Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

Samenvatting

Hier wordt een gedetailleerde methode beschreven die de zuivering, refolding en karakterisering van zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes (Sapn's) beschrijft voor gebruik bij de ontwikkeling van vaccins.

Samenvatting

Zelfmondende eiwit nanodeeltjes (Sapn's) functioneren als repetitieve antigeen displays en kunnen worden gebruikt om een breed scala aan vaccins voor verschillende infectieziekten te ontwikkelen. In dit artikel laten we een methode zien om een SAPN-kern te produceren met een Six-Helix Bundle (SHB)-assemblage die in staat is om antigenen in een trimere conformatie te presenteren. We beschrijven de uitdrukking van de SHB-SAPN in een E. coli -systeem, evenals de nodige stappen voor het zuiveren van eiwitten. We hebben een isopropanol Wash-stap opgenomen om de resterende bacteriële lipopolysaccharide te verminderen. Als indicatie van de eiwit identiteit en-zuiverheid reageerde het eiwit met bekende monoklonale antilichamen in Western Blot-analyses. Na het revouwen viel de grootte van de deeltjes in het verwachte bereik (20 tot 100 nm), wat werd bevestigd door Dynamische lichtverstrooiing, nanodeeltjes-traceer analyse en transmissie elektronenmicroscopie. De hier beschreven methodologie is geoptimaliseerd voor de SHB-SAPN, echter, met slechts lichte wijzigingen kan worden toegepast op andere SAPN constructies. Deze methode is ook gemakkelijk overdraagbaar naar grootschalige productie voor GMP-productie voor menselijke vaccins.

Inleiding

Terwijl de traditionele vaccin ontwikkeling gericht is op de geïnactiveerde of verzwakte pathogenen, is de focus van moderne vaccins verschoven naar subeenheid vaccins¹. Deze aanpak kan leiden tot een gerichter antwoord en mogelijk meer werkzame vaccin kandidaten. Een van de grootste nadelen is echter dat subeenheid vaccins geen deeltjes zijn zoals hele organismen die kunnen resulteren in verminderde immunogeniciteit². Een nano artikel als repetitief antigeen display systeem kan zowel de voordelen van de beoogde subeenheid vaccin benadering als de deeltjes aard van het hele organisme^1,3hebben.

Onder de bestaande soorten nanovaccines, rationeel ontworpen eiwit assemblages zorgen voor het ontwerp en de ontwikkeling van vaccin kandidaten die meerdere kopieën van het antigeen potentieel in een inheemse-achtige conformatie kan presenteren^{1,4 ,5,6}. Een voorbeeld van deze eiwit assemblages zijn de zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes (SAPNs)⁷. Sapn's zijn gebaseerd op gekrulde spoel domeinen en worden traditioneel uitgedrukt in Escherichia coli⁸. SAPN-vaccin kandidaten zijn ontwikkeld voor een verscheidenheid aan ziekten zoals malaria, SARS, influenza, toxoplasmose en HIV-1^{9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19}. het ontwerp van elke SAPN-kandidaat is specifiek voor het pathogeen van belang, maar de productie-, zuiverings-en hervouw technieken zijn doorgaans algemeen toepasbaar.

Een van onze huidige interesses is een effectief HIV-1-vaccin. In RV144 — de enige fase III klinische studie van een HIV-1-vaccin dat een bescheiden werkzaamheid vertoonde — was het verminderde risico op infectie gecorreleerd met IgG-antilichamen tegen de V1V2-lus van de envelop eiwitten^20,21. De inheemse-achtige trimeric presentatie van deze regio wordt beschouwd als belangrijk voor de beschermende immunogeniciteit²². Om de V1V2-lus in zo dicht mogelijk bij inheems-achtige conformatie te presenteren, ontwikkelden we een bewijs van principe SAPN-vaccin kandidaat dat de HIV-1-envelop post-Fusion Six-Helix Bundle (SHB) bevatte om de V1V2 lus in de juiste conformatie te presenteren⁹ . Deze kandidaat werd erkend door bekende monoklonale antilichamen tegen HIV-1-envelop eiwitten. Muizen geïmmobiliseerd met V1V2-SHB-SAPN verhoogd V1V2 specifieke antilichamen, dat, belangrijker nog, gebonden aan gp70 V1V2, de juiste conformationele epitopen⁹. De SHB-SAPN core kan andere functies hebben dan de rol als drager voor de HIV-1 V1V2-lus. Hier beschrijven we een gedetailleerde methodologie voor de expressie, zuivering, refolding en validatie van de SHB-SAPN kern. De sequentie selectie, het ontwerp van nanodeeltjes, het moleculaire klonen en de transformatie van E. coli zijn eerder beschreven⁹.

Protocol

1. expressie van het SHB-SAPN-eiwit in E. coli BL21 (DE3)

1. Meng 95 mL van deel A en 5 mL van de media in een steriel glazen erlenmeyer kolf van 2 L volgens de instructies van de fabrikant (Zie de tabel met materialen). Voeg ampicileen toe tot een eindconcentratie van 100 μg/mL.
2. Inoculeren van de media met E. coli van een eerder gevestigde glycerol stam cultuur. Incubate cultuur bij 30 °C met schudden bij 200 rotaties per minuut (rpm) voor 48 h.
   Opmerking: de gebruikte E. coli BL21 (DE3) voorraad bevatte de ampicillaire resistente expressie Vector²³ met het SHB-SAPN-gen. Hoewel het algemene Protocol van de media raadt 24 h van incubatie bij 37 ° c, 48 h van incubatie bij 30 ° c gaf een hogere opbrengst voor SHB-SAPN.
3. Breng de cultuur over naar 2 50 mL conische buizen. Centrifugeer de buizen op 4.000 x g gedurende 10 minuten met een vaste hoekrotor bij 4 °c. Verwijder het supernatant en bewaar de pellet om cellen te oogsten.
   Opmerking: de celpellet kan worden verwerkt onmiddellijk of bevroren bij-80 °C tot gebruik.

