Nest Building Behavior als een vroege indicator van gedrags tekorten bij muizen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om nest Building behavior in muizen te kwantificeren, waarvan bekend is dat ze zijn aangetast door verschillende neurologische aandoeningen en ziekten. Dit Protocol onderzoekt het nut van vier materialen en biedt de mogelijkheid om de Rater-overeenkomst te kwantificeren bij het scoren, waardoor de geldigheid en betrouwbaarheid van de test worden verbeterd.

Samenvatting

Nest Building is een aangeboren gedrag bij mannelijke en vrouwelijke knaagdieren, zelfs wanneer het wordt verhoogd in laboratorium instellingen. Als zodanig, veel onderzoekers bieden knaagdieren synthetische en/of natuurlijke materialen (zoals bindgaren, weefsel, katoen, papier, en hooi) als een meter van hun algehele welzijn en als een aanvullende beoordeling om te voorspellen van de mogelijke afname van de cognitie. Wijzigingen in het geneste gedrag, zoals het niet maken van een nest, duiden meestal op een verandering in de gezondheid of het welzijn. Daarnaast is het geneste gedrag gevoelig voor veel milieu-en fysiologische uitdagingen, evenals veel genetische mutaties onderliggende pathologische ziektetoestanden. Het volgende protocol beschrijft een paradigma gedragsmodel dat het gebruik van vier typen nest materiaal onderzoekt. Daarnaast maakt het protocol gebruik van intraclass correlaties om aan te tonen dat de betrouwbaarheid van de Inter-Rater hoger is wanneer nesten zijn opgebouwd uit versnipperd papier in vergelijking met andere veelgebruikte nest materialen zoals katoenen vierkantjes, papier wendingen en zachte COB Beddengoed. De gekozen methodologie en statistische overwegingen (d.w.z. intraclass correlatie) voor deze test kunnen van belang zijn voor degenen die experimenten uitvoeren om de kwaliteit van het leven van muizen te beoordelen.

Inleiding

Nest Building is een aangeboren gedrag in veel dieren zoals vogels, vissen, knaagdieren en mensapen, en het trekt meer aandacht voor zijn potentiële nut in de studie van neurologische ziekten en aandoeningen gekenmerkt door verminderde welzijn en verminderde activiteiten van Daily Living¹. Muizen, zowel mannelijke als vrouwelijke, bouwen op soortgelijke grootte nesten voor reproductieve doeleinden, warmte behoud, en onderdak; nog belangrijker, ze blijven doen, zelfs wanneer verhoogd in laboratorium instellingen². Hess, Petrovich en Goodwin³ beweren dat biologisch geschikte stimuli van essentieel belang zijn om biologisch geschikt gedrag zoals nesten te induceren; echter, een verscheidenheid aan natuurlijke en kunstmatige materialen, zoals hooi, hennep, katoen bindgaren, papier strips, katoen tandheelkundige ballen, en geperst katoen pleinen, zijn gebruikt om te beoordelen nest Building Behavior². Veranderingen in dit nestgedrag (d.w.z. het niet aanmaken van een nest uit het meegeleverde materiaal) duiden in het algemeen op een verandering in de gezondheid of het welzijn. In de meeste gevallen wordt een gebrek aan nest-gebouw toegeschreven aan verschillende factoren die een negatief effect hebben op het welzijn. Dergelijke voorbeelden die de kwaliteit van het nest-gebouw in muizen effectief hebben verlaagd, omvatten extreme temperaturen; pijnlijke stimulatie; geïnduceerde ziekte en infectie; genetische mutaties; en hersenlaesies in de mediale vooroptische gebieden, septum, en Hippocampus^4,5,6.

