Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten

Samenvatting

Moedermelk zendt humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hoewel slechts ~ 15% van zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd raken. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 10⁵− 10⁸ maternale leukocyten dagelijks, hoewel deze cellen zijn onderonderzocht. Hier beschrijven we de isolatie van moedermelk leukocyten en een analyse van hun fagocytische capaciteit.

Samenvatting

Zelfs bij afwezigheid van antiretrovirale geneesmiddelen, wordt slechts ~ 15% van de zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd, wat duidt op een sterk beschermend effect van moedermelk (BM). Tenzij de toegang tot schoon water en de juiste zuigelingenvoeding betrouwbaar is, raadt de WHO het staken van de borstvoeding voor HIV-geïnfecteerde moeders niet aan. Talrijke factoren waarschijnlijk werken in tandem om BM transmissie te verminderen. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 10⁵− 10⁸ maternale leukocyten dagelijks, hoewel wat grotendeels onduidelijk blijft is de bijdrage van deze cellen aan de ANTIVIRALE kwaliteiten van BM. op dit moment waren we gericht op het isoleren van cellen van menselijke BM om te meten antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP), een van de meest essentiële en pervasieve aangeboren immuunresponsen, door BM fagocyten tegen HIV-doelwitten. Cellen werden geïsoleerd uit 5 menselijke BM monsters verkregen in verschillende stadia van de lactatie. Isolatie werd uitgevoerd via zachte centrifugeren gevolgd door zorgvuldige verwijdering van melkvet en herhaald wassen van de celpellet. Fluorescerende parels bedekt met HIV-envelop (env) epitoop werden gebruikt als doelstellingen voor analyse van ADCP. Cellen werden bevlekt met de CD45 oppervlakte marker om leukocyten te identificeren. Er werd vastgesteld dat ADCP-activiteit significant was boven controle-experimenten en reproduceerbare meetbaar met behulp van een HIV-specifiek antilichaam 830A.

Inleiding

Menselijke moedermelk (BM) bestaat uit moeder cellen die > 90% levensvatbaar¹. Cel samenstelling wordt sterk beïnvloed door het stadium van de lactatie, gezondheidstoestand van moeder en zuigeling, en individuele variatie, die blijft slecht begrepen^1,2,3,4. Gezien het feit dat BM ~ 10³− 10⁵ leukocyten/ml bevat, kan worden geschat dat zuigelingen met borstvoeding ongeveer 10⁵− 10⁸ moeder leukocyten per dag innemen⁵. Verschillende in vivo studies hebben aangetoond dat maternale leukocyten kritische immuniteit bieden aan de zuigeling en functioneel ver buiten deze sites van initiële inname^{5,6,7,8 ,9,10,11}. Alle maternally-afgeleide cellen ingenomen door de zuigeling hebben het potentieel om immune functies uit te voeren naast of te compenseren voor de zuigeling eigen leukocyten¹².

De overdracht van moeder naar kind (MTCT) van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) blijft een crisis in landen met beperkte middelen. Aangezien diarree en luchtwegaandoeningen verantwoordelijk zijn voor een aanzienlijk sterftecijfer bij zuigelingen in hulpbronnen beperkte landen, en deze ziekten aanzienlijk worden verminderd door exclusieve borstvoeding, zijn de voordelen voor HIV-geïnfecteerde moeders van borstvoeding veel zwaarder dan de Risico's^13,14,15. Tenzij de toegang tot schoon water en de juiste zuigelingenvoeding betrouwbaar is, raadt de WHO het staken van de borstvoeding voor HIV-geïnfecteerde moeders¹⁶niet aan. Ongeveer 100.000 MTCTs via BM komen jaarlijks voor; Toch wordt slechts ~ 15% van de zuigelingen die borstvoeding krijgen door hun HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd, wat een sterk beschermend effect van BM^{17,18,19,20,21}suggereert. Talrijke factoren werken waarschijnlijk in tandem om transmissie te voorkomen. Belangrijk is dat HIV-specifieke antilichamen (ABS) in BM zijn gecorreleerd met verminderde MTCT en/of een verminderde baby sterfte van HIV-infectie^22,23. Wat grotendeels onduidelijk blijft, is de bijdrage van de cellulaire fractie van BM aan zijn antivirale kwaliteiten.

