Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

7.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60083

⸱

17 maart 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Graft-versus-host ziekte is een belangrijke complicatie na allogene beenmergtransplantatie. Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van graft-versus-host ziekte. Het huidige artikel beschrijft een nieuw beenmergtransplantatieplatform om de rol van dendritische cellen te onderzoeken bij de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect.

Samenvatting

Allogene beenmergtransplantatie (BMT) is een effectieve therapie voor hematologische maligniteiten als gevolg van het graft-versus-leukemieeffect om tumoren uit te roeien. De toepassing ervan wordt echter beperkt door de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte (GVHD), een belangrijke complicatie van BMT. GVHD wordt opgeroepen wanneer T-cellen in de donorgrafts alloantigeen herkennen, uitgedrukt door ontvangende cellen en ongewenste immunologische aanvallen op gezonde weefsels van de ontvanger oppakken. Zo zijn traditionele therapieën ontworpen om donor T-cel alloreactiviteit te onderdrukken. Deze benaderingen tasten echter het GVL-effect aanzienlijk aan, zodat het voortbestaan van de ontvanger niet wordt verbeterd. Inzicht in de effecten van therapeutische benaderingen op BMT, GVL en GVHD, is dus essentieel. Vanwege de antigeen-presenterende en cytokine-afscheidingscapaciteit om donor T-cellen te stimuleren, spelen de ontvanger dendritische cellen (DC's) een belangrijke rol bij de inductie van GVHD. Daarom wordt targeting ontvanger DC's een potentiële aanpak voor het beheersen van GVHD. Dit werk geeft een beschrijving van een nieuw BMT-platform om te onderzoeken hoe host DC's gvh- en GVL-reacties na transplantatie reguleren. Ook gepresenteerd is een effectief BMT model om de biologie van GVHD en GVL studie na transplantatie.

Inleiding

Allogene hematopoietische stamceltransplantatie (BMT) is een effectieve therapie voor de behandeling van hematologische maligniteiten1,2 door middel van het graft-versus-leukemieeffect (GVL)effect 3. Donorlymfocyten voeren echter altijd ongewenste immunologische aanvallen op ontvangende weefsels op, een proces dat graft-versus-host disease (GVHD) wordt genoemd4.

Murine modellen van GVHD zijn een effectief instrument om de biologie van GVHD en de GVL respons5te bestuderen. Muizen zijn een kosteneffectief onderzoeksdiermodel. Ze zijn klein en efficiënt gedoseerd met moleculen en biologische in de vroege fasen van de ontwikkeling6. Muizen zijn ideale onderzoeksdieren voor genetische manipulatiestudies omdat ze genetisch goed gedefinieerd zijn, wat ideaal is voor het bestuderen van biologische paden en mechanismen6. Verschillende muis grote histocompatibiliteit complex (MHC) MHC-mismatched modellen van GVHD zijn goed ingeburgerd, zoals C57BL/6 (H2b) naar BALB/c (H2d) en FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Dit zijn bijzonder waardevolle modellen om de rol van individuele celtypen, genen en factoren te bepalen die GVHD beïnvloeden. Transplantatie van C57/BL/6 (H2b) ouderdonoren naar ontvangers met mutaties in MHC I (B6.C-H2bm1) en/of MHC II (B6.C-H2bm12) heeft aangetoond dat een mismatch in zowel MHC klasse I als klasse II een belangrijke vereiste is voor de ontwikkeling van acute GVHD. Dit suggereert dat zowel CD4+ als CD8+ T-cellen nodig zijn voor ziekteontwikkeling7,8. GVHD is ook betrokken bij een ontstekingscascade die bekend staat als de 'pro-inflammatoire cytokinestorm'9. De meest voorkomende conditioneringsmethode in murinemodellen is totale lichaamsbestraling (TBI) door röntgenfoto's of 137Cs. Dit leidt tot de beenmergablatie van de ontvanger, waardoor donorstamcelen engraftment mogelijk zijn en voorkomen dat het transplantaat wordt afgekeurd. Dit wordt gedaan door het beperken van de proliferatie van ontvanger T-cellen in reactie op donorcellen. Bovendien spelen genetische verschillen een belangrijke rol bij ziekte-inductie, die ook afhangt van kleine MHC-mismatch10. Daarom varieert de myeloablative bestralingsdosis bij verschillende muizenstammen (bijvoorbeeld BALB/c→C57BL/6).