De ziekte van Alzheimer is een progressieve neurodegeneratieve ziekte gekenmerkt door verlies van hersenweefsel, accumulatie van extracellulaire amyloid-β plaques, en intracellulaire neurofibrillaire tangles samengesteld hyperfosforyleerd microtubulus-geassocieerde eiwitten, tau⁷. Bovendien, de ziekte van Alzheimer wordt gekenmerkt door, met name, tekorten in het leren en het geheugen en de beperkingen van de activiteiten van het dagelijks leven. Bij muizen worden activiteiten van het dagelijks leven vaak onderzocht via het circadiane wiel-Running^8,9,10,11, hoewel nieuwe alternatieven, zoals nesten, steeds populairder worden. Nesten is aangetoond dat ze gevoelig zijn voor manipulaties (bijv. genetische mutaties, milieustressoren) die zijn geïdentificeerd als risicofactoren en/of oorzaken van de ziekte van Alzheimer. Als zodanig, nesten kan worden gebruikt als een aanvullende of complementaire assay in veel muizenstammen die modelleren van deze kenmerken van de ziekte van Alzheimer. Bijvoorbeeld, diaken en collega's¹² gemeten nest gebouw van Tg2576 muizen met de Zweedse amyloïde precursor proteïne (APPswe) en presenilin 1 (PS1) genetische mutaties. De kwaliteit van nesten gebouwd door groep-gehuisvest Tg2576 muizen was aanzienlijk slechter dan wild type controles op zowel 3-en 12-maanden oud. In overeenstemming met deze bevindingen, Filali et al.¹³ gemeld dat afzonderlijk gehuisvest APPswe/PS1 mannelijke muizen gegeven twee stukken van 5 x 5 cm katoen gebouwd aanzienlijk armere nesten als gewaardeerd op een schaal van 1-5 (1 = nestlet niet aangeraakt, 5 = een in de buurt van perfect nest). Transgene muizen gebouwd consequent slechter nesten op 6-, 9-, en 12-maanden van leeftijd in vergelijking met hun wild type tegenhangers, en in sommige gevallen, de appswe/PS1 muizen helemaal niet om een nest uit de meegeleverde katoen te bouwen.

Uit vorig onderzoek van ons lab is gebleken dat wild type C57BL/6J-muizen significant betere nesten van katoenen vierkantjes bouwen in vergelijking met CRND8 en CRND8/E4-muizen⁹. Echter, de meerderheid van de experimenten met behulp van geperste katoenen pleinen lijken variabel te zijn, waarbij wild type muizen niet in staat zijn om verwachte hoge scores te tonen in vergelijking met transgene muizen die naar verwachting zeer lage scores vertonen in Nesting², wat deels kan leiden tot een gebrek aan verschillen in geschatte parameters (d.w.z. gemiddelde verschillen) en statistische significantie. Het gebrek aan verschillen kan deels te wijten zijn aan onvoldoende veroudering van muizen of de tijd die wordt toegewezen voor het nesten. Als alternatief kan nest materiaal een extra uitdaging zijn, wat resulteert in meer variabiliteit als gevolg van de methodologische voorkeuren van onderzoekers in de hoeveelheid en het type materiaal, die zelfs kunnen communiceren met de muis stam. Robinson-Junker en collega's¹⁴ hebben bijvoorbeeld verwerkte of onverwerkte bedding materiaal van verschillende groottes (d.w.z. kleine of grote vlokken) geleverd aan C3H/hencrl-muizen en Balb/canncrl-muizen, die vaak worden waargenomen, respectievelijk als slecht en sterk nest Builders. Bij het geleverde onbewerkt beddengoed, C3H muizen gebouwd minder complex, maar vergelijkbaar in kwaliteit nesten in vergelijking met die van BALB/c muizen.  Evenzo vergeleek Martin en collega's¹⁵ de nest complexiteit van verschillende broed materialen die werden gegeven aan herten muizen, een verre verwant van de Mus musculus -soorten die verschillende evolutionaire verschillen hebben (d.w.z. meer kans om te graven in bomen en onderborstel en zijn actiever in gevangenschap), maar krijgen soortgelijke veehouderij zorg als gewone laboratorium muizen en bouwen nesten uit alle beschikbare zachte, vezelachtige materiaal^16,17,18.  Vrouwtjes en fokkers met pups in de huis kooi gebouwd complexere nesten dan mannetjes, en de auteurs suggereren dat deze gedragsverschillen kunnen worden veroorzaakt door de geassocieerde veranderingen in progesteron concentraties in herten muizen¹⁵. Nog belangrijker, muizen gebouwd complexere nesten samengesteld uit bruin papier, gevolgd door katoen pleinen en katoen cilinders, en de minst complexe nesten werden opgebouwd uit wit papier en verspreide mini-katoen pleinen.

Ondanks de groeiende populariteit van nesten worden overwegingen met betrekking tot wetenschappelijk geldige, kosteneffectieve en tijdgevoelige praktijken minimaal besproken. Gezien de bovengenoemde methodologische en economische uitdagingen onderzoekt dit protocol het nut van verschillende nest materialen-katoenen vierkantjes, papier wendingen, versnipperd papier en verwerkte beddengoed-in nestgedrag. Concreet hebben we alle nest materialen geleverd aan zowel verouderde C57BL/6J wild type controles als de ziekte van Alzheimer APOE E4 muizen om potentiële genotype te onderzoeken door materiaal interacties in de nest kwaliteit. Daarnaast probeerde het experiment de betrouwbaarheid te beoordelen van nesten die uit verschillende materialen zijn opgebouwd. Dit protocol demonstreert de superioriteit van één nest materiaal in dit monster – versnipperd papier – in termen van de nest-kwaliteit en de scorer-overeenkomst, met de bedoeling de geldigheid en betrouwbaarheid van de nest assay te verbeteren.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de George Mason University institutionele Dierenzorg en gebruik Comité en zijn in overeenstemming met de richtlijnen die zijn uiteengezet door de beoordeling en accreditatie van laboratoriumdieren zorg.

1. dieren en overwegingen voorafgaand aan de beoordeling

1. Gebruik voor dit protocol Adult, 9-12-month-old C57BL/6J (n = 10) (stock # 000664) wild type muizen en ApoE E4 muizen (n = 11) van een hemizygoot J20 (Stock #006293) x homozygoot apoe E4 (Stock #012307) kruis.
2. In de woonkamer, groep-huis muizen met littermates van hetzelfde geslacht met passende verrijking (bijvoorbeeld, voor dit protocol, muizen werden voorzien van een loopwiel, iglo, en een klein nylon kauw speelgoed). Groep-huis 4-6 vrouwelijke muizen, en 4 mannetjes in een 356 mm L x 485 mm W x 218 mm H huis kooi.
   Opmerking: onderzoekers kunnen overwegen om strategieën voorafgaand aan en/of na het nesten te implementeren om kooi-mate agressie te voorkomen wanneer muizen opnieuw worden geïntroduceerd na het nesten van proeven. Dergelijke strategieën kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, dagelijkse behandeling voorafgaand aan gedragstesten om muizen beter te acclimeren tijdens gedragstesten, onderzoekers en personeel van de veehouderij¹⁹, scheiden en individueel huisvesting agressieve muizen, of het verminderen van het aantal muizen in de homecage²⁰, afhankelijk van de ernst van de in-kooi gevechten, waargenomen wonden²¹, enz.

2. kamer en nest opstelling

1. Zorg ervoor dat elke muis vier tests voltooit (1 materiaal per proef). Randomiseren van de volgorde van het nesten van materiaal voor elke muis om te voorkomen dat een order effect.
2. Maak de kooien klaar in een aparte testruimte. Registreer omgevingscondities (bijv. 22,2 – 22,3 °C, 45-47% luchtvochtigheid, licht op 9:00 AM – 9:00 PM) zodat ze consistent zijn in verschillende proeven en identiek zijn aan de woonkamer. Geef voedsel en water ad libitum.
   1. Wijs elke muis een willekeurig identificatienummer (ID) of letter toe. Bevestig de willekeurige identificatiekaart aan een kooi van 29,2 x 18,4 cm.
   2. Noteer de originele dierlijke ID/tag en andere noodzakelijke identificatie in een kolonie record om ervoor te zorgen dat assistenten en veeteelt personeel blind blijven voor de omstandigheden.
3. Willekeurig de plaatsing van de kooi in de testruimte zodanig dat wild type en transgene muizen niet ongepast gescheiden zijn (d.w.z. aan tegenoverliggende zijden van de kamer, op aparte planken, enz.).
4. Bereid het nest materiaal voor door de bodem van de kooi voldoende te bedekken. Gebruik ongeveer 100 g drooggewicht ronde beddengoed voor vierkante, twist, en versnipperd papier proeven, en ongeveer 100 g van de zachte COB beddengoed voor de zachte COB trial.
5. Als u een bekerglas gebruikt om het nest materiaal te dispergeren, vult u het bekerglas niet meer dan 100 ml met ronde bedding of zachte COB bedden.
6. Plaats het eerste nest materiaal in de sequentie voordat je de muis in de kooi introduceert. Dit protocol wordt gebruikt (1) een enkel geperst katoenen vierkant, (2) een enkele papieren twist, (3) 100g zachte COB bedding alleen (d.w.z. geen extra strooisel of nest materiaal toegevoegd), en (4) 2,5 g schoon (geen inkt), versnipperd wit printer papier gesneden in 5-7cm strips. De nest materialen dispergeren zoals weergegeven in Figuur 1 (baseline).

