Methodenartikel

Karakteriseren van individuele eiwit aggregaten door infrarood nano spectroscopie en Atoom kracht microscopie

DOI:

10.3791/60108

⸱

12 september 2019

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven de toepassing van infrarood nano spectroscopie en hoge-resolutie atomaire kracht microscopie om het proces van eiwit zelf montage te visualiseren in oligomere aggregaten en amyloïde fibrils, die nauw verbonden is met het ontstaan en de ontwikkeling van een breed scala aan humane neurodegeneratieve aandoeningen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het fenomeen van eiwit misvouwen en aggregatie resulteert in de vorming van zeer heterogene eiwit aggregaten, die worden geassocieerd met neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson. In het bijzonder laag moleculair gewicht aggregaten, amyloïde oligomeren, is aangetoond dat het bezitten van generieke cytotoxische eigenschappen en zijn betrokken als neurotoxines in vele vormen van dementie. We illustreren het gebruik van methoden op basis van atoom kracht microscopie (AFM) om de uitdagende taak van het karakteriseren van de morfologische, structurele en chemische eigenschappen van deze aggregaten te verhelpen, die moeilijk te bestuderen zijn met conventionele structurele methoden of bulk Biofysische methoden vanwege hun heterogeniteit en voorbijgaande aard. Scanning probe microscopie benaderingen zijn nu in staat om te onderzoeken van de morfologie van amyloïde aggregaten met sub-nanometer resolutie. We laten hier zien dat infrarood (IR) nano spectroscopie (AFM-IR), die tegelijkertijd de hoge resolutie van de AFM en de chemische herkennings kracht van IR-spectroscopie exploiteert, verder kan gaan en de karakterisering van de structurele eigenschappen van individuele eiwit aggregaten, en bieden dus inzicht in de aggregatie mechanismen. Aangezien de benadering die we beschrijven ook kan worden toegepast op het onderzoek van de interacties van eiwit assemblages met kleine moleculen en antilichamen, kan het fundamentele informatie leveren om nieuwe therapeutische verbindingen te ontwikkelen voor het diagnosticeren of behandelen van neurodegeneratieve aandoeningen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meer dan 40.000.000 mensenwereld wijd worden momenteel getroffen door neurodegeneratieve aandoeningen, zoals Alzheimer (AD)1 en Parkinson (PD)2 ziekten. Meer in het algemeen worden meer dan 50 pathologieën geassocieerd op moleculair niveau met eiwit misvouwen en aggregatie, een proces dat leidt tot de proliferatie van onoplosbare fibrillar eiwit aggregaten, bekend als amyloïde deposito's3, 4. de moleculaire oorsprong van neurodegeneratie en de verbanden met eiwit conformationele veranderingen van eiwitten die leiden tot amyloïde vorming, blijven echter onduidelijk, grotendeels vanwege het hoge niveau van heterogeniteit, voorbijgaande aard en nanoschaal dimensies van de pathologische aggregaten4,5.

Zeer succesvolle onderzoeken van eiwit structuren in de afgelopen decennia zijn op grote schaal gebaseerd op het gebruik van bulk methoden, waaronder Röntgen kristallografie, Cryo-elektronenmicroscopie en nucleaire magnetische resonantie spectroscopie5, 6 , 7 , 8 , 9. binnen deze klasse van technieken, infrarood (IR) spectroscopie is ontstaan als een gevoelig analytisch instrument om de chemische eigenschappen van biologische systemen zoals eiwitten8ontrafelen. IR-methoden maken het kwantificeren van eiwit secundaire en quaterale structurele veranderingen mogelijk tijdens hun misvouwen en aggregatie. Bovendien, om verder te ontcijferen op microscopisch niveau de mechanistische details die betrokken zijn bij de complexe vrije energie landschappen van eiwitten tijdens hun aggregatie, is een belangrijke voorschot de ontwikkeling van chemische kinetiek-instrumenten om uit te breiden tot complexe zelf-assemblage trajecten waaronder amyloïde fibrillen formatie5,6,7,10,11,12. Echter, bulk spectroscopische methoden bieden alleen gemiddelde informatie over het heterogene ensemble van soorten die aanwezig zijn in de oplossing of die betrokken zijn bij specifieke microscopische stappen, waardoor het onderzoek naar de biofysische eigenschappen van individuele geaggregeerde soorten uitdagend op het niveau van de nanoschaal13,14.