Activering van donor-T-cellen door gastheerantigeen presenterencellen (APC's) is essentieel voor gvhd-ontwikkeling. Onder de APC's zijn dendritische cellen (DC's) het meest krachtig. Ze zijn erfelijk in staat om GVHD te induceren vanwege hun superieure antigeenopname, expressie van T-cel co-stimulerende moleculen, en de productie van pro-inflammatoire cytokinen die T-cellen polariseren in pathogene subgroepen. Ontvanger DC's zijn van cruciaal belang voor het vergemakkelijken van T-cel priming en GVHD-inductie na transplantatie11,12. Daarom zijn DC's interessante doelwitten geworden bij de behandeling van GVHD12.

TBI is nodig om de donorcel engraftment te verbeteren. Als gevolg van het TBI-effect worden ontvangende DC's geactiveerd en overleven gedurende een korte tijd na de transplantatie12. Ondanks de grote vooruitgang in het gebruik van bioluminescentie of fluorescentie, is het nog steeds een uitdaging om een effectief model vast te stellen om de rol van ontvanger-DC's in GVHD te bestuderen.

Omdat donor T-cellen zijn de drijvende kracht voor GVL activiteit, behandeling strategieën met behulp van immunosuppressieve geneesmiddelen zoals steroïden te onderdrukken T-cel alloreactivity veroorzaken vaak tumor terugval of infectie13. Daarom kunnen targeting van ontvanger DC's een alternatieve aanpak bieden voor de behandeling van GVHD met behoud van het GVL-effect en het voorkomen van infectie.

Kortom, de huidige studie biedt een platform om te begrijpen hoe verschillende soorten signalering in ontvanger DC's gvhd-ontwikkeling en het GVL-effect na BMT reguleert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimentele procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Central Florida.

1. GVHD-inductie

OPMERKING: Allogene beenmerg (BM) celtransplantatie (stap 1.2) wordt uitgevoerd binnen 24 uur na bestraling. Alle onderstaande procedures worden uitgevoerd in een steriele omgeving. Voer de procedure uit in een weefselkweekkap en gebruik gefilterde reagentia.

