Isolatie van specifieke neuron populaties van Roundworm Caenorhabditis elegans

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor eenvoudige isolatie van specifieke groepen van levende neuronale cellen die groen fluorescerende eiwitten uit transgene Caenorhabditis elegans lijnen uitdrukken. Deze methode maakt een verscheidenheid van ex vivo studies gericht op specifieke neuronen en heeft de capaciteit om cellen te isoleren voor verdere korte termijn culturing.

Samenvatting

Tijdens het verouderingsproces, veel cellen accumuleren hoge niveaus van schade die leidt tot cellulaire dysfunctie, die ten grondslag ligt aan vele geriatrische en pathologische omstandigheden. Post-mitotische neuronen vertegenwoordigen een belangrijk celtype beïnvloed door veroudering. Hoewel meerdere zoogdieren modellen van neuronale veroudering bestaan, ze zijn uitdagend en duur om vast te stellen. De rondworm Caenorhabditis elegans is een krachtig model om neuronale veroudering te bestuderen, omdat deze dieren een korte levensduur hebben, een beschikbare robuuste genetische Toolbox en goed gecatalogeerd zenuwstelsel. De hier gepresenteerde methode zorgt voor naadloze isolatie van specifieke cellen op basis van de uitdrukking van een transgene groene fluorescerende proteïne (GFP). Transgene dieren lijnen die GFP uitdrukken onder verschillende celtypespecifieke promotors worden verteerd om de buitenste cuticula te verwijderen en zachtjes mechanisch verstoord om slurry met verschillende celtypen te produceren. De cellen van belang worden vervolgens gescheiden van niet-doelcellen via fluorescentie-geactiveerde celsortering, of door anti-GFP-gekoppelde magnetische kralen. De geïsoleerde cellen kunnen vervolgens voor een beperkte tijd worden gekweekt of onmiddellijk worden gebruikt voor cel-specifieke ex vivo-analyses, zoals transcriptionele analyse door real-time kwantitatieve PCR. Dit protocol zorgt dus voor een snelle en robuuste analyse van celspecifieke reacties binnen verschillende neuronale populaties in C. elegans.

Inleiding

In de afgelopen decennia, het metazoan modelorganisme Caenorhabditis elegans is een enorme troef in de studie van neuronen, neuronale circuits en haar rol in fysiologische en gedragsmatige reacties, en veroudering-geassocieerde neurodegeneratieve Ziekten. Een unieke eigenschap van C. elegans is dat de dieren transparant zijn, waardoor de afstamming van alle volwassen somatische cellen in kaart kan worden gebracht¹. C. elegans herbergt ook beheersbare hoeveelheid neuronen, wat leidt tot de morfologie en connectiviteit van het zenuwstelsel wordt goed begrepen². De invariante celafstamming, korte levensduur en overvloed aan genetische hulpmiddelen met hoge doorvoer die beschikbaar zijn voor C. elegans maken het een ideaal modelorganisme voor de studie van veroudering binnen verschillende neuronale populaties.

Veroudering van neuronen en neurodegeneratieve aandoeningen zijn complex, en elke stoornis heeft unieke pathologische handtekeningen die ermee verbonden zijn. Echter, voor veel van deze aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson en Alzheimer, een gemeenschappelijk kenmerk is de progressieve belasting van verkeerd gevouwen eiwitten^3,4,5. In beide van deze ziekten, eiwitten misvouwen en aggregaat binnen de cel om toxiciteit te veroorzaken, uiteindelijk leiden tot celdood^4,5. Voor de juiste veroudering van neuronen, de homeostase van de mitochondriën, meer specifiek eiwit homeostase, is belangrijk, als verstoringen en dyshomeostase kan leiden tot neurodegeneratie^6,7,8. Cellen zijn uitgerust met verschillende mechanismen om eiwit homeostase te handhaven, één is de ongevouwen eiwit respons (UPR) ― een klassieke route waarbij signalen van endoplasmisch reticulum (ER) intracellulaire signaal Cascades activeren, wat leidt tot een transcriptionele Response⁹. Verwant aan deze UPR^er, figuur vertonen een soortgelijke reactie op het verlies van mitochondriale eiwit homeostase, de zogenaamde mitochondriale UPR (UPR^MT)^7,8. C. elegans lijkt het meest basale organisme te zijn dat een bevestigde en goed gedefinieerde UPR^MT traject⁷heeft.

