Single cell micro-aspiratie als alternatieve strategie voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering voor scheiding van gigantische virus mengsels

Samenvatting

Hier beschrijven we een enkele cel micro-aspiratie methode voor de scheiding van geïnfecteerde amoebae. Om virale subpopulaties te scheiden in Vermamoeba vermiformis geïnfecteerd door Faustovirussen en onbekende reus virussen, ontwikkelden we het protocol hieronder beschreven en toonden zijn vermogen om twee laag-overvloed roman reus virussen scheiden.

Samenvatting

Tijdens het cocultuurproces van amoeba kan meer dan één virus in één put worden geïsoleerd. We hebben dit probleem eerder opgelost door verdunning van het eindpunt en/of fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) toegepast op de virale populatie. Wanneer de virussen in het mengsel echter vergelijkbare morfologische eigenschappen hebben en een van de virussen langzaam vermenigvuldigt, wordt de aanwezigheid van twee virussen ontdekt in het stadium van genoom assemblage en kunnen de virussen niet worden gescheiden voor verdere karakterisering. Om dit probleem op te lossen, ontwikkelden we een eencellige micro-aspiratie procedure die het mogelijk maakt om sterk vergelijkbare virussen te scheiden en te klonen. In het huidige werk presenteren we hoe deze alternatieve strategie ons in staat stelde om de kleine virale subpopulaties van Clandestinovirus ST1 en Usurpativirus LCD7 te scheiden, gigantische virussen die langzaam groeien en niet leiden tot amoebal lysis in vergelijking met de lytische en snelgroeiende Faustovirus. De zuiverheids controle werd beoordeeld door specifieke genamplificatie en virussen werden geproduceerd voor verdere karakterisering.

Inleiding

Nucleocytoplasmische grote DNA-virussen (NCLDV) zijn zeer divers, gedefinieerd door vier families die eukaryoten¹infecteren. De eerste beschreven virussen met genomen boven 300 KBP waren phydcodnaviridae, waaronder Paramecium bursaria Chlorella virus 1 PBCV1². De isolatie en de eerste beschrijving van Mimivirus, toonde aan dat de grootte van de virussen verdubbeld in termen van zowel de grootte van het deeltje (450 nm) en de lengte van het genoom (1,2 MB)³. Sindsdien zijn veel reusachtige virussen beschreven, meestal geïsoleerd met behulp van een amoeba-co-cultuur procedure. Verschillende reusachtige virussen met verschillende morfologieën en genetische inhoud kunnen worden geïsoleerd uit Acanthamoeba SP. cellen, met inbegrip van Marseillevirussen, Pandoravirussen, Pithovirussen, Mollivirus, Cedratvirussen, Pacmanvirus, tupanvirus, en onlangs Medusavirus^{4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17}. Parallel, de isolatie van vermamoeba vermiformis toegestaan de isolatie en de beschrijving van de gigantische virussen faustovirus, kaumoebavirus, en orpheovirus^18,19,20. Andere reusachtige virussen werden geïsoleerd met hun gastheer protisten, zoals cafetaria roenbergensis²¹, aureococcus anophagefferens²², Chrysochromulina ericina²³, en Bodo saltans ²⁴. Al deze isolaties waren het resultaat van een toenemend aantal teams die werkten aan isolatie en de introductie van een high-throughput strategie updates^25,26,27,28, zoals de verbetering van het co-cultuur systeem met het gebruik van flow cytometrie.