  1. Dag 0: Bereid de ontvangende muizen voor.
    1. Gebruik vrouwelijke wilde typemuizen (WT) op een BALB/c achtergrond (CD45.2+ H2kd+),10−12 weken oud als ontvangers.
    2. Ear-tag en weeg de ontvangers vóór TBI. Plaats vervolgens maximaal 11 muizen in de bestralingskamer en bewaar het in de bestralings. Bestraal bij een enkele dosis van 700 cGy gedurende 10−15 min.
    3. Breng bestraalde dieren terug naar de kooien en huisvest ze vóór de transplantatie in pathogene-vrije faciliteiten.
      OPMERKING: Het minimale lichaamsgewicht van de ontvangers moet rond de 20 g liggen. Gebruik dit gewicht als referentie om het gewichtsverlies tijdens de experimentele periode te berekenen.
  2. Dag 1: Bereid T-cel uitgeput beenmerg (TCD-BM) van de donormuizen.
    1. Euthanaseer CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 muizen door CO2 verstikking en wacht 2−3 min tot ze bewusteloos zijn. Voer indien nodig cervicale dislocatie uit als secundaire euthanasie.
    2. Leg elke muis op een schone werkplaat. Ontsmet de vacht en de huid met 70% isopropanol.
    3. Verzamel het scheenbeen en dijbeen van beide benen met behulp van tangen en scharen. Zet ze in ijskoude RPMI met 1% FCS en 100 U/mL penicilline/streptomycine en 2 mM L-glutamine (1% RPMI) in conische buizen van 50 mL. Reinig het dijbeen en het scheenbeen botten grondig door het verwijderen van alle spierweefsels met behulp van tangen en schaar. Breng het dijbeen en het scheenbeen van de conische buizen van 50 mL over naar een petrischaal met een diameter van 92 mm met 1% RPMI.
    4. Snijd met behulp van een schaar de uiteinden van het dijbeen of scheenbeen. Vul een 50 mL buis met 25 mL van 1% RPMI 1640 medium. Gebruik dit om een 3 mL spuit te vullen die aan een 26 G naald met 3 mL van 1% RPMI is bevestigd. Steek deze spuit in het bot en duw de zuiger om het beenmerg (BM) uit de holte in de opvangbuis te spoelen met 1% RPMI (~ 3 mL/bone).
    5. Herhaal stap 1.2.4 voor alle resterende scheenbeen- en dijbeenbotten van andere donormuizen. Houd alle inzamelbuizen op ijs.
    6. Maak de eencellige suspensie door de stukjes beenmerg door een mesh-strainer van 75 μm te spoelen. Verzamel de eencellige suspensie in een buis van 50 mL.
    7. Centrifugebuizen bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Aanzuigen en gooi de supernatant. De pellet opnieuw opschorten in PBS-buffer met 0,5% runderserumalbumine (BSA) bij 20 x 106 cellen/mL. Sla een aliquot van 2 x 106 cellen voor zuiverheid vlekken.
    8. Voeg Thy 1-antilichaam toe bij 0,05 μg/106 cellen14 en uitbroed gedurende 30 min bij 4 °C. Was één keer met 25 mL ijskoude PBS. Resuspend op 20 x 106/mL in 0,5% BSA/10% young rabbit complement/2% DNase (10.000 U/mL in steriele H2O). Incubeer gedurende 45 min bij 37 °C en was 2x als voorheen.
      OPMERKING: T-cellen zijn uitgeput met behulp van een mAb specifiek voor Thy1, een eiwit uitgedrukt door alle T-cellen, maar niet andere leukocyten.
    9. De cellen opnieuw opschorten in 20 mL PBS-buffer met 0,5% BSA. Tel de beenmergcellen in 1% azijnzuur met behulp van een hemocytometer. Houd een aliquot van 2 x 106 cellen voor een zuiverheidscontrole door stroomcytometrie na celzuivering.
      LET OP: Een donormuis genereert normaal gesproken ongeveer 25 x 106 TCD-BM.
    10. Gebruik flow cytometrie om een succesvolle T-cel uitputting te bevestigen. Vlek 1 x 106 cellen, bewaard gebleven uit de stappen 1.2.7 (vóór T-celuitputting) en 1.2.9 (TCD-BM na T-celuitputting) met de volgende antilichamen: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) en α-CD8α (53-6.7).
  3. Dag 1: T-cellen voorbereiden op de donormuizen
    1. Gebruik CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 wild type (WT) muizen als donor voor T-cellen.
    2. Euthanaseer C57BL/6 muizen door koolstofdioxide (CO2)verstikking zoals beschreven in punt 1.2.1.
    3. Reinig de vacht en huid van de muis grondig met 70% ethanol. Accijnzen en lymfeklieren en scheiden ze in een eencellige suspensie van splenocyten met behulp van een spuitzuiger en 40 μm mesh strainers. Was de zeef en spuitzuiger met 1% RPMI (1% FBS met RPMI media) om alle splenocyten te verzamelen.
    4. Centrifugeer de celvering op 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Voeg 5 mL ACK lysing buffer (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) toe na het weggooien van de supernatant. Incubeer de celvering gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
      LET OP: ACK lysis buffer wordt gebruikt voor lysing rode bloedcellen.
    5. Voeg 5 mL van 1% RPMI toe om lysis te stoppen. Centrifugebij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
    6. Bereid een ice-cold magnetic-activated cell sorting (MACS) buffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH 7.2). Ontgassen de buffer voor gebruik. Breter de celpellets opnieuw in 5 mL MACS-buffer.
    7. Tel de splenocyten en controleer op de levende en dode cellen met behulp van een hemocytometer en 1% trypan blauw. Sla een aliquot van 2 x 106 cellen op om de zuiveringsopbrengst te evalueren met stroomcytometrieanalyse.