2. Lysis van E. coli BL21 (DE3) door sonicatie

Opmerking: gebruik niet-pyrogeen plasticware en glaswerk dat op 250 °c wordt gebakken gedurende ten minste 30 min. tris (2-carboxyethyl) Fosfine (tcep) als reduceermiddel breekt de bisulfide bindingen binnen en tussen eiwitten. TCEP is nodig in de buffers tijdens dit protocol als het weergegeven antigeen S-S-obligaties bevat. Alleen voor SHB-SAPN Core is de aanwezigheid van TCEP in de buffers niet essentieel.

1. Bereid imidazol-vrije buffer (8 M ureum, 50 mM natriumfosfaat monobasic, 20 mM tris-basis, 5 mM TCEP) pH 8,0 (aangepast met 5 N NaOH) en filtreer deze met een vacuüm fles filter Unit van 0,22 μm.
2. Respendeer de cellen van de gepileerde (uit stap 1,3) met 40 ml imidazol-vrije buffer in een conische buis van 1 50 ml. Sonicate de geresuspendeerde cellen met een sonde op ijs gedurende 5 minuten (4 s van sonicatie, 6 s van rust) met een ultrasoonapparaatuitvoer van 150 W.
3. Centrifugeer het cellulaire lysaat (40 mL) bij 29.000 x g bij 4 °c gedurende 25 minuten in een vaste hoekrotor om een opgehelderd supernatant te genereren. Breng de supernatant over in een steriele kolf van 150 mL en gooi de pellet weg. Verdun de supernatant tot 100 mL met behulp van de imidazol-vrije buffer (later in het protocol "sample" genoemd).
   Opmerking: deze verdunningsstap is nodig om te voorkomen dat de fplc-systeemdruk te hoog wordt tijdens het laden van lysaat op de kolom.

3. eiwit zuivering met behulp van een his-column

Opmerking: dit protocol werd uitgevoerd met behulp van een FPLC-instrument, maar het kan worden aangepast aan de zwaartekracht stroom.