In 2016 gebruikten we een strategie die co-cultuur en flow cytometrie aan het koppelen was om gigantische virussen²⁷te isoleren. Deze strategie is ontwikkeld om het aantal geënt monsters te verhogen, om protisten te diversifiëren die worden gebruikt als celondersteuningen, en om snel de lysis van de celsteun te detecteren. Het systeem werd bijgewerkt door een aanvullende stap toe te voegen om voorlopige moleculaire biologie-identificatie en snelle detectie van een onbekende virale populatie te voorkomen, zoals in het geval van Pacmanvirus²⁹. Koppelings stroom cytometrie naar celsortering toegestaan voor scheiding van een mengsel van Mimivirus en Cedratvirus A11³⁰. Echter, we later ondervonden de beperkingen van de scheiding en detectie van deze virale subpopulaties doorstroming cytometrie. Na de sequencing, toen we de genomen van faustovirus ST1²⁵ en faustovirus LCD7 (niet-gepubliceerde gegevens) geassembleerd, we verrassend gevonden in elke vergadering twee aanvullende genomen van twee nieuwe virussen niet geïdentificeerd in het openbaar genoom databases. Echter, noch flow flowcytometrieonderzoeken noch transmissie elektronische microscopie (TEM) toonde aan dat de amoebaes werden geïnfecteerd door twee verschillende virussen, clandestinovirus ST1 en usurpativirus LCD7. We hebben specifieke PCR-systemen ontworpen om respectievelijk de markers van Faustovirus, Usurpativirus en Clandestinovirus te versterken op basis van hun Genomes; ons doel was om PCR-gebaseerde systemen te hebben die verificatie mogelijk maken van de zuiverheid van de virussen die worden gescheiden. Eindpunt verdunning en flow cytometrie echter niet om ze te scheiden. De isolatie van deze enkelvoudige virale populatie was moeilijk omdat noch de morfologie noch replicatieve elementen van Clandestinovirus en Usurpativirus populaties zijn gekenmerkt. We hebben slechts één virale populatie doorstroming cytometrie gedetecteerd vanwege de overlapping van de twee populaties (getest na de effectieve scheiding). We probeerden ze te scheiden met behulp van enkelvoudige deeltjes sortering op 96-well-platen, maar we hebben geen cytopathische effecten waargenomen, en we hebben geen Clandestinovirus of Usurpativirus gedetecteerd door PCR-versterking. Tot slot, het was alleen de combinatie van eindpunt verdunning gevolgd door enkele amoeba micro-aspiratie die de scheiding van deze twee laag-overvloed reus virussen van Faustovirussen ingeschakeld. Deze scheidingsmethode is het object van dit artikel.

Protocol

1. amoeba-cultuur

1. Gebruik Vermamoeba vermiformis (strain CDC19) als een celsteun.
2. Voeg toe 30 ml protease-peptone-gistextract-glucose medium (pyg) (tabel 1) en 3 ml eencellige in een concentratie van 1 x 10⁶ cellen/ml in een 75 cm² celkweek kolf.
3. Behoud de cultuur bij 28 °C.
4. Na 48 h Kwantificeer je de eencellige met teldia's.
5. Om te spoelen, oogst de cellen in een concentratie van 1 x 10⁶ cellen/ml en pellet de eencellige door centrifugeren bij 720 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en regeer de pellet in de juiste hoeveelheid verhongering medium om 1 x 10^{6 te verkrijgen} cellen/ml (tabel 1).

2. voortplanting van het voorraad virus in Amoebae

Opmerking: Vóór verdunning is het belangrijk om het voorraad monster te kweken om voldoende verse cultuur te verkrijgen en vervolgens naar filtratie te gaan.

1. Gebruik 1 x 10⁶ van de amoeba-cultuur in het verhongering medium.
2. Inoculeren het mengsel van virussen afgegeven uit de stamoplossing (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 of Faustovirus/Clandestinovirus ST1) na het co-cultuur proces op de cel ondersteuning bij een veelheid van infectie (MOI) van 0,01.
   Opmerking: De MOI is belangrijk om de overvloed van de grote virale populatie en het aantal geïnfecteerde cellen te verminderen.
3. Inincuberen bij 30 °C totdat cytopathische effecten (CPE) worden geïnduceerd, zoals een amoebal afronding of lysis, ongeveer 10 tot 14 h na infectie.
4. Verzamel de media en het filtraat via een 5 μm filter om cellulair puin te verwijderen.

3. eindpunt verdunning

1. Voer een seriële verdunning (10^-1 tot 10^-11) van het virale monster in het verhongering middel (tabel 1).
2. Inoculeren 2 mL 1 x 10⁶ vermamoeba vermiformis in elke Petri schaal met 100 μL van het inoculum van het mengsel.
3. Plaats de Petri schaaltjes in een afsluitbare plastic zak op 30 °C.
4. Begin met het observeren van de Petri schaaltjes met omgekeerde optische microscopie bij 6 h postinfectie en controleer de celmorfologie elke 4 tot 8 uur.
5. Bij het verschijnen van het cytopathische effect dat wordt gekenmerkt door Afrondings cellen, begint het eencellige micro-aspiratie proces.