    8. Resuspend de splenocyten bij de concentratie van 200 x 106/mL in MACS buffer. Voeg 0,03 μL biotine anti-muis-Ter-119, 0,03 μL biotine anti-muis-CD11b, 0,03 μL biotine anti-muis-CD45R en 0,03 μL biotine anti-muis-DX5 per 106 cellen toe. Incubeer gedurende 15 min bij 4 °C.
      OPMERKING: Biotine anti-muis-Ter-119, biotine anti-muis-CD11b, biotine anti-muis-CD45R en biotine anti-muis-DX5 werden gebruikt om te reageren met respectievelijk erythroid, granulocyten, B-cellen en NK-cellen. Daarom zijn deze celsubsets uitgeput in volgende stap15.
    9. Voeg 10 mL ijskoude MACS-buffer toe aan de celvering. Centrifugebij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
    10. De celpellets in de MACS-buffer opnieuw opschorten bij6een concentratie van 100 x 10 6/mL. Voeg antibiotine microbeads (0,22 μL/106 cellen) toe aan de splenocytesssus. Meng goed en incubeer voor nog eens 15 min bij 4 °C. Was de celvering eenmaal met 10 mL ijskoude MACS-buffer. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C en gooi de supernatant weg.
    11. Zet een magnetische scheidingskolom in het magnetisch veld. Spoel de kolom af met een MACS-buffer van 3 mL. Laat de celvering op de kolom vallen. Verzamel de doorstroom bestaande uit ongebonden, verrijkte T-cellen, in een nieuwe conische buis van 15 mL. Was de MS-kolom met 3 mL ijskoude MACS-buffer.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de kolom leeg is voordat u de waspassen uitvoert.
    12. Centrifugeer de celvering op 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Breter de celpellet opnieuw in 5 mL MACS-buffer.
    13. Tel de cellen in 1% trypan blauw met behulp van een hemocytometer. Sla een aliquot van 2 x 106 cellen voor een zuiverheid smet per stroom cytometrie.
      OPMERKING: De gemiddelde opbrengst van milt-T-cellen geïsoleerd door deze methode is ~ 20−25 x 106 cellen per muis.
    14. Bevestig de opbrengst van T-celverrijking door stroomcytometrie. Vlek 1 x 106 cellen, bewaard gebleven uit de stappen 1.3.7 (vóór T-celuitputting) en 1.3.13 (TCD-BM na T-celuitputting), met de volgende antilichamen: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) en α-CD8α (53-6.7).
  4. Dag 1: Injecteer bestraalde muizen met donor T-cellen en TCD-BM.
    1. Was de TCD-BM en T-cellen 2x met PBS (800 x g voor 5 min bij 4 °C). Schorsde de cellen in ijskoude PBS voor injectie. Pas de celconcentratie aan op620 x 10 6/mL voor TCD BM en 4 x 106/mLvoor T-cellen.
    2. Verwarm het dier met behulp van een verwarmingslamp om de zichtbaarheid van de bilaterale staartaderen te vergroten. Plaats de muis indien nodig in een restrainer.
    3. Reinig het oppervlak van de staart met 70% isopropanol. Injecteer TCD-BM (5 x 106 cellen/muis) met of zonder T-cellen (0,75 x 106 cellen/muis). Zorg ervoor dat er geen lucht in de spuit wordt gebracht.
    4. Verwijder de naald en breng een antiseptisch wattenstaafje rechtstreeks op de injectieplaats 5−10 s om het bloeden te stoppen.
  5. Beoordeel GVHD op dag 2−80.
    1. Blijf op de hoogte van het overleven van het dier. Controleer de klinische symptomen van GVHD aangepast van het scoresysteem dat eerder door Cook et al.16 en het lichaamsgewicht van de ontvangende muizen 2x per week is vastgesteld. Gebruik het lichaamsgewicht bepaald voorafgaand aan de TBI om het gewichtsverlies te berekenen.
    2. Weeg elke muis afzonderlijk. Scoor het gewichtsverlies als volgt: graad 0 = minder dan 10%; graad 1 = 10%−20%; graad 2 = meer dan 20%.
    3. Scoor het houdingsteken van de ontvangers: graad 0 = geen voorgevoel; graad 0,5 = lichte voorgevoel, maar rechtmaakt tijdens het lopen; graad 1 = dier blijft gebogen tijdens het lopen; graad 1.5 = het dier wordt niet rechtgetrokken; graad 2.0 = dierenstandaard op achterste tenen.
    4. Scoor het mobiliteitsteken van de ontvangers: graad 0 = zeer actief; graad 0,5 = langzamer dan naïeve muizen; graad 1.0 = beweegt alleen wanneer gepord; graad 1.5 = beweegt lichtjes wanneer gepord; graad 2.0 = beweegt niet wanneer gepord.
    5. Scoor de huid van de ontvangers: graad 0 = geen schaafwonden, laesies of schaling; graad 0,5 = roodheid in één specifiek gebied; graad 1 = slijtage in één gebied of lichte slijtage in twee gebieden; graad 1.5 = ernstige schaafwonden op twee of meer gebieden; graad 2.0 = ernstige schaafwonden, krakende huid, gedroogd bloed.
    6. Scoor de vacht van de ontvangers: graad 0 = geen abnormale tekenen; graad 0,5 = ridging aan de zijkant van buik of nek, rang 1.0 = ridging over of de zijkant van buik en nek; graad 1.5 = onverzorgd gematteerd en gegolfd bont; graad 2.0 = slecht gematteerd bont op buik en rug.
    7. Scoor de diarree van de ontvangers: graad 0 = geen diarree; graad 0,5 = lichte en zachte ontlasting; graad 1.0 = mild (gele ontlasting); graad 1,5 = matig (gele ontlasting met een beetje bloed); graad 2 = ernstig (lichtgele en bloederige ontlasting, "gedroogde cake ontlasting" verschijnen op het anale gebied).