1. Bereid de volgende buffers voor en filtreer ze met een 0,22 μm vacuüm fles filtratie-eenheid: (i) imidazol-vrije buffer "buffer A" (8 M ureum, 50 mM natriumfosfaat monobasic, 20 mM tris-basis, 5 mM TCEP) pH 8,0; II) 500 mM imidazol-buffer "buffer B" (8 M ureum, 50 mM natriumfosfaat monobasis, 20 mM tris-basis, 5 mM TCEP, 500 mM imidazol) pH 8,0; en (III) het wassen van isopropanol (20 mM Tris, 60% isopropanol) pH 8,0.
   Opmerking: de pH voor elke buffer is aangepast met 5 N NaOH.
2. Zijn kolom.
   Opmerking: voor productie op labschaal gebruikt dit protocol een 5 mL voorverpakte zijn kolom, maar een grotere kolom kan worden gebruikt.
   1. Open de FPLC-software en klik op de optie nieuwe methode . Het wordt onmiddellijk geopend in het menu methode-instellingen . Kies C1-poort 3onder het dropdownmenu voor de kolom positie.
   2. Op de getoonde door techniek drop-down menu kies affiniteit. In het dropdown-menu kolom Type kiest u anderen, histrap HP, 5 ml. Het kolom volume en de druk dozen worden automatisch ingesteld op de juiste waarden.
   3. Klik op de knop methode omtrek . Sleep de volgende knoppen in het popup-menu van de fase bibliotheek : equilibratie, voorbeeldtoepassing, kolom spoelingen elutie naast de pijl in die exacte volgorde. Sluit het menu van de fase bibliotheek .
   4. Klik op de equilibratietijd -knop. De in de tabel vermelde waarden moeten "initiële buffer B" (4%), "eind buffer B" (4%) en "volume (CV)" 5 zijn.
   5. Klik op het vak voorbeeldtoepassing . Klik in het vak voor het laden van het monster op het keuzerondje voor het injecteren van monster op kolom met monsterpomp. Zorg ervoor dat het vakje naast het gebruik debiet van de methode-instellingen wordt gecontroleerd in de monster injectie met systeem pomp doos. Verander de waarde naar 20 mlnaast het volumevak aan de rechterkant van het scherm.
   6. Klik op de knop voor het wassen van de kolom . De in de tabel vermelde waarden moeten "initiële buffer B" (4%), "eind buffer B" (4%) en "volume (CV)" 5 zijn. Klik naast het breuk verzamelings schema op het vak inschakelen.
   7. Klik op de knop elutie . De waarden die in de tabel worden vermeld, moeten "initiële buffer B" 0%, "uiteindelijke buffer B" 100% en "volume (CV)" 5 zijn. Klik naast het breuk opvangschema op het vakje inschakelen . Klik op de gewenste breuk grootte van methode-instellingen en pas de Fractie grootte aan op 4 ml in het invulveld hieronder.
   8. Klik op de knop Opslaan als boven aan de software. Noem het bestand "equilibration".
   9. Sluit een voorverpakte 5 mL-kolom aan op de corresponderende kolom poort 3 op de FPLC. Zowel pomp A-als pomp B-buizen en de monsterpomp slang moeten in 0,22 μm gefilterd gedeïoniseerd water worden geplaatst. Voer het equilibratietijd-programma uit.
   10. Plaats zowel de pomp a en de pomp B als de monsterpomp slang in de imidazol-vrije buffer (buffer A) en voer het equilibratietijd protocol opnieuw uit.
3. Bind het monster aan de kolom en reinig het eiwit.
   1. Open de FPLC-software en klik op de optie nieuwe methode . Het wordt onmiddellijk geopend in het menu methode-instellingen . Kies C1-poort 3onder het dropdownmenu voor de kolom positie . Op de getoonde door techniek drop-down menu kies affiniteit. In het dropdown-menu kolom Type kiest u anderen, Histrap HP, 5 ml. Het kolom volume en de druk dozen worden automatisch ingesteld op de juiste waarden.
   2. Klik op de knop methode omtrek . Sleep de knoppen van het popup-menu van de Phase Library : equilibratie, monster toepassing, kolom spoeling (Wash 1), kolom Wash (Wash 2), kolom Wash (Wash 3) en elution naast de pijl in dat exacte volgorde. Sluit het menu van de fase bibliotheek .
   3. Klik op de Equilibration -knop. De in de tabel vermelde waarden moeten "initiële buffer B" 4%, "eind buffer B" 4% en "volume (CV)" 5 zijn.
   4. Klik op het vak voorbeeldtoepassing . Klik in het vak voor het laden van het voorbeeld op het keuzerondje voor Inject-monster op kolom met monsterpomp. Zorg ervoor dat het vakje naast het gebruik debiet van de methode-instellingen wordt gecontroleerd in de monster injectie met systeem pomp doos.
   5. Wijzig de waarde naar 100 mL naast het volumevak aan de rechterkant van het scherm. Klik naast het schema voor het verzamelen van breuken op de knop inschakelen . Klik op het vak gebruik fractie grootte van methode-instellingen en wijzig vervolgens de Fractie grootte in 4 ml.
   6. Klik op de eerste kolom Wash knop (Wash 1). De in de tabel vermelde waarden moeten "initiële buffer B" 4%, "eind buffer B" 4% en "volume (CV)" 10 zijn. Klik naast het schema voor het verzamelen van breuken op het vak inschakelen . Klik op de gewenste breuk grootte van methode-instellingen en wijzig de Fractie grootte in 4 ml.
   7. Klik op de tweede kolom Wash knop (Wash 2). De in de tabel vermelde waarden moeten "initiële buffer B" 0%, "eind buffer B" 0% en "volume (CV)" 5 zijn. Klik naast het schema voor het verzamelen van breuken op het vak inschakelen . Klik op de gewenste breuk grootte van methode-instellingen en wijzig de Fractie grootte in 4 ml.
   8. Klik op de derde kolom Wash knop (Wash 3). De in de tabel vermelde waarden moeten "initiële buffer B" 0%, "eind buffer B" 0% en "volume (CV)" 5 zijn. Klik naast het schema voor het verzamelen van breuken op inschakelen. Klik op het vak gebruik fractie grootte van methode-instellingen en wijzig vervolgens de Fractie grootte in 4 ml.
   9. Klik op de knop elution . Klik in de tabel met de rechtermuisknop op de vermelde informatie en klik in het menu dat wordt weergegeven op stap verwijderen. Sleep de isocratische verloop knop tweemaal naar de tabel, zodat er twee ingangen zijn.
   10. De waarde voor de eerste vermelding moet "initiële buffer B" 30%, "eind buffer B" 30% en "volume (CV)" 10 lezen. De waarde voor de tweede vermelding moet "initiële buffer B" 100%, "uiteindelijke buffer B" 100% en "volume (CV)" 10 lezen. Klik naast het schema voor het verzamelen van breuken op de knop inschakelen . Klik op het vakje naast gebruik fractie grootte van methode-instellingen.
   11. Klik op de knop Opslaan als boven aan de software. Noem het bestand "zuivering". Pomp een slang van de fplc moet in de imidazool-vrije wasbuffer worden geplaatst, terwijl de pomp B-slang in de 500 mm imidazol-buffer moet worden geplaatst. De monsterpomp slang moet in het 100 mL monster worden geplaatst.
   12. Voer het programma "zuivering" uit en wacht op de tijd dat de 60% isopropanol nodig is (Wash 2). Pauzeer het programma, verplaats pomp een slang van de imidazole-vrije Wash in de 60% isopropanol Wash. Start het programma opnieuw.
   13. Zodra de isopropanol stap is voltooid, onderbreekt u het programma opnieuw en verplaatst u de pomp een slang terug in de imidazol-vrije wasbuffer. Start het zuiverings programma opnieuw op (de rest van de uitvoering is geautomatiseerd).

4. zuiverheids beoordeling en eiwit identificatie door SDS-PAGE

1. Combineer alle fracties die corresponderen met (i) doorstroom (het cellysaat dat niet aan de zijn kolom bindt), (II) was 1, (III) was 3 (60% isopropanol Wash) en (IV) was 3 in aparte 50 mL conische buizen. Combineer de 2 mL fracties niet uit de elutie stappen.
2. Meng 15 μL van elk van de samengevoegde fracties en alle fracties uit elutie stappen met 2x Laemmli monster buffer in een 0,5 mL micro centrifugebuis en denatureren ze gedurende 10 minuten bij 95 °C.
3. Stel, terwijl de proteïne denatuur is, het gel-hardloop apparaat in met 3 vlek vrije 4 – 20% prefab polyacrylamidegels in 1x tris-Glycine SDS-PAGE Running buffer.
4. Plaats 8 μL moleculair gewichts markering op de eerste put en 30 μL gedenatureerde monster naar de andere putjes van de gel. Voer de gels uit op 200 V totdat de kleurstof voorzijde de bodem van de gel raakt (ongeveer 30 min). Verwijder de gels uit het apparaat en spoel kort met gedeïoniseerd water. Afbeelding van de gel onmiddellijk met behulp van het vlek vrije beeld systeem.
5. Identificeer de fracties die eiwit banden bevatten met de juiste maat (18,07 kDa). Pool al deze fracties.

