5,7 mL DMF om 5% (vol/vol) te krijgen NH₂NH₂. Vers bereid NH₂NH₂ voor gebruik.
      Let op: hydrazine hydraat is een gevaarlijke stof en kan kanker veroorzaken. Draag een Labcoat, handschoenen en een masker. Voer de experimenten uit in een rook afzuigkap.
   7. Voeg 5 mL DMF toe aan het vat, schud het zachtjes gedurende 15 sec. en giet het vervolgens af.
   8. Herhaal stap 1.1.6 en was de hars door de stappen 1.1.2-1.1.4 tweemaal te herhalen.
   9. Voeg 6 mL van 5% (vol/vol) MeOH/DMF toe aan het vat, schud het zachtjes gedurende 10 minuten en giet het vervolgens af.
      Opmerking: deze stap is zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de niet-gereageerd sites op de hars zijn afgedekt.
   10. Was de hars grondig door de stappen 1.1.2-1.1.4 te herhalen.
   11. Voeg 5 mL DCM toe aan de hars, schud het zachtjes gedurende 15 s en giet het vervolgens af om 2-cl-(TRT)-NHNH₂ -hars te verkrijgen.
       Opmerking: de hars wordt geel of licht groen wanneer de vervanging succesvol is.
2. Peptide verlenging
   1. Voeg 1 mmol van de Fmoc-Ala-OH (934 mg) en 0,95 mmol van 1-[bis (Dimethylamino) methyleen]-1H-1, 2, 3-triazolo-[4, 5-b] Pyridinium hexafluorofosfaat 3-oxide (HATU) (360 mg) in een 5 mL buisje met 3 mL DMF.
      Let op: blootstelling aan HATU kan een allergische reactie veroorzaken. Draag een Labcoat, handschoenen en een masker.
   2. Voeg 2 mmol N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (0,36 mL) toe aan de opgeloste oplossing en Vortex voor 0,5 – 1 min.
      Opmerking: kritieke stap: de activering moet niet meer dan 5 min, als de geactiveerde aminozuren isomeriseren van de meer actieve O-formulieren naar de minder actieve N-formulieren na verloop van tijd.
   3. Voeg de geactiveerde Fmoc-Ala-OH toe aan het reactievat met de 2-cl-(TRT)-NHNH₂ hars, bereid uit stap 1,1. Schud zachtjes met 120 rpm, 30 °C gedurende 20 minuten in een constant-temperatuurshaker en giet de oplossing vervolgens af met een vacuümpomp.
   4. Voeg 5 mL DMF toe om de hars te wassen, schud het voorzichtig voor 15 sec. en giet het vervolgens af.
   5. Voeg 1 mmol van de Fmoc-Ala-OH (934 mg) en 0,95 mmol van 2-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-1, 1, 3, 3-tetramethylaminium hexafluorofosfaat (HCTU) (390 mg) toe aan een buisje van 5 mL met 3 mL DMF.
      Let op: blootstelling aan HCTU kan een allergische reactie veroorzaken. Draag een Labcoat, handschoenen en een masker.
   6. Voeg 2 mmol DIEA (0,36 mL) toe aan de buis en Vortex voor 0,5 – 1 min om het op te lossen.
   7. Voeg de geactiveerde Fmoc-Ala-OH toe aan het reactievat. Schud zachtjes met 120 rpm, 30 °C voor 40-60 min in een constant-temperatuurshaker en giet de oplossing vervolgens af met een vacuümpomp.
   8. Was de hars door de stappen 1.1.2-1.1.4 te herhalen.