2. Cotransplantatie Model

  1. Genereer door beenmerg afkomstige dendritische cellen (BM-DC's).
    1. Oleer beenmerg van de femurs en tibias van WT of factor B (fB)-/- muizen op de B6-achtergrond zoals beschreven in de stappen 1.2.3−1.2.4. Draai de cellen op 800 x g voor 5 min.
    2. Resuspend de pellet in 5 mL van ACK lysing buffer voor rode bloedcel lyse. Incubeer de celvering voor 5 min op ijs. Voeg 10 mL rpmi toe aan de celvering om de lyse en centrifuge op 800 x g voor 5 min bij 4 °C te stoppen. Gooi de supernatant weg.
    3. Resuspend de celpellets in 10 mL kweekmedia (RPMI 1460 met 10% FBS, 100 U/mL penicilline/streptomycine, 2 mM l-glutamine en 50 mM β-mercaptoethanol) en pas het volume aan om aan de eindconcentratie van 2 x 106 cellen/mL te voldoen.
    4. Voeg 20 ng/mL granulocyte-macrofaagkoloniestimulerende factor (GM-CSF) toe aan de celvering. Kweek de beenmergcellen in 100 x 15 mm Petrischalen bij 37 °C in 5% CO2 gedurende 6 dagen.
    5. Vervang de helft van de lopende cultuurmedia (ongeveer 5 mL) door verse media die 40 ng/mL GM-CSF bevatten op dag 3.
    6. Verwarm de kweekmedia voor in een waterbad bij 37 °C. Verzamel ongeveer 5 mL van de media uit de beenmergkweekgerechten. Centrifugebij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg. Resuspend de cel pellet in 5 mL cultuur media met 40 ng / mL GM-CSF.
    7. Voeg 25 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) toe aan de media op dag 6 van de cultuur om de BM-DC's te rijpen. Sla een aliquot van 2 x 106 cellen op om de dc-differentiatiewerkzaamheid per flow cytometrie te bepalen.
    8. Verzamel gerijpte BM-DC's: Gebruik cellifters om dc's zacht uit de petrischaaltjes te schrapen. Verzamel alle celveringen in conische buizen van 50 mL. Centrifuge bij 800 x g, gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg. Was de celpellets 3x met 50 mL ijskoude PBS. Bespaar ongeveer 2 x 106 BM-DC's voor immunologische fenotypeanalyse door stroomcytometrie.
  2. Voer dendritische celcotransplantatie uit van BMT (DC-cotransplanting BMT).
    OPMERKING: Gebruik FVB (H2kq)muizen als donoren voor T-cellen en BM-cellen. Bestraal B6 Ly5.1 ontvanger muizen bij een dosis van 1.100 cGy (2 doses, 3 h interval). Zie details in stap 1.1.
    1. Isoleer BM van femurs en tibias van de FVB donormuizen. Zie details in de stappen 1.2.3−1.2.10.
      OPMERKING: Gebruik totaal geïsoleerd beenmerg in plaats van TCD-BM in dit model.
    2. Zuiver T-cellen uit de milt en lymfeklieren van de FVB donormuizen. Zie details in de stappen 1.3.1-1.3.13.
    3. Injecteer BM (5 x 106/mouse), T-cellen (0,5 x 106/muis) met BM-DC's (2 x 106/muis) op dag 0 van de experimentele cursus.
    4. Op dag 3 na de transplantatie, onderzoeken van de donor DC reconstitutie door flow cytometrie.
      1. Verzamel bloed uit de ogen van de ontvangers.
      2. Verdoven de CD45.1/Ly5.1 B6 muizen met 3% isoflurane inademing. Controleer op de diepte van anesthesie door het gebrek aan reactie op een teen knijpen.
      3. Plaats een steriele glazen pipetbuis in de mediale canthus van het oog dat caudally gericht is in een hoek van 30−45° vanuit het vlak van de neus. Druk uitoefenen terwijl u de buis zachtjes draait.
      4. Laat het bloed in een 10 μL heparine-bevattende steriele 1,5 mL microcentrifuge buizen. Breng 50 μL bloed over in 5 mL glazen stroombuizen.
      5. Voeg 2 mL ACK lysing buffer toe. Incubeer bij 37 °C in het waterbad gedurende 45 min. Voeg 2 mL FACS kleuringsbuffer toe. Centrifugebij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
      6. Schorsde de celpellets met 200 μL FACS-buffer met de juiste stroomvlekkende antilichamen (levend/doodgeel, α-H-2Kb, α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c en α-MHCII). Incubeer gedurende 15 min bij 4 °C in het donker. Was 2x met 1 mL FACS buffer. De celpellets opnieuw opschorten in 200 μL FACS-buffer en de analyse uitvoeren door stroomcytometrie.