5. eiwit identificatie door Western Blot

1. Voer een Western-Blot uit met behulp van een his-specifiek antilichaam (anti-6x HisTag) en een SHB-specifiek antilichaam (167-D-IV) om het gezuiverde volledige eiwit te legitimeren. De anti-6x HisTag-antilichaam herkent het N eindpunt van het eiwit en het 167-D-IV-antilichaam herkent het C-eindpunt dat de aanwezigheid van het volledige eiwit aantoont.
2. Bepaal de eiwitconcentratie van de (i) doorstroom, (II) Wash 1, (III) Wash 2 (60% isopropanol Wash), (IV) Wash 3 en alle fracties van de elutie stappen met het spectrometer-instrument bij een absorptie van 280 nm. Genereer verdunningen die 100 ng eiwit bevatten in 15 μL imidazol-vrije buffer voor elk van deze groepen.
3. Voeg 15 μL 2x Laemmli-monster buffer toe aan elke 15 μL van de monsters en denatureren ze zoals in stap 4,1. Zodra de denaturering is voltooid, draai de buizen om ervoor te zorgen dat alle eiwitten kunnen worden overgebracht.
4. Laad monsters en de voorgebeitste marker in een vlek vrije 4 – 20% voorgesneden polyacrylamidegel. Voer de elektroforese op 200 V totdat het kleurstof front de bodem van de gel bereikt.
5. Maak, terwijl de gel loopt, 1 L TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl en 0,1% Tween 20) en 200 mL 5% niet-vette melk in TBS-T.
6. Gebruik een transfersysteem van Western Blot om eiwitten over te brengen naar een nitrocellulose membraan. Gebruik een voorgemonteerde Transfer stack en plaats de gel erop. Stel het systeem in op 25 V gedurende 7 min. Controleer op de aanwezigheid van de voorbevlekt marker op het nitrocellulose membraan dat een volledige overbrenging aangeeft.
   Opmerking: alle volgende stappen worden uitgevoerd op een orbitale shaker set bij 100 RPM bij kamertemperatuur (RT).
7. Zodra de overdracht is voltooid, wassen blots twee keer met TBS-T voor 10 min elk.
8. Blokkeer de nitrocellulose membranen (Blot) met 5% niet-vette melk in TBS-T gedurende ten minste 1 uur. wassen blots twee keer met TBS-T voor 10 min elk.
9. Verdun de primaire 167-D-IV en anti-6x HisTag antilichamen tot 1 mg/mL in TBS-T (Stock AB). Verdun de voorraad ABS van de 167-D-IV 10.000-fold en de anti-6x HisTag 5.000-fold door toevoeging van 2 μL van de voorraad 167-D-IV en 4 μL van de voorraad anti-6x HisTag antilichamen tegen twee verschillende buisjes met 20 mL TBS-T. Voeg het totale volume van de primaire antilichamen van 20 mL, één voor elke vlek, toe en incuberen de blots gedurende 1 uur. was tweemaal met TBS-T gedurende 10 min.
10. Verdun 4 μL van 1 mg/mL van het anti-menselijke secundaire antilichaam van de muis, geconjugeerd met alkalische fosfatase in 20 mL TBS-T (1:5000 verdunning). Verdun 4 μL van 1 mg/mL van het secundaire anti-muis antilichaam van de geit, geconjugeerd met alkalische fosfatase in 20 mL TBS-T (1:5000 verdunning). Voeg secundaire antilichamen toe aan de bijbehorende blots.
    Opmerking: het anti-humane secundaire antilichaam bindt aan 167-D en de anti-muis bindt aan de anti-6x HisTag. Wassen blots twee keer met TBS-T voor 10 min.
11. Voeg voldoende BCIP/NBT alkalische fosfatase substraat om de blots te bedekken. Ontwikkel de blots voor ongeveer 10 minuten tot de bands verschijnen. Spoel de blots af met koud kraanwater en laat ze drogen voordat u scant met een flatbedscanner.

6. de SHB-SAPN opnieuw vouwen

1. Voeg het samengevoegde eiwit (10 \ u201220 mL totaal) toe aan een 10 kDa molecuulgewicht cut-off dialyse cassette en dialyseer het in 8 M ureum, 20 mM Tris, 5% glycerol, 5 mM TCEP pH 8,5 bij RT (18 \ u201226 °C) 's nachts.
2. Het ureum langzaam van het monster te voorzien door de ureum concentratie in de dialyse buffer stapsgewijs met 2 M om de 2 uur te verlagen. Bij een ureum concentratie van 2 M, verplaats het dialyse apparaat naar 4 °C (gebruik TCEP niet in de dialyse buffer uit deze stap). Voltooi het hervouwen door het monster te dialyseren in 120 mM ureum, 20 mM Tris, 5% glycerol, pH 8,5 bij 4 °C 's nachts.
3. Verwijder het refolded proteïne (SHB-SAPN) uit de dialyse cassette. Filtreer de SHB-SAPN met een 0,22 μm Polyvinylideenfluoride (PVDF) spuit filer. Aliquot SHB-SAPN in steriele buizen en bevries ze bij-80 °C, waarbij ten minste 100 μL bij RT wordt gehouden voor latere analyses.