De functie/disfunctie van specifieke neuronale populaties binnen een groter netwerk kan moeilijk te beoordelen zijn vanwege hun intrinsieke connectiviteit en complexiteit³. Echter, er is vaak een behoefte om te bestuderen van verschillende neuronale populaties als gevolg van celtypespecifieke ziekten met complexe pathologieën, zoals die in verband met verminderde cellulaire eiwit homeostase. In C. eleganskunnen specifieke neuronale populaties genetisch gemanipuleerd worden, waardoor faciele observatie in vivo mogelijk is. Het zenuwstelsel van C. elegans bestaat voornamelijk uit neuronen, met een klein percentage gliacellen. Bij volwassen hermafrodiet wormen zijn er ongeveer 302 neuronen, onderverdeeld in meer dan 100 verschillende klassen^2,10. Neuronen zoals cholinerge neuronen overheersingen in neuromusculaire knooppunten, terwijl Dopaminerge neuronen voornamelijk betrokken zijn bij sensatie^10,11. Aangezien zowel motorische activiteit als zintuiglijke vaardigheden afnemen met de leeftijd, is het belangrijk om mechanistische inzichten over defecten in deze individuele neuronen te detail te bekijken^11,12. Als zodanig is er behoefte aan een eenvoudige en robuuste methode om intacte cellen van belang te isoleren voor latere ex vivo-studies.

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde effectieve methode voor de snelle isolatie van specifieke neuronale cellen die groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken uit C. elegans. Deze isolatiemethode kan worden uitgevoerd op larvale, juveniele of volwassen wormen. Isolatie van cellen van larvale Worms werd eerder gepubliceerd door Zhang et al.¹³ en zal hier niet worden besproken. Een belangrijke opmerking hier is dat alle wormen in dezelfde levensfase moeten zijn om overmatige vertering van het dier of besmetting van dieren in verschillende levensstadia te voorkomen. Door zowel enzymatische als mechanische verstoring van de nematode cuticula, een exoskelet hoog in collageen en andere structurele eiwitten, kan een grote verscheidenheid aan cellen worden geïsoleerd^13,14. Cellen kunnen vervolgens worden geïsoleerd via Flowcytometrie of antilichaam gelabelde magnetische kralen. Typisch, RNA is geïsoleerd via een fenol en guanidine isothiocyanaat methode om te zorgen voor de verrijking van de gewenste celpopulatie¹⁵. Met veel zorg kunnen deze geïsoleerde cellen worden gehandhaafd in een kweek kolf of multi-well gerecht. Deze methode vertegenwoordigt een unieke en krachtige tool in de studie van specifieke neuronen en heeft de capaciteit om te isoleren van levende en functionele cellen voor verdere culturing.

Protocol

1. voorbereiding en verzameling van oude wormen voor celisolatie

Opmerking: hieronder wordt uitgelegd is de isolatie van cholinerge neuronen van de transgene UNC-17:: GFP stam (OH13083) verkregen uit de Caenorhabditis genetica Center (CGC) stam repository aan de Universiteit van Minnesota. Het is noodzakelijk om steriele omstandigheden te handhaven om besmetting van schimmels of bacteriën te voorkomen.