3. GVHD/GVL Modellen van BMT

  1. Voer GVHD/GVL inductie uit.
    1. Cultuur de luciferase transduced A20 B cel lymfoom in RPMI cultuur media.
    2. Bestraal BALB/c achtergrond WT of Ly5.1 ontvanger bij 700 cGy (enkele dosis). Zie details in stap 1.1.
    3. Isoleer TCD-BM van de femurs en tibias van B6. Ly5.1 donormuizen. Zie details in de stappen 1.2.1−1.2.10.
    4. Zuiver T-cellen uit milten en lymfeklieren van de C57BL/6 donormuizen. Zie details in de stappen 1.3.1−1.3.15.
    5. Was de A20 lymfoom 2x met 25 mL PBS. Resuspend de celpellets in 10 mL ijskoude PBS. Neem een celvering aliquot (10 μL) en tel de cellen met behulp van 1% trypan blauw en een hemocytometer. Pas de celconcentratie aan op 20.000 cellen/mL.
    6. Injecteer TCD-BM (5 x 106/muis) met of zonder T-cellen (0,75 x 106/muis) en A20 lymfoom (5.000 cellen/muis).
    7. Follow-up op de ontvanger overleven, GVHD klinische symptomen, en gewichtsverlies tijdens de experimentele cursus. Zie details in stap 1.5.
  2. Voer bioluminescente beeldvorming uit.
    1. Monitor de tumorgroei bij de getransplanteerde ontvanger door de ontvangende muizen te injecteren met 4 mg D-luciferine. Incubeer 5 min om ervoor te zorgen dat Luciferin reageert met luciferase.
    2. Verdoven de muis met behulp van 3% isoflurane in de kamer van een bioluminescentie imager en beeld de ontvangers voor 5 min in veld D en de belichtingstijd van 1 min.
    3. Analyseer gegevens met behulp van beeldanalysesoftware. Wijzig de schaal van de pseudo-kleurenafbeeldingen voor de beste resultaten.
      OPMERKING: Alle foto's moeten op dezelfde schaal zijn in experimenten.
    4. Gebruik de beeldanalyserende software om de interessegebieden te bepalen en de signaaldichtheid te kwantificeren door de flux (fotonen/s) te berekenen die uit elke interessegebied wordt uitgezonden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het grote B6-model (H2kbb)-BALB/C (H2kd)kwam na de transplantatie nauw overeen met de ontwikkeling van GVHD(figuur 2). Alle zes gvhd klinische symptomen die eerder door Cooke et al.16 werden vastgesteld, kwamen voor bij de ontvangers die met WT-B6 T-cellen werden getransplanteerd, maar niet bij de ontvangers die alleen met BM werden getransplanteerd (stap 1.5), die de GVHD-negatieve groep vertegenwoordigden. Er zi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gebruik van stamcellen voor een bepaald individu is een effectieve aanpak voor de behandeling van gevorderde en resistente kankers18. Kleine molecuul geneesmiddelen, echter, zijn lang gebleven een primaire focus van gepersonaliseerde kankertherapie. Anderzijds kan in cellulaire therapie een veelheid aan interacties tussen donor en gastheer de behandelingsresultaten, zoals de ontwikkeling van GVHD na BMT1,beslissend beïnvloeden.