7. validering van deeltjes naar grootte en uiterlijk

1. Dynamische lichtverstrooiing (DLS)
   1. Meet de gemiddelde deeltjesgrootte van de SHB-SAPN door de volgende parameters: Selecteer eiwitten als materiaal, creëer een complexe buffer voor 120 mM ureum, 20 mM Tris, 5% glycerol 25 °C voor temperatuur, selecteer wegwerp cuvetten voor de analyse, selecteer automatisch meting, ingesteld voor 5 runs.
   2. Voeg 45 μL SHB-SAPN toe aan een wegwerp-cuvette en voer de software uit door op de groene pijl te klikken. Selecteer het percentage volume voor de uitlezen.
2. Nanoparticle-traceer analyse (NTA)
   1. Verdun het monster met 1:20 in de hervouwende buffer. Maak 10 mL verdund monster.
   2. Spoel met behulp van 3 mL spuiten het NTA-instrument met de buffer opnieuw in en laad ongeveer 1,5 mL van het monster om het instrument te equilibreren. Gebruik rest van het voorbeeld voor de analyse.
   3. Maak een nieuwe SOP in de NTA-software door op het SOP -tabblad te klikken. Wijzig onder het tabblad het aantal opnamen in 3 en wijzig de opnametijd in 30 sec. Druk op de autofocus -knop aan de linkerkant van het scherm om het monster scherp te stellen. Gebruik de handmatige scherpstel knop aan de zijkant van het apparaat om de scherpstelling te verfijnen.
   4. Voer de gecreëerde SOP, wanneer het systeem vraagt laadt een klein volume van het monster met de spuit. Nadat het systeem alle opnames heeft gemaakt zal het automatisch het analyse scherm naar boven brengen. Schuif de detectie grensbalk zodanig dat alle echte deeltjes zijn gemarkeerd met rode kruisen. Druk op de knop analyse uitvoeren en de analyse wordt automatisch gestart.
3. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)
   1. Gloeien afvoer formvar/Carbon 400 mesh koper TEM ondersteuning van films.
   2. Voeg 3 μL monster bij een concentratie van 0,075 mg/mL toe aan het rooster voor 30 sec. met een filtreerpapier van de vloeistof af.
   3. Was driemaal het rooster met 3 μL gedeïoniseerd water, elke keer dat het water met filtreerpapier afwicking.
   4. Voeg 3 μL van 0,5% ammoniumuranylcarbonaat acetaat toe aan de ondersteunende folie en laat het 30 sec. de meeste ammoniumuranylcarbonaat acetaat afstaan, maar laat een dunne film achter op het oppervlak. Laat de monsters drogen voordat ze worden teruggezet op de transmissie elektronen microscoop.
   5. Beeld monsters bij 80 kV op een TEM.

8. bepaling van het endotoxinegehalte in de monsters met behulp van een kinetische Limulus amoebocyte lysaat (LAL) test

1. Verwijder de kit en de monsters uit de koelkast en laat de RT op een evenwichts veld.
2. Om deze test uit te voeren, is een plaat lezer met een warmte blok en de mogelijkheid om de monsters voor 40 te lezen bij een golflengte van 405 Nm bij 37 °C vereist. Schrijf een programmasjabloon zodat putten elke 150 s worden gelezen om het begintijd punt te identificeren (de OD steeg met 0,2 in vergelijking met de eerste Lees).
3. Verdun het monster tot de concentratie van de immunisatie dosis in PBS.
   NB: de pH van de refolding buffer valt buiten het bereik van de LAL assay. De verdunning van het monster in PBS zal de pH op het acceptabele bereik zetten.
4. Regenereert de controle Endotoxine in de juiste hoeveelheid endotoxine vrij LAL water zoals bepaald door het analysecertificaat om 50 EU/mL te genereren. Draai de injectieflacon krachtig gedurende 15 minuten om de volledige resuspensie van het endotoxine te garanderen.
5. Genereer de endotoxine standaard curve door voor vorming van een 10-voudige seriële verdunning in glazen flesjes in het bereik van 50 EU tot 0,005 EU/mL. Voeg voor elke verdunning 0,1 mL van de vorige verdunning toe aan 0,9 mL LAL water. Vortex krachtig na combinatie gedurende 1 minuut.
6. Voeg een standaard curve verdunningen en SHB-SAPN monsters in tweevoud toe aan een 96-well plate. Gebruik LAL water als een negatieve controle in duplicaat ook. Pre-incuberen de plaat bij 37 °C gedurende 15 minuten.
7. Tegen het einde van de incubatie, respendeert u de injectieflacon met test reagens met 2,6 mL LAL water. Meng inhoud voorzichtig met een serologische pipet.
8. Voeg 100 μL van het test reagens toe aan elk goed van de 96-goed plaat. Verplaats de plaat snel naar de plaat lezer en voer de programmasjabloon uit die is geschreven in stap 8,2.
9. Nadat het programma is voltooid, genereert u een standaard curve met de logboek waarde van de besturingselementen versus de logboek waarde van de begintijd. Gebruik de formule die uit deze curve wordt gegenereerd om de endotoxine concentratie in de monsters te berekenen.