1. Bereid en synchroniseer wormen via de bleken methode zoals beschreven door T. stiernagle¹⁶. Voor verouderings experimenten, plaat wormen op nematode groeimedium (NGM) platen met 25 μM wateroplossing van fluorodeoxyuridine (FuDR) om de eierproductie te verminderen en het broedeieren te arresteren. Inspecteer de agar-platen regelmatig om verontreiniging of Eier eitjes te voorkomen, omdat dit onbetrouwbare resultaten zal opleveren.
   Opmerking: voor UNC-17:: GFP-cellen, meestal 3 100 mm x 15 mm NGM-platen worden gebruikt om een voldoende hoeveelheid cellen van belang te isoleren¹⁶.
2. Verzamel wormen en bereid buffers voor voor celisolatie.
   1. Verzamel wormen in een conische buis van 15 mL. Was wormen van plaat met 1,5 mL M9 buffer (1 mM MgSO₄, 85 mm nacl, 42 mm na₂HPO₄· 7H₂O, 22 mm KH₂po, pH 7,0) en Centrifugeer gedurende 5 min bij 1.600 x g. Gooi supernatant weg en was wormen met 1 mL M9-buffer. Herhaal centrifugeren en was voor een totaal van vijf keer om zo veel mogelijk E. coli besmetting te verwijderen.
      Opmerking: het toevoegen van antibiotica (50 μg/mL), zoals ampicilin, bij deze stap kan helpen bij het verminderen van bacteriële besmetting.
   2. Voor twee monsters, bereid 2 mL natriumdodecylsulfaat-dithiothreitol (SDS-DTT) lysisbuffer: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) en 3% (w/v) sucrose.
   3. Bereid 15 mL isolatie buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mm MgCl₂, 25 mm hepes [pH 7,3]) en bewaar het op ijs.
      NB: zowel de SDS-DTT lysis buffer als de isolatie buffer moeten vóór elk experiment vers worden gemaakt.
3. Verstoring van de cuticula en eencellige isolatie
   1. Centrifuge dieren verzameld in stap 1.2.1 gedurende 5 min bij 1.600 x g. Verwijder alle supernatant-en onderbreek wormen in 1 mL M9-media en breng deze over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
   2. Pelletwormen met centrifugeren bij 1.600 x g gedurende 5 min.
   3. Voeg 200 μL SDS-DTT lysisbuffer toe aan wormen en inincuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Wormen moeten lijken te zijn "winkled" langs het lichaam als bekeken onder een lichte Microscoop.
      Opmerking: langdurige blootstelling aan SDS-DTT lysisbuffer kan resulteren in de dood van wormen, die kunnen worden bewaakt door het observeren van wormen. Wormen die dood zijn, zullen worden gerekt en zullen niet krullen.
   4. Voeg 800 μL ijskoude isolatie buffer toe en meng door zachtjes met de buis te flikken.
   5. Pelletwormen gedurende 1 minuut bij 13.000 x g bij 4 °c, verwijder supernatant en was met 1 ml isolatie buffer.
   6. Herhaal stap 1.3.5 voor een totaal van vijf keer, elke keer dat u de isolatie buffer zorgvuldig verwijdert.
   7. Voeg 100 μL protease mengsel toe van Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabel van de materialen) opgelost in isolatie buffer tot de pellet en inincuberen gedurende 10 − 15 min bij RT.
      Opmerking: net als bij de SDS-DTT lysisbuffer kan de verlengde vertering van protease resulteren in een overmatige decolleté van eiwitten langs het plasma membraan, waardoor isolatie van oppervlak blootgestelde GFP via magnetische kralen wordt voorkomen.
   8. Tijdens incubatie met protease mengsel, mechanische verstoring toepassen door Pipetteer monsters op en neer tegen de onderkant van de 1,5 mL micro centrifugebuis met een 200 μL micropipet punt voor ~ 60 − 70 keer. Houd de pipetpunt tegen de wand van de microcentrifuge buis met constante druk om cellen correct te ontkoppelen.
   9. Om het stadium van de spijsvertering te bepalen, verwijdert u een klein volume (~ 1 − 5 μL) van het verterings mengsel, laat u het op een glazen glijbaan vallen en inspecteert u het met behulp van een weefselkweek Microscoop. Na 5 − 7 minuten incubatie moeten worm fragmenten zichtbaar gereduceerde cuticula hebben en een slurrie van cellen zal gemakkelijk zichtbaar zijn.
   10. Stop reactie met 900 μL commercieel verkrijgbare koude Leibovita's L-15 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en penicillaire-streptomycine (eindconcentratie bij 50 U/mL penicillaire en 50 μg/mL streptomycine).
   11. Pellet geïsoleerde fragmenten en cellen door centrifugeren gedurende 5 min bij 10.000 x g bij 4 °c. Was de gepileerde cellen twee keer meer dan 1 ml koude L-15-aangevuld media om ervoor te zorgen dat overtollig vuil en schubben worden verwijderd.
   12. Resubreng cellen in 1 mL L-15-aangevuld met media en laat 30 minuten op ijs. Neem de toplaag, ongeveer 700 − 800 μL, naar een micro centrifugebuis. Deze laag bevat cellen zonder celpuin en zal worden gebruikt in de daaropvolgende isolatie van cellen van belang.
   13. Volg de instructies van de fabrikant en gebruik een geautomatiseerd cellenteller of hemocytometer om de celdichtheid van 10 − 25 μL geïsoleerde cellen te meten.