   9. Voeg 4 mL van 20% (vol/vol) Piperidine in DMF toe aan de hars, schud het zachtjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en giet vervolgens de oplossing af.
      Let op: Pyridine is zeer licht ontvlambaar en giftig. Voer de experimenten uit in een rook afzuigkap.
   10. Voeg nog eens 4 mL van 20% (vol/vol) Piperidine in DMF toe aan de hars, schud het zachtjes gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en giet vervolgens de oplossing af.
   11. Volg de stappen 1.2.1-1.2.10 te koppel en debescherm de Fmoc-Ala-OH, Fmoc-thr-OH, Fmoc-CYS-OH, Fmoc-his-OH en Fmoc-Ala-OH. Herhaal stappen 1.2.5-1.2.10 om de Fmoc-TRP-OH, Fmoc-val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-glu-OH, Fmoc-Gly-Oh en Fmoc-ASP-Oh te koppel en debeschermen.
   12. Herhaal stap 1.1.2-1.1.4 om de hars grondig te wassen.
   13. Herhaal stap 1.1.3 om de hars te wassen en vervolgens de hars gedurende 5 minuten te stofzuigen.
3. Decolleté van het hydrazine afgeleide FC-III ruw peptide
   1. Voeg 12 ml cocktails trifluorazijnzuur (TFA)/2 toe, 2 ′-(ethyleenedioxy) diethanethiol (Dodt)/triisopropylsilaan (tips)/m₂O (92,5/2.5/2.5/2.5) aan de hars, en gebruik vervolgens een constant-temperatuur Shaker om de peptide van de hars op 200 rpm te klieven, 37 °C over 2 h. Filtreer het mengsel in een centrifugebuis van 50 mL.
   2. Voeg 1 mL cocktails toe aan de hars om het te wassen en vang het filtraat op in de centrifugebuis van 50 mL. Herhaal twee keer.
   3. Concentreer het mengsel op 2 mL door een vaper-rotor in een rook afzuigkap en voeg vervolgens 20 mL voorgekookte diethyl ether in de buis toe om ruwe peptiden te precipderen.
      Opmerking: de watervrije ether moet worden voorgekookt tot 0 °C om te voorkomen dat er gewelddadige warmte vrijkomt, wat nevenreacties van het ruwe peptide kan veroorzaken.
   4. Inbroed de peptide precipitatie bij-20 °C voor 1-2 h.
   5. Centrifugeer bij 5.000 x g, 4 °c gedurende 10 minuten en verwijder het oplosmiddel voorzichtig uit de centrifugebuis.
   6. Voeg tweemaal 20 mL voorgekookte diethylether toe aan de buis volgens de stappen 1.3.3-1.3.5 om de neerslag te wassen. Lucht-droog het peptide product in een horlogeglas voor ongeveer 15 min. Bewaar de gedroogde ruwe peptiden bij 4 °C voor verdere analyse.
4. Zuivering van het hydrazine derivaat van een FC-III peptide
   1. Gebruik het High-Performance vloeistofchromatografie (HPLC) systeem om de peptide te zuiveren met een 30 min gradiënt elutie (0-1 min, 5% b; 1-20 min, 50% b; 20-25 min, 85% b; 25-30 min, 85% b) bij een debiet van 1 ml/min.
      Opmerking: de kolom is in 4,6 mm ID, 250 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% TFA in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% TFA.

