Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60104

⸱

18 januari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Clinical Epidemiology, School of Public Health, Capital Medical University, 2School of Public Health, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 3School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Immunoglobuline G (IgG) N-glycan wordt gekenmerkt met behulp van hydrofiele interactie CHROMATOGRAFIE UPLC. Daarnaast is de structuur van IgG N-glycan duidelijk gescheiden. Hier gepresenteerd is een inleiding tot deze experimentele methode, zodat het op grote schaal kan worden gebruikt in onderzoeksinstellingen.

Samenvatting

Glycomics is een nieuwe subspecialiteit in het omics-systeem onderzoek dat een significant potentieel biedt bij het ontdekken van de volgende generatie biomarkers voor ziekte gevoeligheid, detectie van drugs doel en precisie geneeskunde. Alternatieve IgG N-glycans zijn gemeld bij verschillende gemeenschappelijke chronische ziekten en suggereerden veel potentieel in klinische toepassingen (d.w.z. biomarkers voor diagnose en voorspelling van ziekten). IgG N-glycans worden op grote schaal gekenmerkt door de methode van hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) Ultra-Performance vloeistofchromatografie (UPLC). UPLC is een stabiele detectietechnologie met een goede reproduceerbaarheid en een hoge relatieve kwantitatieve nauwkeurigheid. Bovendien, de structuur van IgG N-ontwikkelen is duidelijk gescheiden, en ontwikkelen samenstelling en relatieve overvloed in plasma worden gekenmerkt.

Inleiding

N-glycosylatie van menselijke eiwitten is een gemeenschappelijke en essentiële post-translationele modificatie1 en kan het optreden en de ontwikkeling van ziekten relatief nauwkeurig voorspellen. Vanwege de complexiteit van de structuur, wordt verwacht dat er meer dan 5.000 ontwikkelen structuren, het bieden van grote potentie als diagnostische en voorspellende biomarkers voor ziekten2. N-glycans gekoppeld aan immunoglobuline G (IgG) zijn essentieel gebleken voor de functie van IgG, en IgG N-glycosylatie neemt deel aan de balans tussen de Pro-en ontstekingsremmende systemen3. Differentiële IgG N-glycosylatie is betrokken bij ziekte ontwikkeling en progressie, die zowel een aanleg als een functioneel mechanisme dat betrokken is bij ziekte pathologie representeren. De ontstekings functie van IgG N-glycosylation is geassocieerd met veroudering, ontstekingsziekten, auto-immuunziekten, en kanker4.

Met de ontwikkeling van detectietechnologie worden de volgende methoden het meest gebruikt in hoge doorvoer glycomics: hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) Ultra-Performance vloeistofchromatografie met fluorescentiedetectie (UPLC-FLR), multiplex capillaire gel elektroforese met laser geïnduceerde fluorescentiedetectie (xCGE-LIF), matrix-geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF-MS), en vloeibare chromatografie elektro spray massaspectrometrie (LC-ESI-MS) . Deze methoden hebben overwonnen eerdere tekortkomingen van lage flux, instabiele resultaten, en slechte gevoeligheid specificiteit5,6.

UPLC wordt veel gebruikt om de associatie te onderzoeken tussen IgG N-glycosylatie en bepaalde ziekten (d.w.z. veroudering7, obesitas8, dyslipidemie9, type II diabetes10, hypertensie11, ischemische beroerte12, en de ziekte van Parkinson13). In vergelijking met de andere drie bovengenoemde methoden heeft UPLC de volgende voordelen5,14. Ten eerste biedt het een relatieve kwantitatieve analysemethode en de gegevensanalyse die de totale gebieds normalisatie omvat, verbetert de vergelijkbaarheid van elk monster. Ten tweede zijn de kosten van apparatuur en vereiste expertise relatief laag, wat het gemakkelijker maakt om glycosylatie biomarkers in klinische toepassingen te implementeren en te transformeren. Hier gepresenteerd is een inleiding tot UPLC, zodat het meer op grote schaal kan worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle onderwerpen die in het protocol zijn opgenomen, zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Capital Medical University, Peking, China12. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van elk onderwerp aan het begin van de studie.

