Moedermelk zendt humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hoewel slechts ~ 15% van zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd raken. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel deze cellen zijn onderonderzocht. Hier beschrijven we de isolatie van moedermelk leukocyten en een analyse van hun fagocytische capaciteit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zelfs bij afwezigheid van antiretrovirale geneesmiddelen, wordt slechts ~ 15% van de zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd, wat duidt op een sterk beschermend effect van moedermelk (BM). Tenzij de toegang tot schoon water en de juiste zuigelingenvoeding betrouwbaar is, raadt de WHO het staken van de borstvoeding voor HIV-geïnfecteerde moeders niet aan. Talrijke factoren waarschijnlijk werken in tandem om BM transmissie te verminderen. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel wat grotendeels onduidelijk blijft is de bijdrage van deze cellen aan de ANTIVIRALE kwaliteiten van BM. op dit moment waren we gericht op het isoleren van cellen van menselijke BM om te meten antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP), een van de meest essentiële en pervasieve aangeboren immuunresponsen, door BM fagocyten tegen HIV-doelwitten. Cellen werden geïsoleerd uit 5 menselijke BM monsters verkregen in verschillende stadia van de lactatie. Isolatie werd uitgevoerd via zachte centrifugeren gevolgd door zorgvuldige verwijdering van melkvet en herhaald wassen van de celpellet. Fluorescerende parels bedekt met HIV-envelop (env) epitoop werden gebruikt als doelstellingen voor analyse van ADCP. Cellen werden bevlekt met de CD45 oppervlakte marker om leukocyten te identificeren. Er werd vastgesteld dat ADCP-activiteit significant was boven controle-experimenten en reproduceerbare meetbaar met behulp van een HIV-specifiek antilichaam 830A.
Inleiding
Menselijke moedermelk (BM) bestaat uit moeder cellen die > 90% levensvatbaar1. Cel samenstelling wordt sterk beïnvloed door het stadium van de lactatie, gezondheidstoestand van moeder en zuigeling, en individuele variatie, die blijft slecht begrepen1,2,3,4. Gezien het feit dat BM ~ 103− 105 leukocyten/ml bevat, kan worden geschat dat zuigelingen met borstvoeding ongeveer 105− 108 moeder leukocyten per dag innemen5. Verschillende in vivo studies hebben....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Elke deelnemer aan deze studie werd gerekruteerd en geïnterviewd in overeenstemming met de goedkeuring van de ethische en institutionele Review Board (IRB) met de begeleiding en toestemming van het Mount Sinai-programma voor de bescherming van menselijke proefpersonen (PPH'S) met behulp van een IRB-goedgekeurde protocol voor het verkrijgen van borst melkmonsters.
1. doel microsphere voorbereiding
- Selecteer een relevant doel antigen.
Opmerking: in dit voorbeeld werd het recombinant eiwit V1V2-2F5K gebruikt, dat ontworpen was om de trimere Apex van inheemse HIV-envelop30n....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Melk kan op kamertemperatuur of koeler worden gehouden (hoewel niet bevroren); echter, gezien het feit dat we verminderde levensvatbaarheid hebben waargenomen wanneer melk erg koud is gehouden (gegevens niet weergegeven), en dat het eenvoudiger is om te verzamelen, kort op te slaan en te vervoeren bij omgevingstemperaturen, wordt aanbevolen dat de monsters niet gekoeld worden om de variabiliteit in monster-to-sample. In melk verkregen 7 − 183 dagen post-partum, celconcentratie bepaald doo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De flow cytometrie-gebaseerde techniek voor het meten van de ADCP-activiteit beschreven in dit document werd voor het eerst beschreven in 201130 en is sindsdien robuust en aangehaald in meer dan 80 studies. Het hier beschreven protocol past deze techniek voor de eerste keer aan voor gebruik met primaire BM-cellen. Eerdere studies met FC-gemedieerde functionaliteit van BM Cells zijn grotendeels beperkt tot het meten van oxidatieve uitbarstingen of op histologie gebaseerde fagocytose assays met cell.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Susan Zolla-Pazner in het departement geneeskunde en departement microbiologie aan de Icahn school of Medicine op de berg Sinai voor manuscript Review. Het NIH/NICHD verstrekte financiering voor dit project onder grantnummer R21 HD095772-01A1. Daarnaast werd R. Powell gesteund door fondsen van de afdeling geneeskunde, afdeling besmettelijke ziekten, Icahn school of Medicine op de berg Sinaï.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyreen 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS zonder Calcium, Magnesium of Fenol Rood | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10 mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
Referenties
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrit....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