Figuur 1: kooi opstelling voor elk materiaal. Alle muizen voltooiden één proef met elk type materiaal voor een totaal van vier proeven. Corncob bedding bekleed de gehele bodem van de kooien met een papieren twist, een geperst katoenen vierkant en versnipperd papier. Zachte COB beddengoed was gelijkmatig verspreid over de kooi om muizen aan te moedigen om de kleine katoenen pleinen van de Corncob scheiden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. het nesten van een proef

1. Begin de eerste broedende proef op hetzelfde tijdstip van de dag aan het begin van de licht cyclus (bijv. 9:00 AM).
2. Breng de homecage met de muizen in de testruimte. Verwijder elke muis van de homecage en plaats deze in de toegewezen nest kooi met het materiaal dat al in de kooi is geplaatst. Retourneer de homecages naar de woonkamer.
3. Laat muizen 1 proef voor 24 uur ongestoord voltooien.
4. 24 uur na aanvang van de eerste proef, keert u terug naar de testkamer.
5. Verwijder voorzichtig de deksel van de kooi en foto van het nest van elke muis, het vastleggen van de toegewezen ID in de foto en het minimaliseren van het uiterlijk van alle materialen buiten de kooi.
   Opmerking: wacht totdat de muis uit het nest is verwijderd voordat je hem uit de kooi probeert te verwijderen. Het wordt sterk aanbevolen om het nest te fotograferen terwijl de muis in de kooi zit, maar van het nest. Als u probeert de muis uit de kooi te verwijderen voordat u fotografekt, kan dit ertoe leiden dat de muis wordt opgeschimpeld, waardoor het geneste materiaal op de bovenkant wordt verplaatst en wordt dispergeren.
6. Haal de muis voorzichtig uit de nest kooi en plaats deze in een tijdelijke kooi. Gooi het strooisel en alle nest materialen weg, vervang het strooisel en geef het volgende nest materiaal in de sequentie en breng de muis terug naar de nest kooi.
7. Herhaal zo nodig om scores te verkrijgen voor alle 4 proeven. Het wordt aanbevolen om versnipperd papier en de bijbehorende scoring criteria te gebruiken, hoewel onderzoekers wellicht geïnteresseerd zijn in het gebruik van de alternatieve materialen die in dit protocol worden besproken.
8. Als alle proeven zijn voltooid, keert u muizen terug naar hun huis kooien. Observeer de muizen op mogelijke agressieve gedragingen. Agressie kan optreden bij oudere wild type mannetjes.
   Opmerking: voor de toepassing van dit protocol werden muizen eenmaal getest op een leeftijd van ongeveer 9 – 12 maanden. Nesten moet worden uitgevoerd op verschillende leeftijden (d.w.z., op een vroegere leeftijd, afhankelijk van de gekozen stam, voorafgaand aan het begin van fenotypische eigenschappen) om de afname van de broedcapaciteit in de tijd te documenteren en de waarschijnlijke causatieve rol van neurodegeneratie aantonen.

4. scoren en beoordelen van de betrouwbaarheid van de Inter-Rater

1. Geef voor elk nest materiaal basislijn afbeeldingen aan ten minste 2 personen die blind zijn voor de studie. Hoewel dit niet vereist is, moet u ervoor zorgen dat de scorers bekend zijn met het concept van nesten. Geef bij het trainen van scorers een reeks voorbeeld nesten (bijvoorbeeld Figuur 2 voor versnipperd papier) om de scorers vertrouwd te maken met elk type materiaal (indien van toepassing) en de scoringscriteria.
   1. Evalueer elk nest op een schaal van 1 – 5 met behulp van de volgende schaal informatie (aangepast uit diaken, 2006)². Zie Figuur 2 als voorbeeld scoren met versnipperd papier.
   2. Wijs een Score van 1 toe wanneer het geraspte papier of de kleine vierkantjes verspreid bleven in de kooi, of het katoenen vierkant of de twist onaangeroerd bleef;
   3. Wijs een Score van 2 toe wanneer een deel van het materiaal in een nest werd geconstrueerd, maar meer dan 50% van het materiaal werd niet gebruikt voor de bouw van het nest (d.w.z. verstrooid gebleven of de meerderheid van het oorspronkelijke materiaal bleef onaangeroerd);
   4. Wijs een Score van 3 toe wanneer een merkbare nest werd gebouwd, maar er waren nog verschillende stukken verspreid;
   5. Wijs een Score van 4 toe toen bijna al het materiaal voor het nest werd gebruikt, maar er bleven weinig stukken materiaal verspreid of in de buurt van het nest;
   6. Wijs een Score van 5 toe wanneer al het materiaal is gebruikt om een herkenbaar nest te maken.
      Opmerking: scorers moeten pauzes nemen en de basislijn Foto's herzien om vermoeidheid en bias tijdens de scorings procedure te voorkomen. Scorers moeten geen scores met elkaar bespreken om bias te voorkomen. Scorers moeten de scores bespreken nadat het scoren is voltooid of als verdere discussie nodig is om de scores te wijzigen, waardoor problemen met de intraclass correlaties (ICC) kunnen worden opgelost. Intraclass correlaties wordt uitgevoerd met behulp van de stappen in paragraaf 4,2.