4. eencellige micro-aspiratie

1. Bereid de host voor.
   Opmerking: deze voorbereiding is gemaakt voor het vrijkomen van geïnfecteerde afzonderlijke cellen aan een nieuwe cel ondersteuning.
   1. Behandel het eencellige in de cultuur met een antimicrobieel middel dat 10 μg/ml vancomycine, 10 μg/ml imipenem, 20 μg/ml ciprofloxacine, 20 μg/ml doxycycline en 20 μg/ml voriconazol bevat. Dit mengsel wordt gebruikt om bacteriële en schimmel besmetting te voorkomen.
      Opmerking: De procedure vindt plaats op een bank buiten het microbiologische veiligheids station. Voeg toe 2 ml eencellige geconcentreerd op 1 x 10⁶ cellen/ml elk in 15 Petri schalen. Voor de hechting van amoeba, incuberen de cultuur bij 30 °C gedurende 30 minuten.
2. Selecteer de Petri schaal die wordt gebruikt voor de micro-aspiratie van de grens verdunning volgens de volgende criteria: 1) afwezigheid van zichtbare verontreiniging door schimmel-en bacteriële agentia, 2) bewijs van cytopathisch effect van eencellige als gevolg van de virussen, en 3) prelyse en afrondingsfase van het eencellige (om aspiratie van virale deeltjes te voorkomen).
3. Stel een werkstation in met de volgende materialen (Zie Figuur 1a, B):
   Micromanipulator, die microcapillaire positionering mogelijk maakt;
   Handmatige controledruk apparaat, gebruikt om aspireren en laat de cellen in de microcapillair;
   Omgekeerde Microscoop;
   Plug en Play motor modules;
   Camera
   Computer module om manipulatie te visualiseren en foto's te maken.
4. Kies een micro capillair (Zie Figuur 1C).
   Opmerking: De grootte van de cellen, de vervorming en hechting van hun membranen op de oppervlakken, en de cellulaire beweeglijkheid kan invloed hebben op de soepele voortgang van de micro-aspiratie. De microcapillaire diameter kan nauwkeurig worden gekozen en aangepast aan specifieke celtypen, afhankelijk van hun grootte en methoden van aspiratie. Een microcapillair van 20 μm binnendiameter werd gebruikt om een afronding amoeba (diameter ~ 10 μm) te aspireren. Dit maakt het onderhoud van een interne positie en een eenvoudige vrijgave van de cel mogelijk.
5. Monteer het systeem.
   1. Bevestig de bedrijfs hoek van het aangrijpende systeem op de gemotoriseerde module op 45 °.
   2. Voer een dubbele installatie uit, eerst op het aangrijpende systeem en vervolgens op het micro capillair.
   3. Concentreer u op de cellen na het uitvoeren van een paar druppels olie door het microcapillair.
      Opmerking: De minerale olie met biologische compatibiliteit wordt geleverd door het apparaat.
   4. Volledige montage volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
6. Kloon cellen (Zie afbeelding 2A, B).
   Opmerking: deze procedure is vergelijkbaar met die beschreven door Fröhlich en König³¹.
   1. Plaats de Petri schaal met 2 ml geïnfecteerd eencellige onder de Microscoop.
   2. Focus eerst op de cellen, en vervolgens op de microcapillaire ondergedompeld in de cultuur.
   3. Kies een afgeronde enkele cel en breng de microcapillaire dichter bij de micro manipulator.
   4. Oefenen van zachte aspiratie met handmatige drukregeling op de cel, het nemen van het in het microcapillair. Verwijder de enkele cel uit het eerste voorbeeld en laat deze los in de cellulaire ondersteuning en inincuberen bij 30 °C.
   5. Dagelijkse waarnemingen uitvoeren met een omgekeerde optische Microscoop om het uiterlijk van de cellen te observeren en de opkomst van het cytopathische effect te bewaken.

5. PCR-screening

Opmerking: Na stap 4 is een systematische screening door PCR cruciaal om de scheiding te bevestigen. In zowel Usurpativirus/Faustovirus en Clandestinovirus/Faustovirus, het ontwerp en de toepassing van de specifieke primer en sonde systemen werden gedaan met behulp van primer-BLAST online³² (tabel 2).

1. Extraheer DNA uit een deel van de positieve kweek monsters (d.w.z. waar een cytopathisch effect wordt waargenomen), met behulp van een geautomatiseerd extractie systeem volgens het Protocol van de fabrikant.
2. Gebruik de juiste ontworpen primers.
   Opmerking: Hier hebben we primers ontworpen om de kern genen te versterken die zijn geannotiseerd als RpB2 (Faustovirus), LCD7 Major capside-eiwit (Usurpatvirus) en klein capside-eiwit (Clandestinovirus)
3. Voer een standaard PCR uit met een Thermocycler.
   1. Voer 20 μL PCR-reacties uit met 50 μM van elke primer (tabel 2), 1x Master Mix en RNase vrij water.
   2. Activeer de Taq-DNA-polymerase gedurende 5 minuten bij 95 °C en volg vervolgens 45 cycli van 10 s denaturatie bij 95 °C, gloeien van de primers voor 30 s bij 58 °C en verlenging voor 30 s bij 72 °C.
4. Voer de PCR-producten uit op een 1,5% agarose-gel, vlek met DNA-gelvlek (tabel met materialen) en visualiseer met UV-straling.