In de laatste decennia zijn verschillende microscopie technieken met de mogelijkheid om te werken op schalen kleiner dan de diffractie-grens van licht ontstaan. Deze klasse van methoden omvat elektronenmicroscopie (EM) en Atoom kracht microscopie (AFM). Terwijl het scannen van elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) voorziet in tweedimensionale (2D) beelden van een specimen, is de AFM in de afgelopen decennia ontstaan als een krachtige en veelzijdige techniek om driedimensionale (3D) morfologieën te bestuderen, zoals evenals de Nano-eigenschappen van een monster met een sub-nanometer resolutie13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. de gedachte achter het bestuderen van eiwit aggregatie via de AFM is dat deze aanpak het onderzoek mogelijk maakt naar de morfologie van individuele soorten die aanwezig zijn in de oplossing13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Met name door de monitoring van het monster als functie van de tijd, maakt de AFM het mogelijk onderzoek te doen naar de evolutie van de morfologie van de soort in het monster, waardoor de paden van amyloïde vorming23kunnen worden gevolgd en visualiseren, 25,38,39,40,41,42. Bovendien maakt de AFM de kwantificering mogelijk van structurele parameters zoals transversale hoogten en lengtes van de afzonderlijke soorten in oplossing13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. de studie van één enkele biofysische eigenschap, zoals morfologie, is echter vaak niet voldoende bij het bestuderen van heterogene en complexe biologische systemen. Bij de beeldvormende methoden AFM, SEM of TEM wordt de chemische eigenschappen van heterogene aggregaten van amyloïde stoffen op nanoschaal niet gemakkelijk onthuld.

Een belangrijke vooruitgang voor de analyse van heterogene biologische monsters op deze schaal is onlangs gemaakt met de ontwikkeling en toepassing op het gebied van eiwit aggregatie van infrarood nano spectroscopie (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Deze innovatieve methode exploiteert de combinatie van de ruimtelijke resolutie van AFM (~ 1 − 10 nm) met de chemische analyse kracht van IR. De AFM-IR-techniek is gebaseerd op de meting van het fotothermisch geïnduceerde resonantie-effect dat wordt aangedreven door een IR-laser, en op de meting van de thermische expansie van het onderzochte monster door de AFM-tip. Het monster kan worden verlicht door de IR-laser direct vanaf de bovenkant of van de bodem in totale inwendige reflectie, net als bij conventionele infraroodspectroscopie24,42,52,53 . De IR-laser kan worden gepulseerd met typische frequenties in de volgorde van honderden kilohertz (1 − 1000 kHz) en afgestemd op een breed spectrum bereik, meestal tussen 1000 − 3300 cm-1. Hoewel de laserbron een oppervlakte van ~ 30 μm diameter bedekt, wordt de ruimtelijke resolutie van de AFM-IR-techniek nominaal bepaald door de diameter van de AFM, die de lokale thermische expansie van het systeem detecteert. AFM-IR is goed geschikt om biologische monsters te bestuderen omdat het IR-signaal evenredig is aan de dikte tot 1 − 1,5 μm, en de resulterende IR-spectra zijn in het algemeen in overeenstemming met de overeenkomstige FTIR-transmissie Spectra13,54 ,55. Om deze reden, gevestigde analysemethoden in spectroscopie kunnen gemakkelijk worden toegepast, zoals de studie van chemische verschuivingen, verandering van de band vorm en de-convolutie door tweede derivaten analyse52. In het algemeen, het combineren van de ruimtelijke resolutie van de AFM met de chemische herkennings kracht van IR-spectroscopie, biedt AFM-IR de gelijktijdige verwerving van een breed scala aan morfologische, mechanische en chemische eigenschappen van een monster op nanoschaal.