2. eiwit expressie en zuivering van linker-en antigeen onderdelen

1. Plasmide constructie
   1. Synthetiseren van de hele gen sequentie die SUMO-linker-antigeen kan uitdrukken (Zie tabel van de materialen).
   2. Snijd 10 ng van PET-28a lege Vector en 50 ng van het gesynthetiseerde SUMO-linker-antigeen DNA-fragment met behulp van NcoI en XhoI in een 37 °C waterbad voor 3 uur.
   3. Reinig de dubbel-enzym verteerde vector en DNA fragment door DNA gel extraction Kit.
   4. Voeg 5 μL DNA verteerde DNA-fragment, 5 μL verteerde vector, 1 μL T4-DNA-ligase, 2 μL 10x ligase buffer en 7 μL ddH₂O toe aan een reactie buis, en inincuberen het vervolgens 's nachts bij 16 °c.
   5. Meng 10 μL van het ligatie product van stap 2.1.4 in 100 μL van de bevoegde cellen (DH5α) en zet het op een ijsbad gedurende 30 min. plaats de bevoegde cellen in een water bad van 42 °C voor 90 s en breng het snel over in een ijsbad gedurende 2 minuten. Voeg 800 mL LB vloeibaar medium (zonder antibiotica) aan de buis en schud het bij 37 °C, 180 rpm voor 1 h. mantel de bevoegde cellen op een kanamycine LB plaat om ze gelijkelijk verdeeld te maken, en zet de plaat 's nachts in een 37 ° c incubator.
   6. Kies 5 enkele kolonies van de plaat en kweek de bacteriën in 5 mL LB medium in een reageerbuis met een 37 °C Shaker.
   7. Extract plasmiden uit de bacteriën geoogst uit stap 2.1.6 met behulp van plasmide extractie Kit.
   8. Stuur de plasmiden voor gensequencing en kies de positieve kolonie die SUMO-linker-antigeen fusie-eiwit kan uitdrukken. Transformeer de positieve plasmide naar BL21 (DE3) plysS bevoegde cellen na stap 2.1.5.
2. Eiwit zuivering
   1. Kies een enkele kolonie van transformanten uit stap 2.1.7 in 5 mL LB vloeibaar medium met kanamycine (50 μg/mL). Schud de culturen 's nachts bij 200 rpm, 37 °C.
   2. Inoculeren 1 L voorverwarmde LB medium met kanamycine (50 μg/mL) in een kolf met 5 mL van de nachtelijke culturen, en groeien bij 37 ° c met krachtig schudden, totdat de OD₆₀₀ 0,6 is.
   3. Voeg Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) toe aan de gemiddelde tot de eindconcentratie van 0,4 mM en schud de kolf met 200 rpm 's nachts bij 20 °C.
      Opmerking: lage temperatuur voor eiwit inductie is belangrijk om te voorkomen dat inclusie lichaam vorming, dus zorg ervoor dat de temperatuur is niet meer dan 22 °C.
   4. Na het oogsten van de cellen, voeg 50 mL lysisbuffer toe aan de celpellets om de cellen te hervatten. Sonicate de celllysates tweemaal gedurende 5 minuten bij 200 W, echografie 3 s, interval 3 s op ijs. Centrifugeer het op 15, 000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c om de supernatants te verzamelen.
      NB: de lysisbuffer bestaat uit 50 mM NaH₂po₄, 300 mm NaCl, 10 mm imidazol. Stel de pH-waarde in op 8,0 met behulp van NaOH.