6. virus productie en-zuivering

1. Zet de rest van de Petri schaalcultuur terug in een kleine kolf.
2. Voor de virus productie, bereid 15 kolven van 145 cm², bevattende 40 ml Vermamoeba vermiformis in het verhongering medium en 5 ml van het geïsoleerde virus al overgebracht van de Petri schaal naar kleine kolven.
3. Behandel met hetzelfde antibioticum en antischimmel mengsel gebruikt in stap 4,1.
4. Incuberen bij 30 °C. Observeer elke dag met omgekeerde optische microscopie.
5. Na de volledige infectie, zwembad alle kolven. Gebruik een 0,45 μm filter om vuil te elimineren.
6. Ultracentrifuge alle supernatanten op 50.000 x g voor 45 min.
7. Na centrifugeren, verwijder het supernatant van elke buis door aspiratie en regeer de pellet in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
8. Reinig het virus dat wordt geproduceerd met 25% sucrose (27,5 g sucrose in 100 mL PBS, gesteriliseerd door filtratie).
9. Centrifugeer 8 mL sucrose en 2 mL van de virale suspensie bij 80.000 x g gedurende 30 min. respendeer de virale pellet in 1 ml PBS. Bewaren bij-80 °C.

7. negatieve kleuring en transmissie elektronenmicroscopie

Opmerking: Bou Khalil et al. eerder dit protocol²⁷gepubliceerd.

1. Breng 5 μL van het supernatant van lysis aan op het gloei rooster. Laat ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur.
   Opmerking: De Glow-discharge stelt ons in staat om een hydrofiele grid te verkrijgen door de plasma toepassing.
2. Droog het rooster voorzichtig en stort een kleine druppel van 1% ammonium molybdaat erop voor 10 s. laat het rooster 5 min drogen.
3. Ga verder naar elektronenmicroscopie observaties bij 200 keV.

8. karakterisering van Clandestinovirus ST1 en Usurpativirus LCD7

1. Karakteriseren zuivere populaties van clandestinovirus ST1 en usurpativirus LCD7 met behulp van genoom sequencing, genoom assemblage, bioinformatica analyses, en studie van hun replicatieve cyclus zoals we hebben gedaan voor andere virussen^{10,20, 29}.

Resultaten

Single cell micro-aspiratie is een Micro manipulatie proces dat is geoptimaliseerd in dit manuscript (Figuur 1). Deze techniek maakt het mogelijk om een afgeronde, geïnfecteerde amoeba (Figuur 2a) en de afgifte ervan in een nieuwe plaat met niet-geïnfecteerde eencellige (Figuur 2) vast te leggen. Het is een functioneel prototype dat van toepassing is op het co-cultuur systeem en heeft met succes geïsoleerde niet-lyt...

Discussie

De duur van de eencellige behandeling met micro-aspiratie en de goede werking ervan is afhankelijk van de exploitant. De verschillende stappen van het experiment vereisen precisie. Het gebruik van de Micro manipulatie-onderdelen van het werkstation moet voortdurend worden bestreden door het proces van micro-aspiratie en het vrijkomen van de cel te observeren. De follow-up door microscopische observatie is noodzakelijk voor het vangen en overbrengen van een cel. Een ervaren operator kan 1 tot 2 uur duren om 10 cellen te i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose Standard	Euromedex	Onbekend	Standaard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standaard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Beheersing van de cellen tijdens het microaspiratieproces
Corning celkweekflacons 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Kweek
Corning celkweekflacons 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Kweek
Corning celkweekflacons 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Kweek
DFC 425C camera	LEICA	Onbekend	Observatie/Monitoring
Eclipse TE2000-S Omgekeerd Microscoop	Nikon	Onbekend	Observatie/Monitoring
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	DNA-extractie
Glasstic Slide 10 met Telrasters	Kova International	87144E	Celtelling
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standaard PCR
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiratie en vrijlating van cellen
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Positionering van microcapillair
Nuclease-vrij water	ThermoFischer	AM9920	Standaard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A94469	Viruszuivering
Petrischaal 35 mm	Ibidi	81158	Kweek/observatie
Steriele spuitfilters 5 µm	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtratie
SYBR green Type I	Invitrogen	onbekend	Fluorescente moleculaire sondes/flowcytometrie
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Standaard PCR; DNA gelkleuring
Tecnai G20	FEI	Onbekend	Elektronenmicroscopie
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	BECKMAN COULTER	337922	Viruszuivering
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Viruszuivering