Hier illustreren we een protocol voor de karakterisering van het proces van eiwit aggregatie die de combinatie van in vitro fluorescentie testen, hoge resolutie AFM beeldvorming en nanoschaal AFM-IR exploiteert. Deze gecombineerde aanpak heeft al voortreffelijke resultaten opgeleverd bij het bestuderen van de chemische en structurele eigenschappen van individuele microdruppeltjes gevormd door eiwit aggregaten, in de studie van vloeistof-vloeibare eiwit fase scheiding, en in onderzoek naar de heterogeniteit en biofysische eigenschappen van individuele geaggregeerde soorten op de nanoschaal23,26,38,45,50,53, 56,57.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. aggregatie-assays op fluorescentie plaat lezers

Opmerking: het hier beschreven protocol is een voorbeeld van hoe de aggregatie van elk eiwit of peptide door chemische kinetiek te bestuderen. In het bijzonder, het beschrijft een geoptimaliseerde protocol voor het bestuderen van de aggregatie van de Aβ 42 peptide, die is betrokken bij het ontstaan en de progressie van de ziekte van Alzheimer58,59. Een soortgelijk protocol kan worden aangepast en aangenomen om de aggregatie van elk eiwit of peptide te bestuderen.

  1. Verkrijg een zeer zuivere monomere oplossing van Aβ 42 door middel van ionenwisseling en grootte-uitsluitings chromatografie technieken om eiwit fracties met Aβ 42 te onderscheiden, en om de monomere fractie te isoleren van andere geaggregeerde vormen van Aβ 42 verkregen58 , 59.
  2. Verdun de Aβ 42 peptide in 20 mM natriumfosfaat buffer, 200 μM EDTA bij pH 8,058 tot een gewenste eindconcentratie variërend van 1 − 5 μM, in 1,5 ml laagbind buisjes. Monsters die worden verzameld voor AFM-metingen mogen niet de fluorescerende kleurstof bevatten die wordt gebruikt in de aggregatie test (thioflavine T, ThT), omdat deze artefacten kan introduceren tijdens de monster depositie voor AFM-analyse. Bereid dus triplicaten van twee identieke oplossingen voor: i) de eerste bevattende monomere Aβ 42 om het aggregatieproces door de AFM te volgen; II) de tweede met de Aβ 42 monomere met een toevoeging van 20 μM ThT als een Tracer om de kinetiek van aggregatie te bewaken.
    Opmerking: het is belangrijk om de stappen 1,1 en 1,2 op ijs uit te voeren. Deze procedure is ervoor te zorgen dat de monomere Aβ 42-oplossing niet wordt samengevoegd totdat deze in de plaat lezer is geïnitieerd. Bij het hanteren van monsters is zorgvuldige pipetteren essentieel om te voorkomen dat er luchtbellen worden ingevoerd die van invloed kunnen zijn op het eiwit monster.
  3. Pipetteer 80 μL van elk monster in elke put van een 96-goed, half-gebied plaat van zwart polystyreen met duidelijke bodem en niet-bindende oppervlakken.
  4. Sluit de plaat af met een folie om de verdamping van het monster tijdens de aggregatie te minimaliseren.
  5. De temperatuur van de plaat lezer wordt op 37 °C.
  6. Stel het aggregatie protocol in om fluorescentie metingen te lezen op vaste tijdpunt intervallen, bij een excitatie golflengte van 440 nm en een emissie golflengte van 480 nm. De aggregatie moet worden geïnitieerd in rust omstandigheden.
  7. Plaats de plaat in de plaat lezer.
    Opmerking: het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het hanteren van de plaat, om ervoor te zorgen dat de aggregatie niet wordt geactiveerd voordat de plaat lezer begint. Gebruik de instellingen voor versterkings aanpassing om de fluorescentie van elk monster optimaal af te lezen.
  8. Start de meting.
    Opmerking: het aggregatie experiment wordt afgesloten wanneer de ThT fluorescentie sigmoïdale curve een plateau58bereikt.