Veel ABS vergemakkelijkt een verscheidenheid aan antivirale activiteiten die worden gemedieerd door de ' constante ' regio van het immunoglobuline molecuul, het kristalverbare fragment (FC), via interactie met FC receptoren (FcRs) gevonden op vrijwel alle aangeboren immuuncellen, vrijwel allemaal zijn te vinden in Human BM²⁴. Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) is aangetoond indien nodig voor de klaring van virale infecties en is onderonderzocht in het geval van preventie van MTCT van HIV^{25,26,27, 28 , 29}. gezien de schaarste van kennis over de potentiële bijdrage van de ADCP-activiteit door BM fagocyten aan de preventie van MTCT van HIV, hebben we ons gericht op het ontwikkelen van een rigoureuze methode om cellen te isoleren van menselijke BM om een studie te verrichten van ADCP gemedieerd door cellen uit BM verkregen in verschillende stadia van de lactatie.

Protocol

Elke deelnemer aan deze studie werd gerekruteerd en geïnterviewd in overeenstemming met de goedkeuring van de ethische en institutionele Review Board (IRB) met de begeleiding en toestemming van het Mount Sinai-programma voor de bescherming van menselijke proefpersonen (PPH'S) met behulp van een IRB-goedgekeurde protocol voor het verkrijgen van borst melkmonsters.

1. doel microsphere voorbereiding

1. Selecteer een relevant doel antigen.
   Opmerking: in dit voorbeeld werd het recombinant eiwit V1V2-2F5K gebruikt, dat ontworpen was om de trimere Apex van inheemse HIV-envelop³⁰na te bootsen.
2. Voer biotinylatie uit met behulp van een commerciële Kit (tabel met materialen) volgens het Protocol van de fabrikant.
   1. Bereken mmol van het biotinereagens om toe te voegen aan de reactie voor een 5-voudige molaire overmaat met behulp van de formule: mmol Biotine = ml proteïne x (mg eiwit/ml eiwit) x (mmol Biotine/mg proteïne) x (5 mmol Biotine/mmol proteïne)^30,31. Bereken vervolgens μL van het biotinereagens om toe te voegen met behulp van de formule: μL Biotine = mmol Biotine x (1.000.000 μL/L) x (L/10 mmol).
   2. Equilibrumbiotine op kamertemperatuur voor het openen. Los eiwitten op in 0,5 − 2,0 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) volgens de bovenstaande berekening.
   3. Bereid een 10 mM-oplossing van biotinereagens in dimethylsulfoxide (DMSO) en voeg het juiste volume van 10 mM Biotine reagens toe aan de eiwit oplossing en inbroed de reactie op ijs gedurende 2 uur of bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
3. Verwijder overtollig Biotine met proteïne concentrators (polyethersulfone [PES] membranen, 3 kDa molecuulgewicht cut-off [MWCO], 0,5 mL; Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Steek het monster in de bovenste kamer van de spin kolom en voeg PBS toe tot 400 μL. dop en steek deze monsterkamer in een verzamelbuis. Centrifugeer op 12.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
   2. Gooi de doorstroming weg en voeg PBS toe aan 400 μL. herhaald centrifugeren. Gooi de doorstroming weg en voeg PBS toe aan 100 μL. meet de eiwitconcentratie door een spectrofotometer.
      Opmerking: eiwitten kunnen worden alicgeciteerd en bevroren bij-80 °C totdat ze worden gebruikt.

2. antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) test plaat preparaat

1. Geconjugeerde biotinyleerd proteïne tot 1 μm microsferen (' kralen '; Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Per plaat van geconjugeerde kralen, inbroed 6 μg eiwit met 12 μl voorraad kralen in 200 μl 0,1% boviene serumalbumine (BSA)-PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, grondig zachtjes elke 20 min.
   2. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 5 min. Gooi supernatant weg, Vortex zachtjes en respendeert in 1200 μL van 0,1% BSA-PBS. Herhaal de spin en spoel stap 2x. Respenderen in 1200 μL van 0,1% BSA-PBS.
2. Aliquot 10 μL kraal oplossing per put in een ronde bodem 96-well plate. Bereid verdunningen van antilichamen of immuunsera die van belang zijn in 12 μL van 2% HBSS, meestal beginnend met 50 μg/mL antilichaam of een 1/100 serumverdunning.
   Opmerking: in de voorbeeldgegevens werd monoklonaal antilichaam (mAb) 830A gebruikt.
3. Voeg 10 μL getitreerd antilichaam/sera toe aan de kraal plaat en incuberen gedurende 2 uur bij 37 °C. Voeg 200 μL van 2% HSA HBSS toe aan elke put en centrifuge plaat bij 2.000 x g gedurende 10 min.
4. Verwijder voorzichtig supernatant door een snelle ommekeer en decanteren van vloeistof van de plaat putten in een gootsteen om te voorkomen dat de onzichtbare kraal pellet wordt verstoord.

3. borst melk celisolatie

1. Verkrijgen van menselijke moedermelk van gezonde zogende vrouwen, uitgedrukt met behulp van dubbele elektronische of handmatige pompen. Isoleercellen binnen ~ 4 h van expressie, melk bij kamertemperatuur houden.
2. Gebruik 50 mL tubes, centrifuge 50 mL melk bij 800 x g gedurende 15 min. Giet de magere melk en het vet voorzichtig af terwijl u de celpellet ongestoord verlaat. Veeg de binnenkant van de buis af met een pluisvrij doekje om alle vetten uit de buiswand te verwijderen.
3. Voeg 10 ml 2% humane serumalbumine toe in de gebalanceerde zoutoplossing van Hank (2% HSA HBSS [zonder ca.^{2 +} of mg⁺]). Rebreng de pellet door voorzichtig pipetteren om celactivatie en apoptosis te voorkomen. Breng aan op een buis van 15 mL en centrifugeer bij 450 x g gedurende 10 minuten.
4. Giet de supernatant af en herhaal stap 1,3. Vervolgens, voorzichtig respenderen cellen in 1 − 2 mL van 2% HSA HBSS afhankelijk van verwachte celnummer, en cellen tellen door een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller, opmerkend ook de levensvatbaarheid van de cel.

4. ADCP-bepaling

Opmerking: hier beschreven methoden zijn aangepast van Ackerman et al.³².

1. Voeg 50.000 vers geïsoleerde BM-cellen toe aan elke ADCP-test plaat goed in 200 μL van 2% HSA-HBSS. Inincuberen voor 2 uur bij 37 °C.
   1. Voor controle-experimenten, pre-Incubate cellen bij 37 ° c met 10 μg/mL actine remmer (cytochalasin-D), 50 μg/mL FcR-blokkerende agent (FcBlock), of een combinatie van beide vóór hun toevoeging aan de platen.
2. Centrifuge plaat bij 930 x g gedurende 10 min. Voeg 200 μL van 2% HSA HBSS toe en herhaal centrifugeren. Verwijder voorzichtig supernatant zoals in stap 2,7 en herhaal wassen.
3. Verwijder zorgvuldig supernatant-en vlek cellen voor levensvatbaarheid met 0,5 μg/ml (eindconcentratie) corrigeerbare levensvatbaarheid vlek 450 per put in 50 μL van 2% HSA HBSS. Inincuberen 20 min bij kamertemperatuur in het donker. Centrifuge plaat bij 930 x g gedurende 10 min en verwijder supernatant zoals in stap 2,7. Voeg 200 μL van 2% HSA HBSS en centrifuge plaat opnieuw toe, gevolgd door verwijdering van supernatant zoals in stap 2,7.
4. Na levensvatbaarheid kleuring, vlek cellen voor leukocyten markers van belang, minimaal met een CD45-specifieke vlek zoals PE-muis anti-menselijke CD45 (kloon HI30) in een geoptimaliseerde concentratie (1 μg/μL in 50 μL van 1% BSA HBSS in de voorbeeldgegevens).
   Opmerking: eventuele Lineage-specifieke markeringen van belang kunnen worden opgenomen.
5. Inincuberen 20 min bij kamertemperatuur in het donker. Centrifuge plaat bij 930 x g gedurende 10 min en verwijder supernatant zoals in stap 2,7. Voeg 200 μL van 1% BSA HBSS toe en herhaal centrifugeren. Verwijder supernatant. Repareer cellen in 200 μL van 0,5% formaldehyde in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min of 's nachts bij 4 °C. Koel in het donker tot de analyse.