Resultaten

De hier getoonde volledig geassembleerde SHB-SAPN is gebaseerd op eiwit sequenties (Figuur 1a) die naar verwachting in een deeltje worden gevouwen dat 60 exemplaren van het monomeer bevat (Figuur 1b). Figuur 2 geeft een overzicht van de methode voor de productie, zuivering en identificatie van de SHB-SAPN-kern. E. coli uit een glycerol kolf die een Ppep-T expressie vector bevatte met gensequentie van de SHB-SAPN kern werden geïnduceerd in BL21 (DE3) E. coli. Bacteriële cellen werden met succes geteeld en gelyseerd onder denaturering en vermindering van de voorwaarden.

Total Cell lysaat werd gebruikt om SHB-SAPN monomeren door fplc te zuiveren met behulp van een ni^{2 +} kolom (Figuur 3a). De FPLC-chromatograaf demonstreert dat eiwitten zowel op 150 mM als op 500 mM imidazol (Figuur 3a) worden geellueerd. Het chromatogram toont ook twee andere pieken van respectievelijk 185 mL en 210 mL totaal volume overeenkomend met de isopropanol Wash en de imidazol-vrije wassing. De fracties en de zuiverheid van het recombinant eiwit werden geïdentificeerd door een gradiënt SDS-PAGE gels (Figuur 3b). Het eiwit van belang was voornamelijk gelegen in fracties 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL totaal volume). Deze fracties werden samengevoegd voor verdere analyses. Western Blot met anti-his antilichaam (N-Terminal) en 167-D-IV antilichaam (C-Terminus) gaf aan dat de gepoolde fracties inderdaad het eiwit van belang waren (figuur 4a, B). Deze blots demonstreerden ook de aanwezigheid van de SHB-SAPN multimers. Eerdere wassing en elutie fracties hadden de neiging een hogere concentratie van multimerized proteïne te bevatten en werden daarom uitgesloten.

De monsters die de eiwit monomeren van belang bevatte, werden door dialyse in de volledig geassembleerde SHB-SAPN gevouwen. De deeltjesgrootteverdeling werd bepaald door de DLS-en nano artikel-traceer analyse (figuur 5a, B). De DLS identificeerden deeltjes met een Z-gemiddelde hydrodynamische diameter van 67 nm terwijl het NTA-systeem een gemiddelde grootte van 81 nm afgemeten. De geringe verschillen in grootte waren te wijten aan de deeltjes dimensionerings technieken, maar de grootte van beide analyses lag in het verwachte bereik van 20 \ u2012100 nm^8,24,25. SHB-SAPNs werden gevisualiseerd door TEM en de beelden toonden goed gevormde individuele deeltjes met de grootteverdeling verkregen uit de twee deeltjes dimensionerings technieken (figuur 5c).

Tijdens de zuivering van het eiwit werd de kolom gewassen met isopropanol om de LPS-besmetting in het uiteindelijke SHB-SAPN-product te verminderen. Om na te gaan of het endotoxinegehalte aanvaardbaar was voor immunisatie, werd de concentratie van LPS in SHB-SAPN monsters gezuiverd met of zonder de reinigingsstap van het isopropanol bepaald door een kinetische LAL test. De resultaten gaven aan dat de productie van isopropanol de endotoxine spiegels heeft verlaagd van > 0,25 EU/μg tot 0,010 EU/μg SHB-SAPN-eiwit (tabel 1).

Figuur 1: SHB-SAPN eiwitsequentie en structuur. A) de aminozuursequentie van het SHB-SAPN monomeer. B) computer model van de structuur van de volledig GEASSEMBLEERDE SHB-SAPN-kern, bestaande uit 60 eiwit monomeren. Kleurenschema voor aminozuur sequenties: grijs = HisTag; Groen = pentamer; Donkerblauw = de Novo ontworpen Trimer; Licht blauw = zeshelix bundel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: stroomschema van de protocol voor de productie van SHB-SAPN. Kleurenschema: zwart = expressie van het eiwit monomeer in E. coli; Donker grijs = monomeer zuivering; Medium Grey = monomeer identificatie; Lichtgrijs = hervouwen en karakteriseren; Wit = volledig geassembleerd SHB-SAPN product. In stappen gelabeld met donker en medium grijs, het eiwit is onder denaturering en het verminderen van voorwaarden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Eiwit zuivering van de SHB-SAPN monomeren. A) chromatograaf van de fplc-zuivering. Groene lijn boven het chromatogram geeft de zuiveringsstappen aan. De blauwe lijn in het chromatogram vertegenwoordigt de optische dichtheid van de fracties bij een golflengte van 280 nm. De zwarte lijn laat zien welk percentage van buffer B (8 M ureum, 20 mM Tris, 50 mM natriumfosfaat monobasic, 5 mM TCEP, 500 mM imidazol, pH 8,5) werd gebruikt in elke fase van de zuivering. (B) SDS-page gels van de gepoolde fracties van het Lysaat (L), doorstroming (ft), First Wash (W1), isopropanol Wash (W2), derde was (w3) en afzonderlijke fracties van de 150 mm imidazol (E150) en 500 mm imidazol (E500) elutie stappen van de Zuivering. Moleculaire markers in de eerste rijstrook (M) identificeren banden tussen 10 en 250 kDa. Doel proteïne wordt aangegeven door een zwarte pijl. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: identificatie van het eiwit door Western Blot. Alle rijstroken is geladen met 100 ng eiwit. A) resultatenvan een Western Blot met anti-6X histag. B) resultaten van een Western-Blot met een 167-D-IV HIV-1 monoklonaal antilichaam. Lanes zijn gelabeld als: M = molecuulgewicht marker; 1 = lysaat; 2 = doorstroming; 3 = eerste was; 4 = het wassen van isopropanol (tweede spoeling); 5 = derde wasbeurt; 6 = gegroepeerde volume fracties 56 \ u201261 (eerste elutie piek), 7 = gepoolde volume facties 62 \ u201267 (tussen de twee pieken), 8 = gepoolde volume fracties 68 \ u201278 (tweede elutie piek). Doeleiwit met de verwachte band grootte van 18,07 kDa als de monomere SHB-SAPN band wordt aangegeven door een zwarte pijl. Extra banding in Lanes 7 en 8 zijn dimers, trimers en multimers van de SHB-SAPN (rode pijl). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: karakterisering van de hergevouwen SHB-SAPN. A). verdeling van de deeltjesgrootte zoals bepaald door de DLS. B) deeltjesgrootte zoals bepaald door nanodeeltjes-tracking (systeem). C) visualisatie van de SHB-SAPN-deeltjes door tem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Monster	Endotoxine (EU/mL)	Endotoxine (EU/μg eiwit)
SAPN met isopropanol Wash	2,02	0,01
SAPN zonder isopropanol Wash	> 50	> 0,25
Negatieve controle	Onder detectieniveau	N/a