2. monstervoorbereiding voor AFM-en nano-IR-metingen

  1. Lijm de hoogste kwaliteitsklasse v1 mica disc op een hoogwaardige magnetische roestvrijstalen schijf met zelfklevende tabs of dubbelzijdige tape.
  2. Etch mica door een stukje plakband op het mica-oppervlak te plaatsen en de bovenste laag van het mica te trekken. Deze procedure zal een schoon, atomisch plat oppervlak produceren, geschikt voor monster depositie.
    Opmerking: geëtste ondergrond moet gelijkmatig en glad zijn.
    Let op: raak of adem niet direct boven vers geëtste mica, omdat dit artefacten zal introduceren.
  3. Pauzeer/stop de plaat lezer meting om het tijdpunt van belang te verzamelen tijdens het aggregatieproces van het eiwit.
  4. Verwijder de afdichtings folie en verzamel 10 μL aliquot van de monsters zonder ThT van de put in een 1,5 mL low-BIND buizen.
  5. Stort de 10 μL van het monster op het vers geëtste mica. Voor AFM-IR metingen moeten monsters worden afgezet op vers gestripte gouden ondergrond.
  6. Inincuberen de oplossing op het mica gedurende 1 minuut om fysisorbtion toe te staan.
    Opmerking: een langere incubatietijd zou een betere absorptie op het oppervlak mogelijk maken, maar kan leiden tot kunstmatige zelforganisatie en zelf montage25. Om deze effecten te voorkomen, kan spray depositie worden benut25.
  7. Spoel driemaal met 1 mL ultrazuiver water.
  8. Droog onder een zachte stikstofstroom om het monster in de lucht omgeving te meten.

3. AFM beeldvorming van de morfologie van eiwit aggregaten

Opmerking: morfologie metingen kunnen zowel in de contact-als de dynamische modus worden uitgevoerd, in de volgende stappen wordt de laatste beschreven omdat het laterale krachten vermindert om de 3D-morfologie van het monster met een hoge resolutie te meten. AFM-IR-metingen worden uitgevoerd in de contact modus om de AFM-IR-signaal-ruis verhouding te verbeteren.

  1. Schakel het AFM-systeem ten minste 30 minuten voor de metingen in om het systeem in staat te stellen thermische stabiliteit te bereiken. Klik op Setupen vervolgens op probe. In probe Change venster klik op Next om Z, focus stagevoor te bereiden.
  2. Schakel de AFM-schakelaar (indien ingeschakeld) uit. Ontgrendel de Dovetail sloten, koppel de kop los van het systeem en in probe Change venster klik op volgende.
  3. Monteer de AFM-cantilever op de sonde houder. Sluit de kop aan op het systeem en vergrendel de Zwaluwstaart sloten.
    Opmerking: optimale cantihefbomen voor het bestuderen van biologische monsters in dynamische modus AFM hebben een veerconstante variërend tussen 2 − 40 N m-1 en een Apex radii variërend tussen 2 − 8 nm14.
  4. Schakel de AFM-laserstraal schakelaar en in probe Change venster klik op volgende.
  5. Klik in het pop-upvenster op Nee als het type Cantilever niet is gewijzigd. Pas de optische uitlijningsknoppen aan om de cantilever te vinden. Pas de scherpstelling op de cantilever aan en klik op volgende.
  6. Klik in het pop-upvenster op Ja als de focus op de cantilever ligt.
  7. Plaats de laserstraal aan het uiteinde van de cantilever met behulp van de knoppen die de positie van de detectie Laser bepalen. Maximaliseer het totale signaal gemeten door de vier-Kwadrant fotodiode tot ten minste > 1 V met behulp van de knoppen die de positie van de afbuig laserstraal op de positie gevoelige fotodiode (PSPD) regelen. In sonde wijzigen venster klikt u op volgende en vervolgens op sluiten.
  8. Wacht 15 minuten voor de cantilever om thermische stabiliteit te bereiken. Pas indien nodig de positie van de afbuig laserstraal op het PSPD aan.
  9. Klik op NCM sweep, kies gewenste amplitude van de oscillatie, klik op gebruik fase, klik op auto en Tune de cantilever dicht bij het maximum van de eerste vrije resonantie van oscillatie, die is van ongeveer 300 kHz voor een Cantilever met een veerconstante van 40 N m-1.
    Opmerking: het tunen van de cantilever uit het maximum van zijn vrije resonantie verzekert een hogere stabiliteit van de metingen14.
  10. Plaats het monster op de monsterhouder. Kies geschikte beeldvormings parameters. De typische scansnelheid is 0,3 − 1,0 Hz voor een scangebied van 1 x 1 μm2 tot 5 x 5 μm2. Typische resolutie nodig is tussen 256 x 256 en 1024 x 1024 pixels. Klik op scangebied om de scan grootte en het pixel nummer te kiezen.
  11. Focus de optische weergave op het monster. Klik op aanpak om het monster oppervlak te benaderen. Zodra de aanpak is voltooid, klikt u op Lift 100 μm om de AFM-Tip 100 μm boven het oppervlak van het monster te stijgen. Klik op uitvouwen op de optische afbeelding van het voorbeeld. Klik op de focus stage balk om de weergave scherp te stellen op het oppervlak van het voorbeeld.
  12. Gebruik de pijlen om te bewegen in de regio van het belang van de steekproef. Betrek het oppervlak door op de approach -knop te drukken. Klik op de knop regel scan en controleer of de punt het oppervlak goed volgt, indien nodig, pas het ingestelde puntaan.
  13. Begin met het beeldoppervlak te Imaging door op de knop scannen te drukken. Bij beeldvorming, om grote beeld kracht te vermijden en consistentie van binnen onafhankelijke monsters te behouden, moet een constante regime van faseverandering worden gehandhaafd dat niet hoger is dan Δ20 °42.
  14. Voer de bestandsnaam in en kies base directory waar de verworven afbeelding wordt opgeslagen.