Figuur 2: voorbeeld van scoren met behulp van de criteria voor versnipperd papier, het voorkeurs materiaal. Van links naar rechts: 1 – het geraspte papier bleef onaangeroerd; 2 – een deel van het papier werd in een nest gebouwd, maar de meeste stukken bleven verstrooid; 3 – er werd een merkbare nest gebouwd, maar er waren nog verschillende stukken verspreid; 4 – de meeste stukken werden gebruikt voor het nest, maar sommige stukken waren verspreid in de buurt van het nest; 5 – alle stukken werden gebruikt om het nest te maken. Merk op dat in de Foto's het toegewezen nummer van het dier wordt getoond om onblindering te voorkomen. De kleur van de kaart is willekeurig. Onderzoekers moeten toestaan dat de muis in de kooi blijft om te voorkomen dat de muis wordt ontgaan, wat het nest mogelijk kan verspreiden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Verzamel en voer scores in en formatteren van het gegevensbestand, zodat de scores van elke scorer voor elk materiaal in afzonderlijke kolommen staan.
   Opmerking: als u aanvullend bestand 1gebruikt, houd er dan rekening mee dat het coderings script voor deze analyse gratis, open source software (bijv. IRR -pakket in rstudio)^22,23vereist. Het script verwijdert kopteksten en onderwerpen variabelen (dat wil zeggen, de bovenste rij en dierlijke Id's) voor het uitvoeren van de intraclass correlatie (ICC). Voer het script uit om een tweeweg, overeenkomst, gemiddelden metingen ICC door het markeren van de afgebakende sectie van de code en het raken van CTRL + ENTER of Command + Enter.
3. Vergelijk het ICC met de bestaande criteria^24,25,26. De ICC-waarden boven 0,80 komen meestal overeen met een sterke betrouwbaarheid van de Inter-Rater, waarbij scores op een bepaald tijdstip kunnen worden berekend (aanvullend bestand 2).
4. Gebruik dezelfde ICC-criteria voor de betrouwbaarheid van intra-Rater, die voor de eerste keer van belang kunnen zijn voor degenen die scoren.
   Let op: scorers moeten dezelfde gefotografeerde nesten scoren binnen een week na de initiële beoordeling. Ga voorzichtig te werk met gemiddeldengegevens wanneer ICC laag is, omdat dit gegevens kan scheeftrekken of null-bevindingen oplevert. Als de ICC-waarden laag zijn, kan er (1) extra training voor scorers nodig zijn, (2) misschien moeten scorers hun redenering voor nest scores bespreken, (3) een andere onafhankelijke beoordelaar kan nodig zijn om een vonnis te vragen met betrekking tot de scores, of (4) intra-Rater de betrouwbaarheid moet mogelijk worden beoordeeld. Als de betrouwbaarheid van de intra-Rater slecht is, kan een aanvullende opleiding of een andere scorer nodig zijn.