   5. Voeg 2 ml van de 50% ni-NTA sephorase, geevenwichts door lysisbuffer, toe aan de geklaard supernatanten en meng zachtjes door schudden (200 rpm op een roterende Shaker) bij 4 °c gedurende 1 uur.
   6. Laad het lysaat-en ni-NTA-mengsel in een kolom met de onderste uitlaatklep en verwijder de onderste dop en gooi de kolom doorstroom weg.
   7. Was driemaal met 6 mL wasbuffer en elueer het beoogde eiwit 3 keer met 1,5 mL eletie buffer. Verzamel het eluaat in één buis.
      Opmerking: de wasbuffer bestaat uit 50 mM NaH₂po₄, 300 mm NaCl, 30 mm imidazol. Stel de pH-waarde in op 8,0 met behulp van NaOH. De elutie buffer bestaat uit 50 mM NaH₂po₄, 300 mM NaCl, 250 mm imidazol. Stel de pH-waarde in op 8,0 met behulp van NaOH.
   8. Plaats het eluaat in een dialyse zakje in 1 L van 50 mM PBS bij 4 °C om het eiwit te dezout. Vervang nieuwe fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 3 keer.
3. Splijting van de SUMO-tag
   1. Voeg 2 mL kleine Ubiquitin-achtige modifier (SUMO) gelabelde eiwitten toe bij de concentratie van 1 mg/mL, 1 mL SUMO protease (Zie tabel van de materialen), 1 ml van de 10X Sumo protease buffer en 6 ml DDH₂O om de reactie oplossing te bereiden.
      Opmerking: SUMO tag eiwitconcentratie is ongeveer 1 mg/mL. Overmatige concentraties na enzym vertering kunnen de coagulatie van het eiwit veroorzaken.
   2. Inbroed het mengsel voor 12-16 uur bij 4 °C.
   3. Centrifugeer het mengsel op 15.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en gooi de aggregaten weg. Voeg 0,5 ml van de 50% ni-NTA slurry, met een evenwichts afwijking van 50 mm PBS, toe aan de 10 ml supernatanten en meng zachtjes door schudden (200 rpm op een roterende Shaker) bij 4 °c gedurende 60 min.
   4. Laad het lysaat en het ni-NTA mengsel in een kolom met de onderste uitlaat afgetopt. Verwijder de onderste dop en sla de stroom vervolgens op in een centrifugebuis van 15 mL.
      Opmerking: Histahet SUMO-eiwit is bindend voor de kolom. Het linker-antigeen deel, dat begint met CYS voor NCL-reactie, is in de stroom doorheen.
   5. Centrifugeer de stroom gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 15.000 x g en gooi de aggregaten weg. Reinig het linker-antigeen-onderdeel met behulp van HPLC met een gradiënt elutie van 25 min (0-1 min, 5% B; 1-3 min, 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% b) bij een debiet van 1 mL/min.
      Opmerking: de kolom is in 4,6 mm ID, 250 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% TFA in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% TFA.
   6. Verzamel het gezuiverde product van de HPLC en vriesdrogen 's nachts in om het linker-antigeen product te krijgen.

