Methodenartikel
Hier beschrijven we een enkele cel micro-aspiratie methode voor de scheiding van geïnfecteerde amoebae. Om virale subpopulaties te scheiden in Vermamoeba vermiformis geïnfecteerd door Faustovirussen en onbekende reus virussen, ontwikkelden we het protocol hieronder beschreven en toonden zijn vermogen om twee laag-overvloed roman reus virussen scheiden.
Tijdens het cocultuurproces van amoeba kan meer dan één virus in één put worden geïsoleerd. We hebben dit probleem eerder opgelost door verdunning van het eindpunt en/of fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) toegepast op de virale populatie. Wanneer de virussen in het mengsel echter vergelijkbare morfologische eigenschappen hebben en een van de virussen langzaam vermenigvuldigt, wordt de aanwezigheid van twee virussen ontdekt in het stadium van genoom assemblage en kunnen de virussen niet worden gescheiden voor verdere karakterisering. Om dit probleem op te lossen, ontwikkelden we een eencellige micro-aspiratie procedure die het mogelijk maakt om sterk vergelijkbare virussen te scheiden en te klonen. In het huidige werk presenteren we hoe deze alternatieve strategie ons in staat stelde om de kleine virale subpopulaties van Clandestinovirus ST1 en Usurpativirus LCD7 te scheiden, gigantische virussen die langzaam groeien en niet leiden tot amoebal lysis in vergelijking met de lytische en snelgroeiende Faustovirus. De zuiverheids controle werd beoordeeld door specifieke genamplificatie en virussen werden geproduceerd voor verdere karakterisering.
Nucleocytoplasmische grote DNA-virussen (NCLDV) zijn zeer divers, gedefinieerd door vier families die eukaryoten1infecteren. De eerste beschreven virussen met genomen boven 300 KBP waren phydcodnaviridae, waaronder Paramecium bursaria Chlorella virus 1 PBCV12. De isolatie en de eerste beschrijving van Mimivirus, toonde aan dat de grootte van de virussen verdubbeld in termen van zowel de grootte van het deeltje (450 nm) en de lengte van het genoom (1,2 MB)3. Sindsdien zijn veel reusachtige virussen beschreven, meestal geïsoleerd met behulp van een amoeba-co-cultuur procedure. Vers....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
1. amoeba-cultuur
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Single cell micro-aspiratie is een Micro manipulatie proces dat is geoptimaliseerd in dit manuscript (Figuur 1). Deze techniek maakt het mogelijk om een afgeronde, geïnfecteerde amoeba (Figuur 2a) en de afgifte ervan in een nieuwe plaat met niet-geïnfecteerde eencellige (Figuur 2) vast te leggen. Het is een functioneel prototype dat van toepassing is op het co-cultuur systeem en heeft met succes geïsoleerde niet-lyt.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De duur van de eencellige behandeling met micro-aspiratie en de goede werking ervan is afhankelijk van de exploitant. De verschillende stappen van het experiment vereisen precisie. Het gebruik van de Micro manipulatie-onderdelen van het werkstation moet voortdurend worden bestreden door het proces van micro-aspiratie en het vrijkomen van de cel te observeren. De follow-up door microscopische observatie is noodzakelijk voor het vangen en overbrengen van een cel. Een ervaren operator kan 1 tot 2 uur duren om 10 cellen te i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle auteurs hebben niets te onthullen.
De auteurs willen zowel Jean-Pierre Baudoin als Olivier Mbarek bedanken voor hun advies en Claire Andréani voor haar hulp in Engelse correcties en aanpassingen. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Franse staat die werd beheerd door het nationaal onderzoeksbureau in het kader van het programma "Investissements d'avenir (Investments for the Future)" met de referentie ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée-infectie) en door de regio Provence-Alpes De Côte d'Azur en de Europese financiering FEDER PRIMI.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose Standard | Euromedex | Onbekend | Standaard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standaard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Beheersing van de cellen tijdens het microaspiratieproces |
| Corning celkweekflacons 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Kweek |
| Corning celkweekflacons 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Kweek |
| Corning celkweekflacons 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Kweek |
| DFC 425C camera | LEICA | Onbekend | Observatie/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Omgekeerd Microscoop | Nikon | Onbekend | Observatie/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA-extractie |
| Glasstic Slide 10 met Telrasters | Kova International | 87144E | Celtelling |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standaard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiratie en vrijlating van cellen |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Positionering van microcapillair |
| Nuclease-vrij water | ThermoFischer | AM9920 | Standaard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Viruszuivering |
| Petrischaal 35 mm | Ibidi | 81158 | Kweek/observatie |
| Steriele spuitfilters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtratie |
| SYBR green Type I | Invitrogen | onbekend | Fluorescente moleculaire sondes/flowcytometrie |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standaard PCR; DNA gelkleuring |
| Tecnai G20 | FEI | Onbekend | Elektronenmicroscopie |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Viruszuivering |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2 | BECKMAN COULTER | 344058 | Viruszuivering |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen