Hier is een elektroporation methode voor plasmide DNA levering en ependymoglial cellabeling in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol is een snelle en efficiënte methode om individuele ependymoglial cellen te visualiseren en te traceren en opent nieuwe mogelijkheden om elektroporation toe te passen op een breed scala aan genetische manipulaties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Elektroporation methode voor in vivo levering van plasmide DNA in de volwassen zebravis Telencephalon
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Elektroporation is een transfectie methode waarbij een elektrisch veld wordt toegepast op cellen om tijdelijke poriën in een celmembraan te creëren en de permeabiliteit ervan te vergroten, waardoor verschillende moleculen in de cel kunnen worden geïntroduceerd. In dit document wordt elektroporation gebruikt voor het introduceren van plasmiden aan ependymoglial cellen, die de ventriculaire zone van de volwassen zebravis telencephalon lijn. Een fractie van deze cellen toont stamcel eigenschappen en genereert nieuwe neuronen in de hersenen van de zebravis; Daarom is het bestuderen van hun gedrag essentieel om hun rol in neurogenese en regeneratie te bepalen. De introductie van plasmiden via electroporatie maakt lange termijn labeling en tracking van een enkele ependymoglial cel mogelijk. Bovendien kunnen plasmiden zoals CRE of of Cas9 worden geleverd aan enkelvoudige ependymoglial cellen, die genrecombinatie of genbewerking mogelijk maken en een unieke kans bieden om de autonome genfunctie van de cel te beoordelen in een gecontroleerde, natuurlijke Milieu. Ten slotte wordt dit gedetailleerde, stapsgewijze electroporatie protocol gebruikt om een succesvolle introductie van plasmiden tot een groot aantal enkelvoudige ependymoglial cellen te verkrijgen.
Inleiding
Zebravis zijn uitstekende diermodellen om hersen regeneratie na een steekwond letsel te onderzoeken. In vergelijking met zoogdieren, op de evolutionaire ladder, minder geëvolueerde soorten zoals zebravis in het algemeen vertonen hogere tarieven van constitutieve neurogenese en bredere gebieden van volwassen neurale stamcellen residentie, wat leidt tot constante generatie van nieuwe neuronen in de hele de meeste hersengebieden in het volwassen leven. Deze functie lijkt te correleren met significant hogere regeneratieve capaciteit van zebravis in vergelijking met zoogdieren1, als zebravis hebben opmerkelijk potentieel om efficiënt te genereren ni....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren die in dit protocol worden gebruikt, zijn onder standaardomstandigheden gehouden en experimenten zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften van de EU en de regering van Opper-Beieren (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. bereiding van het plasmide mengsel voor Elektroporation
- Verdun de interesse van de plas smid in steriel water en voeg een snelle groene vlek voorraadoplossing [1 mg/mL] toe. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van het plasmide ∼ 1 μg/μL is. Voeg de vlek toe met een concentratie van niet meer dan 3%, omdat het enige doel is om de oplossing te kleuren en de ventriculaire injectie te visuali....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De beschreven elektroporation methode maakt de levering van plasmide DNA in ependymoglial cellen, die zich oppervlakkig bevinden in de zebravis telencephalon en net onder de dorsale Ependymale cellaag (Figuur 1a).
Als het resultaat van de elektroporation positief is, kan het label enkelvoudige ependymoglial cellen (rode cellen in Figuur 2a, b) worden waargenomen onder andere ependym.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit electroporatie protocol is een betrouwbare in vivo methode voor het labelen van individuele ependymoglial cellen. Het protocol moet mogelijk een verdere aanpassing voor het labelen van andere celtypen zoals neuronen of oligodendrocyten. Om tot een succesvolle etikettering te komen, kunnen plasmiden met verschillende promotors worden gebruikt. De promotor van Chicken-Beta actine, eF1alpha, CMV en ubiquitine zijn eerder gebruikt om de expressie van verschillende transgenen in ependymoglia en hun nakomelingen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Speciale dank aan James Copti voor het bewerken van het manuscript. We erkennen ook dankbaar financiering aan JN van de Duitse Research Foundation (DFG) door de SFB 870 en SPP "integratieve analyse van olfaction" en SPP 1738 "opkomende rollen van niet-coderende Rna's in de ontwikkeling van het zenuwstelsel, plasticiteit & ziekte", SPP1757 " Glial heterogeniteit "en Excellence strategie in het kader van de Munich cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens/Materiaal | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | Voor het kleuren van plasmide oplossing |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 moet worden bewaard bij RT (maximaal twee weken) en beschermd worden tegen licht |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Elektrode Gel |
| Apparatuur | |||
| Luchtpomp | TetraTec APS 50, 10l-60l | Kan worden gekocht in de dierenwinkels | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporatie apparaat | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injectieapparaat | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standaard Wand Borosilicaat Glas Capillaire | Warner Instruments | 64-0766 | Model Nr: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-mes | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Naaldhouder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Naaldhouder wordt geleverd samen met het injectieapparaat |
| Naaldtrekhaalapparaat | Narishige Japan | Model Nr: PC-10 | De PC-10 is stopgezet door Narishige in 2017 en vervangen door de PC-100 |
| Petrischalen | Greiner Bio-One International | 633161 |
Referenties
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