1. IgG-isolatie

  1. Bereid de chemicaliën inclusief bindende buffer (fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutraliserende buffer: 10x PBS (pH = 6,6-6.8), eluent: 0,1 M mierenzuur (pH = 2,5), neutraliserende oplossing voor eluent: 1 M Ammoniumbicarbonaat, opgeslagen buffer: 20% ethanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), reinigingsoplossing voor proteïne G: 0,1 M NaOH + 30% Propan-2-OL.
    Opmerking: het niveau van de pH is van cruciaal belang in dit protocol. De elutie van IgG vereist een zeer lage pH en er bestaat een risico op verlies van sialic zuren als gevolg van zure hydrolyse. Daarom komt elutie binnen enkele seconden, en de pH wordt snel hersteld naar neutraliteit, behoud van de integriteit van IgG en de sialic zuren.
  2. Bereid de monsters voor: ontdooit het bevroren plasma monster en centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 80 x g en laat de proteïne g monolithische plaat en de bovengenoemde chemicaliën gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  3. Breng een 100 μL monster (dat kan worden gebruikt om 2x te detecteren om de eerste storing te voorkomen) over in een 2 mL Verzamel plaat (hier, in totaal zes standaardmonsters, één controlemonster [Ultra-zuiver water] en 89 plasma monsters zijn ontworpen voor 96 put platen en willekeurig toegewezen aan de plaat).
  4. Verdun de monsters met 1x PBS met 1:7 (v/v).
  5. Reinig een 0,45 μm-filterplaat met hydrofiele polypropyleen (GHP) met 200 μL ultrazuiver water (Herhaal 2x).
  6. Breng de verdunde monsters in de filterplaat en filtreer de monsters in de opvang plaat met behulp van een vacuümpomp (controle-vacuüm druk bij 266.6-399.9 PA).
  7. Bereiding van de proteïne G monolithische platen
    1. Gooi de opslag buffer weg.
    2. Reinig de monolithische platen met 2 mL ultrazuiver water, 2 mL 1x PBS, 1 mL 0,1 M mierenzuur, 2 mL 10x PBS, 2 mL 1x PBS (opeenvolgend) en verwijder vloeiende vloeistof met behulp van een vacuümpomp.
  8. Breng de gefilterde monsters over naar de proteïne G monolithische plaat voor IgG binding en reiniging en reinig vervolgens de monolithische platen met 2 mL 1x PBS (Herhaal de reiniging 2x).
  9. Elute IgG met 1 mL van 0,1 M mierenzuur en filtreer de monsters door de vacuümpomp in de opvang plaat, voeg vervolgens 170 μL van 1 M Ammoniumbicarbonaat toe aan de opvang plaat.
  10. Detecteer de IgG-concentratie met behulp van een absorptie spectrofotometer (optimale golflengte = 280 nm).
    1. Open de software en selecteer de proteïne-CY3 modus.
    2. Trek 2 μL Ultra zuiver water en laad het in het scherm en klik vervolgens op ' leeg ' in de software om het scherm te wissen (1x herhalen).
    3. Trek 2 μL Ultra zuiver water en laad het in het scherm en klik vervolgens op sample in de software om het ultrazuivere water te detecteren.
    4. Trek 2 μL IgG-monster en laad het in het scherm en klik vervolgens op voorbeeld in de software om het monster te detecteren.
    5. Trek 2 μL Ultra zuiver water en laad het in het scherm en klik vervolgens op leeg in de software om het scherm te wissen.
    6. Sluit de software.
      Opmerking: de formule voor het berekenen van de IgG-concentratie is als volgt:

      CIgG = extinctiecoëfficiënt x (13,7) x 1.000 μg/ml
  11. Zet de geëxtraheerde IgG droog in een oven bij 60 °C en bewaar de geëxtraheerde IgG (300 μL geëxtraheerd IgG voor 4 uur).
    1. Verwijder 300 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie groter is dan 1.000 μg/mL.
    2. Verwijder 350 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie tussen 500-1000 μg/mL ligt.
    3. Verwijder 400 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie tussen 200-500 μg/mL ligt.
    4. Verwijder 600 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie kleiner is dan 200 μg/mL.
      Opmerking: de concentratie van IgG moet bij voorkeur > 200 μg/mL voor de daaropvolgende detectie. De gemiddelde hoeveelheid IgG moet bij voorkeur > 1200 μg zijn, die 2x kan worden getest voor het geval de eerste test mislukt.
  12. Reiniging van de proteïne G monolithische plaat voor hergebruik
    1. Was de plaat met 2 mL ultrazuiver water, 1 mL 0,1 M NaOH (voor het verwijderen van neergeprecipiteerde eiwitten), 4 mL ultrazuiver water en 4 mL 1x PBS (opeenvolgend) en verwijder vervolgens de vloeiende vloeistof met behulp van een vacuümpomp.
    2. Was de plaat met 2 mL ultrazuiver water, 2 mL 30% propaan-2-OL (voor het verwijderen van gebonden hydrofobe eiwitten), 2 mL ultrazuiver water en 4 mL 1x PBS (opeenvolgend) en verwijder vervolgens vloeiende vloeistof met behulp van een vacuümpomp.
    3. Was de plaat met 1 mL buffer (20% ethanol + 20 mm tris + 0,1 M NaCl) en voeg 1 mL buffer (20% ethanol + 20 mm tris + 0,1 M NaCl) toe aan de plaat en laat de plaat vervolgens bij 4 °C.

2. glycan vrijlating

  1. Bereid de gedroogde IgG en bewaar de chemicaliën, waaronder 1,33% SDS, 4% Igepal (bewaren uit de buurt van licht), en 5x PBS bij RT.
  2. Bereid PNGase F enzym door verdunning 250 U enzym met 250 μL ultrazuiver water.
  3. Denaturatie van IgG
    1. Voeg 30 μL van 1,33% SDS toe en meng door vortexing, breng het monster 10 min in een oven van 65 °C, haal het uit de oven en laat 15 minuten rusten.
    2. Voeg 10 μL 4% Igepal toe en plaats het op de schud incubator gedurende 5 min.
  4. Verwijdering en afgifte van glycanen
    1. Voeg 20 μL 5x PBS en 30-35 μL 0,1 mol/L NaOH toe om een pH van 8,0 te reguleren en meng door vortexing. Voeg 4 μL PNGase F-enzym toe en meng door vortexing. Inincuberen voor 18-20 h in een waterbad van 37 °C.
    2. Zet de vrijkomende glycanen droog in een oven bij 60 °c voor 2.5-3,0 h.
    3. Bewaar de vrijgegeven glycanen bij-80 °c tot verdere meting.
      Opmerking: deze stap is van cruciaal belang. De sleutel tot ontwikkelen release is het verbeteren van de activiteit van het pngase F-enzym om de efficiëntie te maximaliseren.