5. statistische overwegingen

1. Zo nodig statistische analyses uit te voeren. Voor gegevens die niet in strijd zijn met normaliteits veronderstellingen maar meerdere materialen gebruiken voor elke muis (d.w.z. een binnen-subjecten effect), gebruikt u een gemengde variantieanalyse (ANOVA).
   1. Als u codes gebruikt als aanvullende bestanden, download dan extra add-on pakketten die zijn gespecificeerd in het script^27,28,29,30.
   2. Als u een gemengde ANOVA uitvoert met behulp van het meegeleverde script, voert u het script uit om alle breedformaat-gegevensbestanden om te zetten in lange-opmaak (d.w.z. in plaats van variabelen die over kolommen worden herhaald, converteert u de cellen om te herhalen in rijen). Een voorbeeld van een gegevensbestand is opgenomen in dit manuscript om te laten zien hoe u een gegevensbestand converteert van breedbeeld naar lang formaat.
   3. De gemengde ANOVA uitvoeren, zoals gespecificeerd in het script. Houd er rekening mee dat als de test van de bolheid van Mauchly wordt geschonden, de correctie factoren zoals de Greenhouse-Geisser-correctie worden toegepast.
   4. Voer alle noodzakelijke posthoc-tests uit om de verschillen tussen factoren met meer dan 2 niveaus te onderzoeken, zoals gespecificeerd in het coderings script. Voer in dit voorbeeld Bonferroni posthoc tests uit om de verschillende soorten nest materiaal te vergelijken.
      Opmerking: als u slechts één nest materiaal gebruikt, neemt u geen factor binnen de onderwerpen op. Bij het verzamelen van gegevens op meerdere tijdstippen, echter, nemen deze herhaalde maatregelen alsof niveaus van een binnen-subjecten factor.
      Opmerking: in sommige gevallen, wild type muizen kunnen hebben perfecte scores en dus zal vertonen een plafond effect, leidt tot een niet-normale verdeling². Overweeg geschikte statistische tests (bijvoorbeeld niet-parametrische tests met alternatieve maatregelen van centrale neiging en dispersie), normalisatie methoden of robuuste benaderingen (gemengde-effect modellering voor herhaalde metingen) bij het analyseren van gegevens.

Resultaten

De resultaten van de vier verschillende nest materialen die worden geleverd aan wild type en APOE E4-muizen worden als volgt uitgelegd. Op basis van bestaande criteria toonde het ICC een sterke overeenkomst tussen alle drie de programmeurs voor alle vier de nest materialen (versnipperd papier ICC = 0,94; vierkant ICC = 0,91; bedding ICC = 0,87; twist ICC = 0,87); Daarom werden de drie scores samen gemiddeld om een enkele score voor elk geleverd materiaal te creëren. Een 2 x 4 gemengde ANOVA leverde een significant belangrijk effect op van genotype, F(1, 19) = 31,30, p < 0,01, ηp² = 0,62. In alle vier de geleverde materialen scoorde wild type muizen hoger op de nest-kwaliteit (3,18 ± 0,20) in vergelijking met APOE E4-muizen (1,98 ± 0,16). Daarnaast leverde de gemengde ANOVA een significant belangrijk effect op van materiaal, F(3, 57) = 57,48, p < 0,01, ηp² = 0,75. Uit paarsgewijze vergelijkingen met Bonferroni-correctie bleek dat het geraspte papier (4,11 ± 0,20) significant hoger was (p < 0,05) in kwaliteit dan het vierkant (1,95 ± 0,21), beddengoed (2,21 ± 0,21), of twist (1,94 ± 0,20) materialen, zonder verschillen tussen de vierkante, strooisel en twist materialen (alle p > 0,99). Er was geen significante interactie tussen genotype en materiaal. Gegevens worden weergegeven in Figuur 3.

Andere experimenten uit ons laboratorium hebben opgeleverd vergelijkbare resultaten in vroege onset modellen van de ziekte van Alzheimer. Bijvoorbeeld, zoals aangetoond in Figuur 4, 5,5-maand-oude P301L rTg4510 (htau) muizen gebouwd significant slechter nesten uit versnipperd papier in vergelijking met hun leeftijd overeenkomende wild type tegenhangers³¹. Evenzo, Dual J20 (hAPP)/htau en single htau muizen bouwden slechtere nesten uit versnipperd papier in vergelijking met hun wild type en CAMKIIa-promotor alleen tegenhangers, zowel op 3,5-als 7 maanden oud³² (gegevens niet weergegeven).