3. montage van DCAF1 door inheemse chemische ligatie

1. Samenvoegen van FC-III peptide en linker-antigeen deel
   1. Weeg 1,8 mg (1 μmol) hydrazine derivaat van een FC-III peptide in een 2 mL EP Tube en Voeg 0,8 mL 6 M GnHCl toe in 0,2 M NaH₂po₄ (pH 3,0) oplossing om het op te lossen door vortexing.
      Opmerking: 6 M GnHCl in 0,2 M NaH₂po₄ (pH 3,0) oplossing wordt bereid door de pH-waarde aan te passen met HCl of NaOH.
      Let op: NaOH en HCl zijn zeer corrosief. Draag een Labcoat, handschoenen en een masker.
   2. Na het centrifugeren van de buis bij 7.200 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur, zet de buis in een ijszout bad en gebruik het magnetische roeren om de oplossing gedurende 15 minuten zachtjes te agiteren.
   3. Voeg 40 μL 0,5 M NaNO₂ toe aan de oplossing om de hydrazine groep te oxideren. Roer de oplossing zachtjes voor nog eens 15 minuten in het ijszoutbad.
   4. Weeg en voeg 11 mg gezuiverd linker-antigeen deel bereid uit stap 2,3 en 13,6 mg 4-mercaptophenylazijnzuur (MPAA) in de reactie buis in het ijszoutbad, roer gedurende 5 minuten en pas vervolgens de pH-waarde aan op 6,8-7,0 bij kamertemperatuur met 6 M NaOH.
      Opmerking: de pH-waarde op neutraal instellen is de kritieke stap om de ligatie reactie te initiëren.
   5. Voeg na 12 uur 0,4 mL van 0,1 M Tris (2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride (TCEP) neutrale oplossing (pH 7,0) toe aan het reactiesysteem en roer gedurende 20 minuten om de reactie te beëindigen.
      Opmerking: 0,1 M TCEP neutrale oplossing (pH 7,0) wordt bereid door het oplossen van TCEP in 6 M GnHCl in 0,2 M NaH₂po₄ (pH 3,0) oplossing, en het gebruik van NaOH om de pH-waarde aan te passen 7,0.
   6. Centrifugeer de buis bij 15.000 x g gedurende 10 minuten, analyseer en reinig het ligatie product met HPLC met een verloop-elutie van 26 min (0-1 min, 5% b; 1-21 min, 45% b; 21-22 min, 85% b; 22-26 min, 85% b) bij een debiet van 1 ml/min. Het verwachte rendement voor de ligatie reactie is meer dan 50%.
      Opmerking: de kolom is in 4,6 mm ID, 250 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% TFA in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% TFA.
2. Ontzwaveling van het geconjugeerde
   1. Los het geconjugeerde (3,4 mg, 0,3 μmol) op, bereid uit stap 3.1.6 in 50 μL van 6 M GnHCl in 0,2 M NaH₂po₄ (pH 7,0) oplossing.
   2. Voeg 50 μL van 1 M TCEP, 10 μL tBuSH en 5 μL 0,1 M VA-044 oplossing toe aan het bovenstaande mengsel.
      Opmerking: 0,1 M VA-044 oplossing wordt bereid door het oplossen van 9,7 mg VA-044 poeder in 0,3 mL van 6 M GnHCl in 0,2 M NaH₂po₄ (pH 7,0) oplossing. De VA-044-oplossing moet vóór gebruik vers worden bereid, omdat VA-044 gemakkelijk kan worden geoxideerd door blootstelling aan lucht.
   3. Stel de uiteindelijke pH van de oplossing in op 6,9 en houd de solutiomat 37 °C gedurende ongeveer 5 uur roeren.
   4. Centrifugeer de buis bij 15.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder de onoplosbare stof. Analyseer en reinig het ligatie product met HPLC met een verlopende elutie van 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) bij een debiet van 1 mL/min. Het verwachte rendement voor de ontzwavelings reactie is ongeveer 40%.
      Opmerking: de kolom is in 4,6 mm ID, 250 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% TFA in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% TFA.
3. Verwijdering van ACM om het eindproduct te krijgen DCAF1
   1. Los de peptide (1,35 mg, 0,11 μmol) op, bereid uit stap 3.2.4 in 200 μL 32 mM AgOAc, en roer vervolgens het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
   2. Voeg 3 μL 1M Dithiothreitol (DTT) toe in 6 M GnHCl in 0,2 M NaH₂po₄ (pH 7,0) oplossing om de zilver thiolaten op peptide te converteren naar vrije thiolen.
   3. Na hevig roeren gedurende 1 minuut, centrifugeer de buis op 15.000 x g gedurende 10 minuten om de onoplosbare stof te verwijderen. Analyseer en reinig het eindproduct met HPLC met een verlopende elutie van 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) bij een debiet van 1 mL/min. Het verwachte rendement voor de ACM deprotection-reactie is ongeveer 30%.
      Opmerking: de kolom is in 4,6 mm ID, 250 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% TFA in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% TFA.
   4. Na HPLC-zuivering het eindproduct 's nachts bevriezen en los het poeder op in PBS (50 mM NaH₂po₄, 150 mm nacl, pH 8,0). Centrifugeer de buis bij 15.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en gooi de pellet weg.
   5. Pas de concentraties van het eindproduct (van stap 3,4) en linker-antigeen deel (van stap 2.3.6) tot 10 μM, noteer de circulair dichroïsme (CD) spectra van 260 tot 195 nm van deze twee producten met behulp van een CD-spectrometer bij 25 ° c met 1 mm padlengte.
      Opmerking: CD-spectra worden gebruikt om aan te tonen dat de hoeveelheid α-spiraalvormige structuur in het eindproduct gelijk is aan die in de recombinant uitgedrukt.