Tabel 1: endotoxine niveaus van hergevouwen SHB-SAPNs. Endotoxine spiegels in SHB-SAPN-monsters die met of zonder een isopropanolwas worden gezuiverd, worden gepresenteerd als endotoxine eenheden/mL en endotoxine eenheden/μg SHB-SAPN-eiwitten.

Discussie

Nanotechnologie biedt vele voordelen en oplossingen voor de ontwikkeling van subeenheid vaccins. Nanovaccines kunnen herhaaldelijk antigenen presenteren als deeltjes aan het gastheer immuunsysteem die de immunogeniciteit verhogen²⁶. Hoewel er veel verschillende soorten nanovaccines zijn, geloven we dat degenen die bestaan uit de Novo ontworpen eiwitten de sterkste aanpak lijken te zijn voor vaccin ontwikkeling¹. Ze kunnen worden ontworpen zonder een sequentie homologie aan de gastheer eiwitten en presenteren het antigeen van belang in dicht bij inheemse-achtige conformatie terwijl het verstrekken van lage productiekosten en hoge product opbrengsten. Een uitstekend voorbeeld van deze aanpak is de SAPN-technologie, die we hebben toegepast op vaccins tegen meerdere besmettelijke ziekten⁷. Om de moeilijkheden bij de ontwikkeling van HIV-1-vaccins aan te pakken, hebben we een unieke SHB-SAPN-kern ontwikkeld om het V1V2 antigen effectief te presenteren in een native-achtige trimeric-conformatie⁹. Veel vaccin doelen, met name voor virale ziekten, zijn aanwezig als trimeren²⁷. Dit fenomeen geeft aan dat ons SAPN-ontwerp brede implicaties heeft voor de ontwikkeling van subeenheid vaccins.

Bij deze methode laten we zien hoe u SHB-SAPNs produceert in een E. coli -expressie systeem. We hebben hoge opbrengsten van eiwitten uitgedrukt (ongeveer 6 mg/100 mL cultuur). Het eiwit bevatte 10 histidines en werd gemakkelijk gezuiverd met behulp van een geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie met ni^{2 +} kolom. Deze lengte van de his-tag bleek de optimale te zijn voor de hoogste eiwitopbrengst. Het gezuiverde eiwit bevatte de volledige lengte van het ontworpen eiwit, zoals aangegeven door de aanwezigheid van zowel de N-terminale HisTag als de C-Terminal heptad REPEAT. We gebruikten algemeen aanvaarde technieken en optimaliseerde ze voor de expressie, productie en karakterisering van de SHB-SAPN core. Gebrek aan de productie van het volledige eiwit tijdens de ontwikkeling van een SAPN met een nieuwe proteïne-epitoop kan duiden op een expressie probleem van het gen in de hostcel. Als dat gebeurt, moeten het gen en het expressie systeem opnieuw worden ontworpen en aangepast aan het beschreven protocol. Wijziging van sonicatie tijd of-intensiteit kan ook de concentratie van het voorspelde volledige eiwit verhogen.

Hergevouwen deeltjes waren in het verwachte groottebereik (20 tot 100 nm)^8,24,25 zoals bepaald door DLS en nano artikel tracking analyse. Deze resultaten werden verder bevestigd door het gebruik van TEM. Als er problemen zijn in deze stap, is dit normaalgesproken het gevolg van een probleem met de pH-of Ionische sterkte van de hervouwende buffer. Wanneer grote deeltjes worden gedetecteerd op de deeltjes dimensionerings technieken, geeft dit aan aggregatie, die kan worden vermeden door het verhogen van de pH van de hervouwende buffer. Als de deeltjes niet worden gedetecteerd door DLS, controleer dan de concentratie van het eiwit en controleer de pH van de buffer. De uiteindelijke eiwitconcentratie voor DLS moet ten minste 100 μg/mL zijn. Als de concentratie niet het probleem is, duidt dit op de overvloed aan kleine, niet volledig gevormde deeltjes, waarvan de concentratie kan worden verminderd door de pH te verlagen. Als alternatief kan de natriumchloride-concentratie worden aangepast aan het optimale bereik om de aanwezigheid van deeltjes met ongewenste grootte te minimaliseren.