3. glycan-etikettering en-zuivering

  1. Bereid het 2-aminobenzamide (2-AB) etiketteer reagens met 0,70 mg 2-AB, 10,50 μL azijnzuur, 6 mg natrium cyanoborohydride (NaBH3CN) en 24,50 μL dimethylsulfoxide (DMSO) (totaal volume = 35 μL). Voeg vervolgens azijnzuur, 2-AB, en NaBH3cn in de DMSO in orde.
  2. Label de glycanen met behulp van 35 μL 2-AB etiketteer reagens, breng de gelabelde glycanen over naar de oscillator gedurende 5 minuten, zet deze over naar de oven voor 3 uur bij 65 °c en breng vervolgens 30 minuten over naar RT.
    Opmerking: de hele ontwikkelen-etiketterings stap moet worden uitgevoerd terwijl deze beschermd is tegen licht.
  3. Voorbehandelen van een 0,2 μm GHP filterplaat met 200 μL 70% ethanol, 200 μL ultrazuiver water, en 200 μL 96% acetonitril (4 °C), verwijder vervolgens afval met behulp van een vacuümpomp.
  4. Zuivering van 2-AB gelabelde ontwikkelen
    1. Voeg 700 μL 100% acetonitril toe aan de 2-AB met het label ontwikkelen en breng gedurende 5 minuten over op een schud incubator.
    2. Centrifugeer bij 134 x g gedurende 5 min (4 °c).
    3. Breng het monster gedurende 2 minuten over in een GHP-filterplaat van 0,2 μm en verwijder het filtraat (vloeiende vloeistof) met behulp van een vacuümpomp.
  5. Was 2-AB gelabeld ontwikkelen met 200 μL 96% acetonitril (4 °c) en verwijder het filtraat (vloeiende vloeistof) met behulp van een vacuümpomp 5x-6x.
  6. Elute 2-AB gelabelde ontwikkelen met 100 μL Ultra zuiver water 3x.
  7. Breng de 2-AB met gelabelde ontwikkelen over in een oven om te drogen bij 60 °c gedurende 3,5 uur.
  8. Bewaar het gelabelde N-glycans bij-80 °c tot verdere meting.

4. hydrofiele interactie chromatografie en analyse van glycanen

  1. Conditionering van UPLC-instrumenten en voorbereiding van mobiele fasen
    1. Bereid mobiele fasen voor, inclusief oplosmiddel A: 100 mM ammonium formaat (pH = 4,4), oplosmiddel B: 100% acetonitril, oplosmiddel C: 90% ultrazuiver water (10% methanol) en oplosmiddel D: 50% methanol (Ultra zuiver water).
    2. Open de software om de mobiele fases te controleren.
    3. Wash UPLC instrumenten met een debiet van 0,2 mL/min (50% oplosmiddel B en 50% oplosmiddel C) balanceren gedurende 30 min, vervolgens bij een debiet van 0,2 mL/min (25% oplosmiddel A en 75% oplosmiddel B) balanceren gedurende 20 min, vervolgens een debiet van 0,4 mL/min Balancing.
  2. Los het gelabelde N-glycans op met 25 μL van een mengsel van 100% acetonitril en ultra zuiver water bij een 2:1 ratio (v/v). Centrifugeer vervolgens op 134 × g gedurende 5 min (4 °c) en laad 10 μL van het gelabelde N-GLYCANS in de UPLC-instrumenten.
  3. Scheid de gelabelde N-glycans met een debiet van 0,4 ml/min met een lineair stijgingspercentage van 75% tot 62% acetonitril gedurende 25 minuten. Voer vervolgens een analytische uitvoering uit door dextran kalibratie ladder/glycopeptide kolom op een UPLC bij 60 °C (hier worden monsters vóór de injectie op 4 °C gehouden).
  4. Detectie van N-glycan-fluorescentie bij excitatie en emissie golflengtes van respectievelijk 330 nm en 420 nm.
  5. Integreer de glycanen op basis van piekpositie en retentietijd.
  6. Bereken de relatieve waarde van elke Glycan piek (GP)/alle Glycan pieken (GPs) (percentage,%) als volgt: GP1: GP1/GPs * 100, GP2: GP2/GPs * 100, GP3: GP3/GPs * 100, etc.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals weergegeven in Figuur 1, werden IgG N-glycans geanalyseerd in 24 initiële IgG ontwikkelen pieken (GPS) op basis van piekpositie en retentietijd. De N-glycan structuren zijn beschikbaar via massaspectrometrie detectie volgens een eerdere studie (tabel 1)15. Om ervoor te zorgen dat de resultaten vergelijkbaar waren, werd de totale oppervlakte-normalisatie toegepast, waarbij de hoeveelheid glycanen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