4. infrarood nano spectroscopie metingen van eiwit aggregaten

  1. Schakel het AFM-IR-systeem en de infrarood (IR) laser60 30 − 60 minuten in voor metingen voor thermische stabilisatie. Typische lasers voor AFM-IR instrumenten zijn optische parameter oscillatoren (OPO) en Quantum Cascade lasers (QCL).
  2. Open de ingebouwde software om het instrument te bedienen. Klik op bestand en vervolgens op Nieuw om een nieuw nanoir bestand te openen. Druk op de knop Initialiseer om het AFM-IR systeem te starten.
  3. Open het instrument deksel en monteer op het AFM-IR systeem een met silicium goud gecoate sonde met een nominale straal van 30 nm en een veerconstante van 0,2 N/m om het monster in de contact modus te meten.
  4. Klik op laden in de sectie AFM sonde en vervolgens volgende. In focus op sonde sectie Klik op de pijlen om de camera op de cantilever scherp te stellen. Gebruik in het gedeelte voorbeeld XY-bewegingde pijlen om de Kruis lucht aan het einde van de cantilever te plaatsen.
  5. Draai de knoppen die de positie van de detectie Laser regelen om de laser aan het uiteinde van de cantilever te positioneren. Draai de Laser knoppen om de door de vier Kwadrant fotodiode gemeten som te detecteren en te maximaliseren tot een waarde ≫ 3 v. Draai aan de afbuig knop om de afbuiging van de cantilever af te stellen op-1 v en klik vervolgens op volgende. Sluit de afdekking van het apparaat.
  6. In de sectie focus op monster gebruik de pijlen om de camera scherp te stellen op het monster. Dan, in het gedeelte sample XY beweging gebruik maken van de pijlen om te bewegen in het gebied van belang van het monster en klik op aanpak en Engage.
  7. In het Microscoop venster selecteert u als invoer de kanalen van belang om de biofysische eigenschappen van het monster in kaart te plaatsen. Kies in het bijzonder hoogte voor morfologie, AMPLITUDE 2 voor IR-absorptie en PLL-frequentie om de contact resonantie van de tip-sample te kaart.
  8. Gebruik in de sectie AFM scan van het venster Controls soortgelijke parameters als in sectie 3 (d.w.z. scansnelheid 0,1 − 1,0 Hz, tussen 256 x 256 en 1024 x 1024 pixels). Kies als waarde van de winsten volgens monster ruwheid: integraal I = 1 − 10 en proportioneel P = 10 − 30. Klik vervolgens op scannen om een morfologie kaart te verwerven.
    Opmerking: de morfologie kan op dezelfde manier worden gemeten in de dynamische tapmodus, maar AFM-IR-metingen worden hier uitgevoerd in de contact modus om hogere signaal-ruis verhoudingen te hebben.
  9. Nadat het in kaart brengen van de morfologie is voltooid, klikt u in het Microscoop -venster op de hoogte toewijzing om de sonde op de bovenkant van een aggregaat te positioneren. Klik vervolgens in het Nanoir -gedeelte van het bedienings venster op Start IR om het monster te verlichten met de IR-laser.
  10. Om de infrarood laser op de cantilever te concentreren, klikt u op optimalisatie. Schrijf in dit venster een vibratie waar het monster een hoge extinctie zal hebben en klik op toevoegen. Voor eiwitten is een typische waarde 1655 cm-1. Klik op scannen om de IR-laser positie te vinden en klik op bijwerken om de positie ervan uit te lijnen met de Cantilever. Sluit het venster.