4. detectie van de producten door massaspectrometrie

1. Scheid het product van elke chemische reactie met een 60 min gradiënt elutie (0-8 min, 2% b; 8-10 min, 5% b; 10-35 min, 30% b; 35-50 min, 50% b; 50-52 min, 80% b; 52-58 min, 80% b; 58-59 min, 2% b; 59-60 min, 2% a) bij een debiet van 0,300 μL/min met een Nano-HPLC-systeem dat direct wordt afgewisseld met de hoge resolutie massaspectrometer.
   Opmerking: de analytische kolom is in 75 μm ID, 150 mm lengte, verpakt met C-18 hars. Mobiele fase A bestond uit 0,1% mierenzuur in water, en mobiele fase B bestond uit 100% acetonitril en 0,1% mierenzuur.
2. Bedien de massaspectrometer in de Full-scanmodus en stel het m/z-bereik in op 300-2000 en resolutie op 60.000.
3. Open de Mass Spectra data en vind de toppen van het product in elke stap om te bevestigen dat de chemische reactie succesvol is voorbereid.

5. ELISA-test van de interactie tussen DCAF1 en 4G2-antilichamen

1. Coat een 96-well microtiterplaat met 1 pmol anti-GST antilichaam (Zie tabel van de materialen) in 100 μL coating buffer/put, verzegelen de plaat en incuberen het bij 4 °c 's nachts op een shaker.
2. Blokkeer elk goed met 200 μL van 1% BSA in PBS, sluit de plaat af en incuberen deze bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een shaker.
3. Was elke Put 4 keer door PBS te gebruiken met 0,05% Tween 20.
4. Voeg het GST-gesmolten antigeen-eiwit (0,05 pmol in 100 μL blokkerende oplossing) toe aan de putjes, sluit de plaat af en incuberen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
   Opmerking: GST-gesmolten antigeen-eiwit wordt uitgedrukt in bacteriën en gezuiverd door GSH Sepharose.
5. Herhaal stap 5,3 om de plaat te wassen.
6. Voeg 1 pmol 4G2-antilichaam of 1 pmol 4G2-antilichaam plus de andere liganden toe: antigeen, FC-III of DCAF1 bij serie hoeveelheden (0,1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol en 1000 pmol) in 100 μL blokkerende oplossing/goed, sluit de plaat af en inbroed 2 uur bij kamer
7. Herhaal stap 5,3 om de plaat te wassen.
8. Voeg anti-muis IgG, HRP-linked antilichaam (1:20000 verdunning) toe in 100 μL blokkerende oplossing/goed, sluit de plaat af en inincuberen 30 min bij kamertemperatuur op een shaker.
9. Was elke put 6 keer door PBS te gebruiken met 0,05% Tween 20.
10. Meng TMB-reagens A en B 1:1 in volume onmiddellijk vóór gebruik, voeg 100 μL/goed toe en inincuberen 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
11. Voeg 100 μL/put van stop oplossing toe en gebruik een plaat lezer om de OD₄₅₀ -waarden voor elke put binnen 30 minuten te meten.

6. ELISA-test van de interactie tussen FC-III en IgG-molecuul

1. Coat een 96-well microtiterplaat met 1 pmol anti-CA antilichaam (Zie tabel van de materialen) in 100 μL coating buffer/put, verzegelen de plaat en incuberen deze bij 4 °c 's nachts op een shaker.
2. Herhaal de stappen van 5,2 tot 5,3.
3. Voeg de FC-III of FC-III-4C gesmolten CA-eiwit (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 en 1 pmol in 100 μL blokkerende oplossing) toe aan de putjes, sluit de plaat af en incuberen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
   Opmerking: FC-III of FC-III-4C gesmolten CA-eiwit wordt uitgedrukt in bacteriën en gezuiverd door ni-NTA.
4. Herhaal de stappen van 5,7 naar 5,11 en controleer de resultaten.