UPLC dient als relatieve kwantitatieve analysemethode5,15. De resultaten geven aan dat UPLC een stabiele detectietechnologie is met een goede reproduceerbaarheid en relatieve kwantitatieve nauwkeurigheid. De hoeveelheid glycanen in elke piek wordt uitgedrukt als een percentage van het totale geïntegreerde gebied met behulp van UPLC, wat de relatieve waarde is. De relatieve kwantificering verbetert de vergelijkbaarheid van de test monsters. Daarnaast worden 96 wel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) en de Australische-Chinese samenwerkings beurs (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-aminobenzamide, 2-ABSigma, China
96-well collectieplaatAXYGEN
96-well filterplaatPol0.45 um GHP
96-well monolithische plaatBIA Separations
96-well plate rotorEppendorf Co., Ltd, GermanyT_1087461900
AzijnzuurSigma, China
AcetonitrilHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
AmmoniumbicarbonaatShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
AmmoniumformiaatBeijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant schuddende incubator/rockerZhicheng analytisch instrumentenfabriek co., Ltd, ChinaZWY-10313
Dextran kalibratieladder/Glycopeptide kolomWatts technologie Co., Ltd, ChinaBEH kolom
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma, China
DinatriumfosfaatShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Elektrische ovensTester instrumenten Co., Ltd202-2AB
Empower 3.0Waters technologie Co., Ltd, Amerika
EthanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
MierenzuurSigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kitSigma, China
HClJunrui Biotechnology Co., Ltd, China
Hogesnelheid centrifugeEppendorf Co., Ltd, Germany5430
IgepalSigma, China
KoudcentrifugeEppendorf Co., Ltd, Germany
KoudkoelkastQingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plaatWatts technologie Co., Ltd, China186001831
MethanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q zuiver watermeterMillipore Co., Ltd, AmerikaAdvantage A10
NaOHShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH testerSartorius Co., Ltd, GermanyPB-10
Fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBSShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PipetEppendorf Co., Ltd, Germany4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzymSigma, China
KaliumdihydrogeenfosfaatShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propaan-2-olHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDSSigma, China
NatriumchlorideShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Natriumcyanoborohydride (NaBH3CN)Sigma, China
SpectrofotometerShanghai Yuanxi instrument Co., LtdB-500
Transfer vloeistofpistoolSmer Fell Science and Technology Co., Ltd, China4672100
TrisAmresco, Amerika
Ultra-lage temperatuur koelkastThermo Co., Ltd, AmerikaMLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-prestatie vloeistofchromatografieWatts technologie Co., Ltd, ChinaAcquity MLtraPerformance LC
VacuümpompWatts technologie Co., Ltd, China725000604
Verdampingsmachine/DrogerEppendorf Co., Ltd, GermanyT_1087461900
VortexChangzhou Enpei instrument Co., Ltd, ChinaNP-30S
WaterbadTester instrumenten Co., LtdDK-98-IIA
WeegschaalShanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.MP200B

Referenties

  1. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
  2. Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
  3. Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392(2013).
  4. Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65(2018).
  5. Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).
  6. Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841(2013).
  7. Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779(2014).
  8. Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20(2014).
  9. Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235(2018).
  10. Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).
  11. Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).
  12. Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).
  13. Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).
  14. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).
  15. Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).
  16. Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).
  17. Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

IgG N glycaananalysehydrofiele interactiechromatografieglycaansamenstellingsanalyseProtein G monolithische plaatendoglycosidase F enzymtwee aminobenzimide labelingUPLC instrumentkalibratiefluorescentiedetectiegolflengtenglycaanpiekscheiding
Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.