Grote MHC-niet...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Deze studie wordt ondersteund door de Universiteit van Central Florida College of Medicine start-up subsidie (aan HN), de Universiteit van Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center start-up subsidie (hl), de Verenigde Staten NIH Grant #1P20CA210300-01 en Vietnamese Ministerie van Gezondheid Grant #4694 / QD-BYT (naar PTH). Wij danken Dr Xue-zhong Yu aan de Medische Universiteit van South Carolina voor het verstrekken van materialen voor de studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA pH 8.0 100MLFisher ScientificBP2482100MACS buffer
10X PBSFisher ScientificBP3994MACS buffer
A20 B-cell lymphomaUniversity of Central FloridaIn houseGVL experiment
ACC1 fl/flJackson Lab30954GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4creUniversity of Central FloridaGVL experiment
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-485T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific13-0452-85T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITCThermo Fisher Scientific10452-85Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700Thermo Fisher Scientific117319Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PEThermo Fisher Scientific12-0251-82Flow staining
Anti-Mouse CD4 BiotinThermo Fisher Scientific13-0041-86T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement)Thermo Fisher Scientific48-0042-82Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PEThermo Fisher Scientific12-0900-83Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APCThermo Fisher Scientific17-0081-83Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710Thermo Fisher Scientific46-5958-82Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APCThermo Fisher Scientific17-5320-82Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 BiotinThermo Fisher Scientific13-5921-85T-cell enrichment
Anti-Thy1.2Bio ExcelBE0066BM generation
B6 fB-/- miceUniversity of Central FloridaIn houseRecipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) miceCharles River564Donors
BALB/c miceCharles River028Transplant recipients
C57BL/6 miceCharles River027Donors/Recipients
CD11bThermo Fisher Scientific13-0112-85T-cell enrichment
CD25-biotinThermo Fisher Scientific13-0251-82T-cell enrichment
CD45RThermo Fisher Scientific13-0452-82T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotinThermo Fisher Scientific13-5971-82T-cell enrichment
Cell strainer 40 uMThermo Fisher Scientific22363547Cell preparation
Cell strainer 70 uMThermo Fisher Scientific22363548Cell preparation
D-LuciferinGoldbioLUCK-1GLive animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta Bilogicals R&D systemD17051Cell Culture
Flow cytometry tubesFisher Scientific352008Flow cytometry analysis
FVB/NCrlCharles River207Donors
Lipopolysacharide (LPS)Millipore SigmaL4391-1MGDC mature
LS columnMitenyi Biotec130-042-401Cell preparation
MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubatorEppendorfGalaxy 170 RCell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)GIBCO15140Media
RPMI 1640Thermo Fisher Scienctific11875-093Media
TER119Thermo Fisher Scientific13-5921-82T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200Perkin ElmerXenogen IVIS-200Live animal imaging
X-RAD 320 Biological IrradiatorPrecision X-RAYX-RAD 320Total Body Irradiation

Referenties

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006(2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417(2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Graft-versus-leukemie-effectT-celdepletiescheiding met magnetische beadsdendritische cellen uit het beenmergFactor B-knock-outMHC-mismatched modelluciferase-getransduceerde A20
Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.