Figuur 3: nominale kwaliteit van nesten gemaakt van verschillende materialen geleverd aan wild type en ApoE E4 muizen. Een belangrijke invloed van genotype (* p < 0,01) toonde aan dat wild type muizen consequent betere nesten bouwden, gemaakt van het geraspte papier, geperste katoenen pleinen, papieren twist en zachte COB-bedding in vergelijking met APOE E4-muizen. Het belangrijkste effect van materiaal (* * p < 0,01) toonde ook aan dat nesten gemaakt van het geraspte papier hoger werden beoordeeld in kwaliteit in vergelijking met de drie andere materialen. Het versnipperde papier had de hoogste betrouwbaarheidsgraad van de Inter-Rater, zoals beoordeeld door ICC. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: versnipperde papier nesten gebouwd door wild type en htau muizen, aan of uit zink water. a) representatievenesten gebouwd door 5,5-maand-oude wild type-en htau-muizen, op controle (kraan) water of water aangevuld met 10 delen per miljoen zink (een biometal betrokken bij de ziekte van Alzheimer). Nesten werden gescoord op de 1-5 schaal met behulp van de gespecificeerde criteria. Van links naar rechts: wild type + zink water (4.54 ± 0.52); wild type + controle water (4.15 ± 0,80); htau + controle water (3,08 ± 0,64); htau + zink water (2.46 ± 0.97). B) een genotype *-water interactie heeft aangetoond dat htau-muizen op zink water significant slechter zijn gemaakt dan de andere groepen (*); Bovendien toonden eenvoudige effecten aan dat htau muizen op zink water slechter nesten dan htau muizen op controle water. Wild type muizen op controle water en zink water-gebouwde nesten van hogere, en vergelijkbare kwaliteit, in vergelijking met hun tegenhangers htau. Herdrukt uit Journal van de ziekte van Alzheimer, vol 64, Craven, KM, kochen WR, Hernandez CM, Flinn JM, zink Vererveert tau pathologie in een tau muis model, 671-630, copyright (2018), met toestemming van IOS druk op³¹. De publicatie is beschikbaar op IOS Press via http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Aanvullend Codeer bestand-nesten. R Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: AD Study nesten scores. CSV Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Nesten is een evolutionair belangrijk knaagdier gedrag en is gebruikt om de activiteit van het dagelijks leven en algemeen welzijn in muizen²te beoordelen. Het gemak om de test uit te voeren, de betrouwbaarheid en de gelaats geldigheid maken het nesten een praktische aanvulling op veel gedragstesten zoals Burrowing, circadiane ritme en verzorging. Maar, als nesten wordt meer algemeen gebruikt in het laboratorium, de verschillende combinaties te voeren, kwantificeren, en interpreteren van nesten toenemen. Als zodanig is verder onderzoek nodig om de beste methodologisch en praktisch gezonde procedures voor het nesten te onderzoeken, zodat de geldigheid en betrouwbaarheid van de test niet worden opgeofferd voor kosten, tijd van testen en andere procedures die de test last verminderen .

De kwaliteit van nest-gebouwen is inderdaad gevoelig voor het aanwezige type beddengoed en genotype. Over het algemeen bouwden wild type muizen significant betere nesten in vergelijking met APOE E4-muizen, ongeacht het nest materiaal; zowel wild type-als APOE E4-muizen bouwen echter aanzienlijk hogere kwaliteit nesten uit versnipperd papier in vergelijking met de drie andere geneste materialen. Andere studies bieden bevestigende bewijzen met betrekking tot het geraspte papier: muizen bouwden complexere nesten uit versnipperde papier stroken dan met geperste katoenen vierkantjes, weefsel en Aspen beddengoed³³. Bovendien zijn nesten vervaardigd uit versnipperde papier stroken kwalitatief geëvalueerd als meer "naturalistisch" dan die gemaakt van andere materialen, die worden gekenmerkt door de vorm van het nest zelf en de hoogte van de wanden rond de nest holte in om een koepel te vormen^6,33. Als zodanig is de selectie van het juiste materiaal voor deze assay van cruciaal belang om het natuurlijke gedrag in een relatief gecontroleerde omgeving beter te observeren, d.w.z. de laboratorium instelling. Belangrijker nog, hoewel dit protocol beoordeeld één keer te nesten op 9 – 12 maanden oud, we benadrukken dat nesten moet worden uitgevoerd op verschillende leeftijden. De eenvoud van dit protocol maakt het mogelijk om meerdere malen te worden uitgevoerd, idealiter vóór het begin van tekorten die neurodegeneratie begeleiden. Herhaalde metingen bieden de mogelijkheid om de waarschijnlijke causatieve rol van neurodegeneratie in verminderde broed baarheid te documenteren.

Natuurlijke nest gebouw is aangetoond dat verschillen tussen muizen van verschillende achtergrond stammen³⁴, en als zodanig, de algehele kwaliteit en vorm van het nest kan afwijken niet te wijten aan het transgen van belang, maar als gevolg van de achtergrond stam. Bijvoorbeeld, de voor ouders van C57BL/6 muizen werden beschouwd als "Hole" nesters, terwijl de voor ouders van BALB/C muizen werden beschouwd als "oppervlakte" nesters³⁵. Muizen op de C3H achtergrond of kruisen met deze stam, zoals de hybride C3H/he-C57BL/6 met E4 gebruikt in Graybeal et al.⁹ worden ook beschouwd als slechte nesters; Zo moeten onderzoekers sterk overwegen om besturings muizen op dezelfde achtergrond te gebruiken als transgene muizen, wat de directe, causatieve rol van het transgene (s) in het algemeen zou verbeteren, in plaats van de achtergrond, in neurodegeneratie en daaropvolgende tekorten in nest gebouw gedrag.