  11. In de sectie Algemeen van de nano IR -instelling schrijft u een vibratie waarbij een hoge extinctie in het relatieve veld wordt verwacht. Vervolgens Deactiveer de band pass filter optie en kijk naar de meter lezing en de Fast Fourier transformatie (FFT) van de cantilever reactie. Verplaats de groene cursor in het FFT-venster om de resonantie frequentie van de cantilever te lezen. Een typische waarde van de FFT van de resonantie van de cantihefbomen is rond de 300 kHz. Schrijf deze waarde voor de resonantie frequentie in de sectie Algemeen van het veld freq. Centre en gebruik een freq. Window van 50 kHz.
    Opmerking: Selecteer een laser vermogen dat laag genoeg is om de meter uitlezing niet te verzaderen en om vervorming te hebben in de cantilever respons en om het monster niet te oververhitten.
  12. Klik op het Laser Pulse Tune-venster om de resonantie Enhanced-modus te gebruiken. Kies een frequentie centrum van 300 kHz, een tune range van 50 kHz en een Duty Cycle van de laser van 5%. Klik op verwerven om de Pulsfrequentie van de laser te vegen. Door de cursor in de grafiek te gebruiken, stemt u de laserpuls af op de frequentie van de mechanische respons van de thermische expansie van het monster die het IR-licht absorbeert. Selecteer vervolgens de optie PLL om de contact resonantie tussen het monster en de tip te bewaken. Druk op de Zero -knop in het PLL-venster en vink Enable aan om de contact resonantie van de sample-tip te volgen. Kies een integrale versterking I = 0,5 en proportionele versterking P = 10. Sluit het venster.
  13. Open opnieuw het optimalisatie venster en zoek de positie van de IR-laser voor ten minste 3 golf die overeenstemmen met de belangrijkste extinctie banden van het monster (amide band I-II-III) en voor ten minste één vibratie voor elke chip van de laser.
  14. Klik op tools | IR-achtergrond kalibratie | Nieuw. Selecteer in het venster het spectroscopische gebied van belang (1800 − 1200 cm-1 om eiwit monsters te bestuderen); Kies dezelfde Pulsfrequentie als bepaald in stap 4,12 en een Duty Cycle van 5%; Klik op snelle acquisitie en selecteer de laser snelheid, het typische bereik voor een Quantum Cascade laser is tussen 20 − 500 cm-1. Klik op verwerven om de IR-laser achtergrond te meten. Dit achtergrond spectrum zal worden gebruikt voor het normaliseren van gemeten nanoschaal gelokaliseerde spectra. Sluit het venster.
    Opmerking: als een snelle geavanceerde laser-en resonantie modus niet beschikbaar is, slaat u stap 4,12 over en selecteert u getrapte spectra in plaats van snel in zowel de achtergrond als de IR spectra -acquisitie Vensters. Eén geaggregeerde gevoeligheid wordt echter niet bereikt.
  15. Kies in de IR spectra -instellingen een IR-spectrum resolutie tussen 1 − 4 cm-1 en een aantal CO-gemiddelden van minimaal 64x. Klik op verwerven om een gelokaliseerd IR-spectrum van nanoschaal in het eiwit bereik te meten (1800 − 1200 cm-1).
  16. Voor het verwerven van een nanoschaal opgeloste chemische kaart, selecteer IR imaging Option, kies een vibratie (bijvoorbeeld 1655 cm-1 voor amide band I) en klik op scannen in het venster AFM scan .
  17. Zodra de toewijzing is voltooid, gaat u naar bestand en slaat u de metingen op. Voor het analyseren van de verworven kaarten van de morfologie, contact-resonantie en chemie, evenals de nanoschaal gelokaliseerde spectra, gebruik maken van de ingebouwde AFM beeldverwerking software. Spectra en afbeeldingen kunnen worden opgeslagen als. CSV-of. axz-bestanden voor verdere gedetailleerde analyse met commerciële software.