2. isolatie van GFP-positieve cellen via Flowcytometrie of anti-GFP magnetische kralen

Opmerking: er zijn twee methoden die kunnen worden geïmplementeerd om specifieke celtypen te isoleren. De eerste methode is het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), terwijl de tweede methode antilichamen-geconjugeerde magnetische kralen gebruikt om cellen te scheiden die afzonderlijke plasma membraan-gelokaliseerde eiwitten uitdrukken. De laatste methode vereist de lokalisatie van GFP aan het plasma membraan, dus beschikbaar voor interactie met de met antilichamen gekoppelde magnetische kraal.

1. Isolatie van GFP-positieve cellen doorstroming cytometrie
   1. Van geïsoleerde celsuspensie verzameld in stap 1.3.12, centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 10.000 x g bij 4 °c. Gooi supernatant weg en onderbreek cellen in L-15-aangevuld medium tot een celdichtheid van niet meer dan 6 x 10⁶ cellen/ml om overbelasting van de flow cytometer te voorkomen.
   2. Sorteer cellen op GFP-positieve expressie met behulp van een flow-cytometer die monsters kan sorteren. GFP-negatieve cellen kunnen worden gebruikt als besturingselement voor specifieke analyse van niet-celtype.
      Opmerking: zoals hierboven vermeld, kan een alternatieve benadering voor het isoleren van GFP-positieve cellen worden gebruikt als de GFP-gelabelde proteïne van belang is gelokaliseerd in het plasma membraan van de cellen. In dit geval kan het in paragraaf 2,2 beschreven protocol worden gebruikt.
2. Isolatie van GFP-positieve cellen via anti-GFP magnetische kralen
   1. Van geïsoleerde celsuspensie verzameld in stap 1.3.12, centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 10.000 x g bij 4 °c. Gooi de supernatant weg en onderbreek de cellen in 485 μL L-15-aangevuld medium. Voeg 15 μL ddH₂O voorgewassen α-GFP-antilichamen-gekoppelde magnetische parels toe aan de oplossing.
   2. Incuberen cellen met de magnetische kraal slurry bij 4 °C gedurende 1 uur met zeer zacht draaien. Overmatig draaien zal de cellen beschadigen.
   3. Na incubatie, centrifugeer monster gedurende 5 minuten bij 10.000 x g bij 4 °c, vervolgens was pellet 2x met 1 ml L-15-aangevuld medium om GFP-negatieve cellen te verwijderen.
3. Culturing van geïsoleerde cellen
   1. Plaat geïsoleerde cellen in een steriele 6-well multi-well plaat.
      Opmerking: deze platen kunnen worden gecoat met pinda-lectine om de celhechting te verhogen; Als cellen echter onmiddellijk moeten worden gebruikt, kan deze stap worden genegeerd.
   2. Plaats de plaat in een plastic bakje en inbroed de cellen bij 20 °C met een vochtig doekje of weke delen (Voeg 50 μg/mL ampicillaire toe aan ddH₂O om te zorgen voor geen bacteriële groei bij het afvegen) om vocht aan cellen toe te voegen. Niet incueren in een CO₂ -incubator, omdat verhoogde co₂ -niveaus de cellen kunnen beschadigen.

3. fluorescerende beeldvorming van geïsoleerde GFP-positieve cellen

1. Zet de TL-lamp van een omgekeerde Microscoop met fluorescentie bevestiging aan en laat het ongeveer 10 minuten opwarmen.
2. Verwijder celkweek uit de incubator en zet op het podium van omgekeerde Microscoop met florescentie gehechtheid. Schuif het GFP-filter in de groeven onder het podium van de Microscoop.
3. Bekijk de cellen met een vergroting van 50x. Met succes geïsoleerde GFP-positieve cellen zullen gemakkelijk zichtbaar zijn. Maak Foto's met de camerabevestiging op de Microscoop.

4. extractie van RNA uit geïsoleerde cellen

Opmerking: extractie van RNA moet onmiddellijk na celisolatie worden uitgevoerd om een hoge kwaliteit van het materiaal te garanderen. Geïsoleerd RNA kan worden gebruikt voor de productie van cDNA en de daaropvolgende meting van transcript niveaus door kwantitatieve PCR (qPCR). Alle buisjes, tips en reagentia moeten RNase-vrij zijn en de werkruimte moet ethanol-gewassen zijn voorafgaand aan RNA-extractie.