Sommige experimenten maken vaak gebruik van één scorer om de complexiteit van het nest kwalitatief te beoordelen; We maken echter het argument dat er meer scorers zijn, en nog belangrijker, dat de scorers blind zijn voor experimentele omstandigheden. Door deze aanpak gebruikten we drie onafhankelijke, blinde scorers en een intraclass correlatie om de overeenkomst tussen de scorers te beoordelen, die, met basisopleiding, hoge intraclass correlaties leverden die indicatief waren voor een hoge betrouwbaarheid van de Inter-Rater en een sterke overeenkomst over de nest-kwaliteit. Bovendien hadden de nesten van versnipperd papier en katoenen vierkantjes de hoogste intraclass correlaties, een indicatie van een sterkere overeenkomst en een grotere consistentie tussen de scorers. De sterke overeenkomst biedt ook een rechtvaardiging om de meervoudige scores samen te gemiddelde, een strategie die lukraak wordt geïmplementeerd in gedragsonderzoek. Hoewel deze strategie meer individuen vereist en, vermoedelijk, meer tijd om nesten te scoren, vermindert het effectief bias in kwalitatieve evaluaties zoals nesten.

De in deze test gebruikte broed materialen waren ongeveer gelijk in de prijs, behalve de zachte COB-bedding. Commercieel strooisel voor nesten kan economisch vindingrijk zijn voor sommige experimenteurs; echter, Martin et al.¹⁵ merk op dat katoenen pleinen, in vergelijking met andere materialen zoals geplisseerd papier, is een van de duurste materialen die beschikbaar zijn voor aankoop. Dit kan te wijten zijn aan eenvoudige beschikbaarheid, opslag en administratie, maar andere onderzoekers kunnen kiezen voor soortgelijke geldige en betrouwbare materialen, vooral wanneer ze worden uitgedaagd door grote aantallen dieren in een faciliteit, het aantal nesten proeven, tijdsbeperkingen voor het scoren van nesten en hoge kooi kosten. Zo kan versnipperd papier een meer haalbare en geschikte optie zijn. Bovendien kan het vastleggen van gegevens voor onze methode onmiddellijk worden uitgevoerd (d.w.z. scoren in persoon), hoewel Foto's sterk moeten worden overwogen om nesten te registreren, op te slaan en opnieuw te kwantificeren, indien gewenst met het oog op de beoordeling van Inter-en intra-Rater betrouwbaarheid op latere tijdstippen. Zoals opgemerkt, benadrukken we de opname van meerdere scorers voor "test, re-test"-praktijken om te beoordelen voor overeenstemming, omdat deze methodologisch verantwoorde procedures vaak over het hoofd worden gezien.

Concluderend zijn wij van mening dat de methodologie en statistische overwegingen (d.w.z. intraclass correlatie) voor deze test van belang kunnen zijn voor experimenten die de kwaliteit van het leven, algemeen welzijn en activiteiten van het dagelijks leven in muizen beoordelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Corncob bedding	Envigo	7092	1/8 inch bedding voor katoenen vierkantjes, versnipperd papier en papierdraaien voor proeven
Kastoen vierkantjes	Envigo	Iso-Blox
Diamantdraaien	Envigo	7979C.CS	Papierdraaien gebruikt in protocol
Muis - APOE4 e4	Jackson Laboratories	#012307	Homozygoot APEO4 e4 muis gekweekt met hemizygoot J20 muis
Muis - C57BL/6J	Jackson Laboratories	#000664	Wildtype muis voor controles
Muis - J20	Jackson Laboratories	#006293	Hemizygoot muis gekweekt met de homozygote APOE e4 muis om kruising te genereren
Rstudio	R Core Team	V1.1.463	Gedraaid met R versie 3.5.3 (2019-03-11) - "Great Truth". Opmerking: aanvullende R-pakketten zijn opgenomen in de verstrekte code en kunnen worden geïnstalleerd vanuit CRAN
Zachte Kolf	Envigo	7087C