Resultaten

Het stroomdiagram voor de syntheseroute door inheemse chemische ligatie in dit artikel wordt weergegeven in Figuur 1. Figuren 2-6 Toon de chromatogrammen (A) en massa spectra (B) van chemisch gesynthetiseerd hydrazine derivaat van een FC-III-peptide, recombinant uitgedrukt linker-en antigeen-deel, het gezuiverde product van de NCL-reactie, de gezuiverde product uit de ontzwavelings reactie en het gezuiverde eindproduct DCAF1, respectievelijk...

Discussie

Het protocol hier beschrijft de semi-synthese en detectie van DCAF1 met behulp van NCL benadering, die wordt weergegeven in Figuur 1. Kort, de twee fragmenten van DCAF1 zijn chemisch gesynthetiseerd en recombinantly uitgedrukt, respectievelijk; dan, de volledige lengte DCAF1 molecuul wordt geassembleerd, aangepast en gezuiverd. Voor de door hydrazine afgeleide FC-III-fragment synthese is het gebruik van 2-cl-hars met lage capaciteit heel belangrijk, omdat een hoge capaciteit een negatief eff...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-Chlorotrityl resin	Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide	GL Biochem	00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate	GL Biochem	00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propaan] dihydrochloride	J&K Scientific	503236
4G2-antilichaam	Thermo	MA5-24387
4-mercaptofenylacetzuur	Alfa Aesar	H27658
96-wells microtiterplates	NEST	701001
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
AgOAc	Sinopharm Chemical Reagent	30164324
anti-GST-antilichaam	Abclonal	AE001
Anti-mouse IgG, HRP-gekoppeld Antilichaam	Cell Signaling Technology	7076P2
BSA	Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer	Applied Photophysics Ltd
Dialysezak	Sbjbio	SBJ132636
Dichloormethaan	Sinopharm Chemical Reagent	80047360
Diethylether	Sinopharm Chemical Reagent	10009318
DNA Gel Extraction Kit	Beyotime	D0056
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
GSH Sepharose	GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride	Sinopharm Chemical Reagent	30095516
Hydrazine hydraat	Sinopharm Chemical Reagent	80070418
Zoutzuur	Sinopharm Chemical Reagent	10011018
Imidazol	SIGMA	12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside	SIGMA	5502-5G
Kanamycin	Beyotime	ST101
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine	GL Biochem	90600
N, N-Dimethylformamide	Sinopharm Chemical Reagent	8100771933
NcoI	Thermo	ER0571
PBS-buffer	Solarbio	P1022
Peptide BEH C18 Column	Waters	186003625
Piperidine	Sinopharm Chemical Reagent	80104216
Plasmid Extraction Kit	Sangon Biotech	B611253-0002
QIAexpress Kit	QIAGEN	32149
Rapid DNA Ligation Kit	Beyotime	D7002
Natriumdiwaterstoffosfaat dihydraat	Sinopharm Chemical Reagent	20040718
Natriumhydroxide	Sinopharm Chemical Reagent	10019762
Natriumnitriet	Sinopharm Chemical Reagent	10020018
natrium chloride	Sinopharm Chemical Reagent	10019318
Standard Fmoc-beschermde aminozuren	GL Biochem
steriele pot	Tomy	SX-700
SUMO Protease	Thermo Fisher	12588018
stopoplossing	Biolegend	423001
de volledige gensequentie die SUMO-linker-antigeen kan uitdrukken	Taihe Biotechnology Compay
TMB-reagens	Biolegend	421101
Trifluorazijnzuur	SIGMA	T6508
Triisopropylsilaan	GL Biochem	91100
Tris(2-carboxyethyl)fosfine hydrochloride	Aladdin	T107252-5g
Trypton	OXOID	LP0042
Tween 20	Solarbio	T8220
Ultimate 3000 HPLC	Thermo
vacuümpomp	YUHUA	SHZ-95B
XhoI	Thermo	IVGN0086
Gistextract	OXOID	LP0021