5. analyse doorstroming cytometrie

1. Voer initiële gating uit om dubbeltjes op een forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC) plot en puin (materiaal kleiner dan FSC = 5000) te elimineren (Zie Figuur 1). Gebruik een SSC vs. levensvatbaarheid vlek (V450 in dit geval) plot om dode cellen te elimineren (die positief zijn voor de levensvatbaarheid vlek).
2. Gebruik een SSC vs. CD45 plot om de belangrijkste leukocyten klassen (Granulocyten, monocyten, lymfocyten) te differentiëren zoals uitvoerig beschreven^33,34.
   Opmerking: deze classificatie is alleen suggestieve en Lineage-specifieke markeringen nodig zijn om te bevestigen celtype.
3. Meet voor alle CD45 + cellen, of voor elke interesse groep van leukocyten, ADCP-activiteit door te gaten met een marker op de parel-positieve cellen in een histogram van het fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-kanaal, waar de fluorescerende kralen worden gedetecteerd.
   Opmerking: de negatieve controle putten waarin kralen niet zijn toegevoegd, geven aan waar de parel-positieve cellen zichtbaar zijn in het histogram en dus waar de gating marker moet worden geplaatst.
4. Bereken ADCP scores als (mediane fluorescentie intensiteit [MFI] van parel-positieve cellen) x (% van de totale CD45 + cellen in de positieve populatie). Gebruik grafische software om scores te tekenen bij elke AB/serumconcentratie en om een Area-under-the-Curve (AUC)-analyse uit te voeren.
   Opmerking: ADCP wordt als positief beschouwd als de AUC groter is dan 3x standaarddeviatie van de ADCP Score AUC van een niet-specifieke negatieve controle mAb (in dit geval 3865).

Resultaten

Melk kan op kamertemperatuur of koeler worden gehouden (hoewel niet bevroren); echter, gezien het feit dat we verminderde levensvatbaarheid hebben waargenomen wanneer melk erg koud is gehouden (gegevens niet weergegeven), en dat het eenvoudiger is om te verzamelen, kort op te slaan en te vervoeren bij omgevingstemperaturen, wordt aanbevolen dat de monsters niet gekoeld worden om de variabiliteit in monster-to-sample. In melk verkregen 7 − 183 dagen post-partum, celconcentratie bepaald doo...

Discussie

De flow cytometrie-gebaseerde techniek voor het meten van de ADCP-activiteit beschreven in dit document werd voor het eerst beschreven in 2011³⁰ en is sindsdien robuust en aangehaald in meer dan 80 studies. Het hier beschreven protocol past deze techniek voor de eerste keer aan voor gebruik met primaire BM-cellen. Eerdere studies met FC-gemedieerde functionaliteit van BM Cells zijn grotendeels beperkt tot het meten van oxidatieve uitbarstingen of op histologie gebaseerde fagocytose assays met cell...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres	Thermo Fisher	F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD	560975
Bovine serum Albumin	MP Biomedicals	8810025
Corning V-bottom polystyreen 96-well plate	Corning	3894
Cytochalasin D	Sigma	22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit	Thermo Fisher	21338
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352196
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070
Fixable Viability Stain 450	BD	562247
Formaldehyde solution	Sigma	252549
HBSS zonder Calcium, Magnesium of Fenol Rood	Life Technologies	14175-095
Human BD Fc Block	BD	564219
Human Serum Albumin	MP Biomedicals	2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34120
PBS 1x pH 7.4	Thermo Fisher	10010023
Polystyrene 10 mL Serological Pipettes	Corning	4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL	Pierce	88512