1. Van geïsoleerde cellen die in stap 2.1.2 zijn verzameld, centrifugeer cellen in een 1,5 mL steriele, RNase vrije microcentrifuge tube gedurende 5 min bij 10.000 x g bij 4 °c. Als cellen worden geïsoleerd via magnetische kralen, volg celverzameling zoals hierboven vermeld.
2. Verwijder met behulp van een micro pipet supernatant uit gecentrifugeerde microcentrifuge buis en voeg 100 μL M9 medium toe om L-15-aangevuld medium weg te spoelen. Centrifugeer cellen 5 min bij 10.000 x g bij 4 °c en verwijder supernatant. Om er zeker van te zijn dat alle media worden verwijderd, herhaalt u voor een totaal van drie wasgoed elke keer dat u supernatant zorgvuldig verwijdert.
3. Voeg 1 mL fenol-en guanidine-isothiocyanaatoplossing (tabel met materialen) toe aan cellen en Pipetteer de suspensie voorzichtig op en neer. Inbroed het mengsel bij RT gedurende 5 min.
4. Voeg na incubatie 250 fenol en guanidine isothiocyanaatoplossing toe
5. Centrifugeer de oplossing gedurende 5 minuten bij 10.000 x g bij 25 °c.
6. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk van de bovenste waterige laag met een micropipet, zonder de onderste organische lagen te verstoren, en breng de onderste laag over naar een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL RNase. Voeg aan de nieuwe buis 500 μL isopropanol toe en meng door de buis te inverteren. Inincuberen deze oplossing bij RT gedurende 5 min.
7. Centrifugeer de buis bij 14.000 x g gedurende 20 minuten bij 25 °c.
8. Terwijl u de monsters op ijs houdt, verwijdert u zoveel mogelijk isopropanol met een micro pipet en voegt u voorzichtig 1 mL ethanol 70% (v/v) in RNase-Free ddH₂O toe aan de buis. Zorg ervoor dat u de oplossing niet direct op de bodem van de buis uitwerpt; Breng ethanol/water mengsel aan de zijkant van de buis.
9. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 25 °c.
10. Verwijder de meeste ethanol en lucht drogen op ijs voor 3 − 5 min.
    Opmerking: ethanol moet na deze stap worden verwijderd; een zorgvuldige inspectie van de bodem van de buis is echter belangrijk om er zeker van te zijn dat er geen ethanol overblijft.
11. Nadat de buis lucht gedroogd is, voeg dan 15 − 20 μL RNase-vrij ddH₂O toe en meet de RNA-concentratie en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer bij een golflengte van 260 nm. De zuiverheid van het monster moet worden gemeten als een verhouding van 260 nm/280 nm. Deze verhouding moet ongeveer > 2.
    Opmerking: geïsoleerd RNA kan worden bevroren en opgeslagen bij-20 °C. Het is echter zeer preferentieel om een cDNA-synthese pakket zo snel mogelijk te gebruiken om de productie van cDNA van hoge kwaliteit te garanderen. Kwantitatieve PCR kan volgen met instructies van de fabrikant van de Thermocycler die in het laboratorium wordt gebruikt.

Resultaten

Het hier beschreven protocol zorgt voor specifieke isolatie van UNC-17:: GFP-positieve cholinerge neuronen van de rondworm C. elegans voor latere ex vivo studies zoals celtypespecifieke genexpressie profilering en uiteindelijke kortdurende kweek voor Patch-clamp elektrofysiologie metingen.

Figuur 1 toont UNC-17:: GFP-positieve cholinerge neuronen in hun normale instelling....

Discussie

De rondworm C. elegans is een gevestigde en krachtige model voor het bestuderen van de neuronale gezondheid en ziekte². Met ruime genetische hulpmiddelen om deze dieren te manipuleren en beheersbare hoeveelheid nauwkeurig in kaart gebrachte neuron types, kan een groot deel van de gegevens worden verzameld met een relatief kleine hoeveelheid materiaal. Hier schetsen we een geoptimaliseerde methode om verschillende neuronen van hele dieren te isoleren. Door de buitenste cuticula-eiwitten va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6-well plate	Fisher Scientific	12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Chloroform	Sigma	496189
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
Ethanol	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
NaOH	Amresco	O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Peptone Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	protease mengsel van Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	fenol en guanidine isothiocyanate oplossing
Trypan Blue Stain	Invitrogen	T10Z82
α-GFP magnetische kralen	MBL	D153-11