5. beeldverwerking en analyse van dwarsdoorsnede afmetingen

  1. RAW-afbeeldingen afvlakken14,17,19,41,42,59 met ingebouwde AFM-software voorbeeld verwerking of commerciële software.
    Opmerking: de aggregaten moeten worden gemaskeerd van de berekening om artefacten van analyse en onderschatting van hun gemeten hoogte te vermijden.
  2. Het afvlakken van de afbeelding met 0 order vlak past aftrekken.
  3. De afbeelding per vlak afvlakken en vervolgens regel voor regel bij een 1St regressie volgorde, wordt de tweede stap herhaald totdat de platte basislijn in het lijn Profiel van de afbeelding is bereikt.
  4. Als het monster erg druk is, bevat uitzonderlijk hoge aggregaten of scanner boog artefact aanwezig is, afvlakken afbeelding met behulp van 2ND regressie volgorde passen.
  5. Meet de totale hoogte en breedte van een lijn profiel dat loodrecht op de fibril as14,17,19,41,42,59wordt genomen.
  6. Meet de fibril lengte evenwijdig aan de fibril as14,17,19,41,42,59.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een representatieve tijdsduur van Aβ 42 aggregatie, zoals gemeten door de fluorescentie test ThT, wordt weergegeven in Figuur 1. Het aggregatieproces wordt meestal gekenmerkt door een sigmoïdale curve, waarbij een lag-fase in eerste instantie wordt waargenomen, en wordt gevolgd door een steile groeifase, voordat de curve een plateau bereikt wanneer een evenwichtstoestand wordt bereikt6,7 , 58. het i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eerste cruciale stap in dit protocol is de bereiding van monomere eiwitten, zoals in het geval van een Aβ 42-oplossing zoals beschreven in de stappen 1,1 en 1,2. Het is essentieel om het aggregatieproces te initiëren van een zeer zuivere monomere oplossing, aangezien de aanwezigheid van oligomere of geaggregeerde soorten kan resulteren in een slechte reproduceerbaarheid van de aggregatie kinetiek58, en artefacten in de AFM induceren metingen (bijv. fibrillar-soorten zullen zichtbaar zijn in de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken de Zwitserse nationale Stichting voor wetenschap (SNF) voor de financiële steun (subsidie nummer P2ELP2_162116 en P300P2_171219), het Darwin College, Erasmus +-programma voor de financiële ondersteuning (subsidie nummer 2018-1-LT01-KA103-046719 -15400-P3) en de onderzoek dat tot deze resultaten leidt, heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad uit hoofde van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (KP7/2007-2013) via de ERC grant PhysProt (overeenkomstnummer 337969), de Newman Foundation (T.P.J.K.) en de Cambridge centrum voor Misvouwen ziekten (c., M.V., en T.P.J.K.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AFM-IR systeemAnasys InstrumentsnanoIR 2 of 3Systemen om thermische uitzetting in contact en resonantiemodus te meten
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS MicroplateCorning3881
Corning Microplate Aluminium Sealing TapeCorning6570
Dubbelzijdige zelfklevende schijvenAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101Platereader
Mica schijf 10mm V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 AFM systeemPark SystemsN/AAtomaire krachtmicroscoop
Platypus Ultra-Flat Gouden ChipsPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantileversPark SystemsPPP-NCHR-10
Protein LowBind buizen, 2,0mLEppendorf30108132
Silicion goud gecoate cantileversAnasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mmAGAR ScientificAGF7001

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926(2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541(2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101(2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225(2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9(2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903(2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

AFM IRmorfologische analysestructurele eigenschappenchemische eigenschappenneurodegeneratieve ziektenamylo de oligomerenenkelvoudige molecuulmethoden

Gerelateerde artikelen