Tot slot, door het gebruik van een isopropanol Wash stap tijdens zuivering waren we in staat om contaminerende LP'S te verminderen van de gastheer E. coli naar 0,01 EU/ΜG van SAPN die onder de Food and Drug ADMINISTRATION (FDA) limiet van 5 EU/kg lichaamsgewicht voor injecteerbare producten ²⁸. dit niveau kan verder worden verminderd door gebruik te maken van een anion Exchange-kolom, ook wel Q-kolom genoemd. Als er nog steeds hoge niveaus van endotoxine aanwezig zijn, controleer dan alle materialen die zijn gebruikt voor de buffer voorbereiding. Vergeet niet om alleen depyrogenated glaswerk en endotoxine gratis plasticware te gebruiken in deze methode.

Deze resultaten geven aan dat we met succes een methode hebben ontwikkeld om de SHB-SAPN-kern te produceren die kan worden gebruikt voor preklinische immunisatie studies. Deze methode met slechts kleine wijzigingen, indien van toepassing, kan worden toegepast op de zuivering van SHB-SAPNs wanneer een antigeen van belang wordt toegevoegd. Het gebruik van deze methode als uitgangspunt is een van de belangrijkste veranderingen in de elutie-stap. Verschillende eiwitten Elueer bij verschillende imidazol concentraties die experimenteel moeten worden bepaald. Het andere belangrijke verschil kan de samenstelling van de hervouwende buffer zijn. Optimalisatie zou moeten testen verschillende pH-omstandigheden en Ionische sterktes.

Met het oog op toekomstig werk zijn slechts twee kleine aanpassingen nodig om de toepassing van de SHB-SAPN mogelijk te maken. De eerste is dat de expressie vector moet worden gewijzigd in een kanamycine weerstand selecteerbare marker als gevolg van de ampicilineallergie bij de mens²⁹. De andere belangrijke eis van de eiwitproductie voor menselijk gebruik is het produceren van de SHB-SAPN in dierlijke product-vrije media. Een kleinschalige studie wees al op een redelijk rendement van eiwitten in een plantaardige media. Het hier gepresenteerde werk is gemakkelijk schaalbaar voor de ultieme GMP-productie, zoals aangetoond met een malaria vaccin kandidaat, FMP014¹⁶. Deze grootschalige FMP014-SAPN-productie omvatte zowel de anion-uitwisseling als de Cation Exchange-stappen om LPS en ni^{2 +} -inhoud van het eindproduct verder te verminderen. Deze bacterie-uitgedrukt SAPN is al opgeschaald voor een aanstaande klinische studiefase 1/2a.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10x Tris/Glycine/SDS	BioRad	1610732	1 L
2-Mercaptoethanol	BioRad	1610710	25 mL
2-propanol	Fisher	BP26181	4 L
2x Laemmli Sample Buffer	BioRad	1610737	30 mL
40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers	Malvern Panalytical	ZEN0040	100 pack
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl	BioRad	4561093	10 pack
Ampicillin	Fisher	BP1760-25	25 g
Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]	AbCam	ab18184	100 mg
Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)	AIDS Reagent Repository	11681	100 mg
BCIP/NBT Substrate, Solution	Southern Biotech	0302-01	100 mL
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems	Fisher	09-761-108	A variety of sizes
Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42µm	Ted Pella, Inc	01754-F	25 pack
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP Prepacked Columns	GE HealthCare	45-000-325	5 pack
Glycerol	Fisher	BP229-4	4 L
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase)	ABCam	ab97020	1 mg
Imidazole	Fisher	O3196-500	500 g
Instant NonFat Dry Milk	Quality Biological	A614-1003	10 pack
Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay	Lonza Walkersville	50650U	192 Test Kit
LAL Reagent Grade Multi-well Plates	Lonza Walkersville	25-340	1 plate
Magic Media E. coli Expression Medium	ThermoFisher	K6803	1 L
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters	Millipore	SLGV033RB	250 pack
Mouse Anti-Human IgG Fc-AP	Southern Biotech	9040-04	1.0 mL
One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli	ThermoFisher	C601003	20 vials
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,	BioRad	1610363	1 mL
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL	ThermoFisher	66810	8 pack
Sodium Chloride	Fisher	BP358-212	2.5 kg
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	BP329-500	500 g
Tris Base	Fisher	BP152-1	1 kg
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Biosynth International	C-1818	100 g
Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S	Electron Micoscopy Services	541-09-3	25 g
Urea	Fisher	BP169-500	2.5 kg
Whatman qualitative filter paper	Sigma Aldrich	WHA10010155	pack of 500
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
ChromLab Software ver 4	BioRad	12009390	Software
Epoch 2 Microplate Spectrophotometer	BioTek	EPOCH2	Plate Reader
Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor	ThermoFisher	096-145075	Rotor
Gel Doc EZ Gel Documentation System	BioRad	1708270	Gel Imager for Stain free Gels
JEOL TEM	JEOL	1400	Transmission Electron Microscope
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels	BioRad	1658004	To run gels
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	For Protein Concentration
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Particle Sizing
NanoSight NTA software NTA	Malvern Panalytical		Particle Sizing
New Brunswick Innova 44/44R	Eppendorf	M1282-0000	Incubator/Shaker
NGC Quest 10 Chromatography System	BioRad	7880001	FPLC to aid in protein purification
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System	Ted Pella, INC	91000S	To clean grids
PowerPac Universal Power Supply	BioRad	1645070	To run gels
Rocker Shaker	Daigger	EF5536A	For Western
Sonifer 450	Branson	also known as 096-145075	Sonicator
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge	ThermoFisher	75-006-580	Centrifuge
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs	BioRad	1704158	For Western
Trans-Blot Turbo Transfer System	BioRad	1704150	For Western
Vortex-Genie 2	Daigger	EF3030A	Vortex
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Particle Sizing
Zetasizer Software	Malvern Panalytical		Particle Sizing