Middelgrote voorbereiding voor de teelt van micro-organismen onder strikt anaerobe/anoxische condities

Samenvatting

Zoals de verplicht anaerobe organismen niet kunnen groeien bij zuurstof blootstelling, is het gebruik van anaerobe kweektechnieken onontbeerlijk. Hier tonen we een eenvoudige en effectieve methode om een gemengde cultuur te cultiveren die is afgeleid van een biogasinstallatie van media voorbereiding tot gas en vluchtige vetzuur kwantificering.

Samenvatting

In tegenstelling tot aërobe organismen, strikt anaerobe micro-organismen vereisen de afwezigheid van zuurstof en meestal een lage redox potentieel om groei te initiëren. Omdat zuurstof alomtegenwoordig is in de lucht, is het vasthouden van₂-vrije condities tijdens alle stappen van de teelt uitdagend, maar een voorwaarde voor anaerobe kweek. Het hier gepresenteerde protocol toont de succesvolle teelt van een anaerobe gemengde cultuur, afgeleid van een biogasinstallatie, met behulp van een eenvoudige en goedkope methode. Een precieze beschrijving van het gehele anoxische kweekproces wordt gegeven, inclusief media voorbereiding, vulling van kweek kolven, suppletie met redox-indicator en reducerende middelen om lage redox potentialen te bieden, evenals het uitwisselen van de headspace om media vrij van zuurstof. Verder wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van het aseptisch inoculeren van gasdichte serum kolven (door gebruik te maken van steriele spuiten en naalden) en geschikte incubatie condities. Dit protocol behandelt verder de bemonstering van gas en vloeistoffen voor latere analyses met betrekking tot de gassamenstelling en de vluchtige vetzuur concentraties met behulp van gaschromatografie (GC) en hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), en de berekening van biogas-en methaan opbrengst gezien de ideale gaswet.

Inleiding

Op aarde moleculaire zuurstof in opmerkelijke concentraties is beschikbaar in gebieden met direct contact met de atmosfeer of in de aanwezigheid van Oxygene fototrophs. Omgevingen waarin zuurstof ontbreekt worden anaerobe genoemd. Echter, Energieconversie is nog steeds mogelijk onder anaerobe condities via twee verschillende metabole processen, fermentatie en anaerobe ademhaling¹.

Terwijl organismen die aërobe ademhaling ondergaan zuurstof gebruiken als een terminale elektron acceptor, vereist anaerobe ademhaling alternatieve elektron acceptoren zoals nitraat of sulfaat². In de zogenoemde "elektronen toren" worden redox koppels georganiseerd volgens hun redoxpotentiaal, met de meest negatieve aan de top (elektron donoren) en de sterkste oxidatiemiddelen met positieve redoxpotentiaal onderaan (elektron acceptors). De elektron overdracht tussen donoren en accepteurs leidt tot energiebesparing via de zogenaamde Ademhalings keten en elektronen kunnen worden opgevangen door elektronen acceptoren-om in de foto te blijven-in verschillende verdiepingen van de toren. Daardoor, hoe hoger de val van elektronen door de elektronen toren, hoe meer energie kan worden behouden door de respectieve reactie. Daarom is ademhaling ook mogelijk in anaerobe habitats, bijvoorbeeld met redox paren, waaronder geen₃^-/No₂^-, fumarinezuur/BARNSTEENZUUR, dus₃^2-/u₂s, s °/u₂s, MN (IV)/mn (II ), Fe (III)/Fe (II)^2,3. Eerste, de resulterende energie wordt bewaard als membraanpotentiaal, die vervolgens wordt gebruikt door elektron transport fosforylering voor adenosine-trifosfaat (ATP) synthese door membraan gebonden ATP-synthases. In tegenstelling tot aërobe ademhaling, de hoeveelheid energie die kan worden bewaard door anaerobe ademhaling kan drastisch worden verminderd; echter, de energie-output van de meeste anaerobe ademhaling is nog steeds hoger in vergelijking met fermentatie, een anaerobe energiebeschermingsweg in habitats die geen zuurstof en andere terminale elektron acceptoren².

Tijdens de fermentatie worden energierijke, organische substraten afgebroken tot verschillende fermentatie producten die vaak de naam van het totale proces definiëren, bijvoorbeeld alcoholische fermentatie. In tegenstelling tot Ademhalings processen is de ATP-generatie tijdens de fermentatie beperkt tot substraat niveau fosforylering waarbij een fosfaatgroep wordt overgebracht naar adenosine-di-fosfaat (ADP) van een energierijke fosforyleerd substraat². Het fermenteren van micro-organismen speelt een centrale rol bij de anaerobe afbraak van organisch materiaal, omdat het belangrijke spelers in de substraat afbraak zijn. De primaire fermentatie producten, zoals organische zuren, alcoholen, CO₂en h₂, kunnen vervolgens worden gebruikt door secundaire fermenterende micro-organismen om azijnzuur, co₂en h₂te produceren. Voorbeelden van fermentatie producten zijn melkzuur, verschillende vluchtige vetzuren (mieren-, azijnzuur-, propion-, Butyric-, valerische zuren), n-butanol, 2, 3-butandiol, aceton en ethanol.

De teelt van micro-organismen onder strikt anaerobe omstandigheden vereist totaal verschillende methoden en apparatuur in vergelijking met de teelt van aërobe organismen. Terwijl zuurstof tolerante organismen vaak worden gekweekt op agar-gerechten, zogenaamde oppervlakte culturen, is dit-met een paar uitzonderingen-nauwelijks mogelijk voor strikt anaerobe micro-organismen. Daarom worden verrijkings culturen van strikt anaerobe micro-organismen voornamelijk vastgesteld in vloeibare media die kweekvaten met gasdichte septa aanbrengen die een zuurstofvrije ruimteatmosfeer van^{4,6, 7}.

De huidige protocol beschrijving voorziet in passende teeltmethoden voor doel-micro-organismen van een gemengde populatie die afkomstig zijn van een anaerobe biogasinstallatie. De isolatie en teelt van zuivere culturen is nog uitdagender, maar maakt geen deel uit van dit werk.

Hier tonen we de procedure voor het cultiveren van een anaerobe microbiële Gemeenschap op basis van een studie over de vorming van fenylzuren tijdens anaerobe vergisting van Proteïnurie⁸. De microbiële Gemeenschap bestond uit leden uit alle vier fasen van anaerobe vergisting: hydrolyse, acidogenese, acetogenese en methanogenese. Een mineraal zout medium aangevuld met een koolstofbron, redox-indicator, vitamine-en spoorelement oplossing en reduceermiddel werd toegepast⁹. Het medium werd gewijzigd met de respectieve proteinaceeuze fenyl zuur precursor substraten⁸.

Protocol

1. bereiding van de middel

1. Bereiding redox indicator Stock Solution (0,1 g resazurin/100 mL waterige oplossing).
2. Bereid vitamine oplossing (tabel 1).
3. Traceer element oplossing voorbereiden (tabel 2).
   Opmerking: de volgorde van optellen is belangrijk; Raadpleeg tabel 2 en de respectieve protocollen.
4. Bereid reductie agent Stock Solution (60 g na₂S/L waterige oplossing).
5. Weeg middelmatige ingrediënten (mineraal zout medium, tabel 3) in een geschikte kolf (bijv. een schroefdop laboratorium kolf van 1 L).
   Opmerking: afhankelijk van de experimentele instellingen kan het nodig zijn de toevoeging van een afzonderlijke koolstofbron te doen.
6. Voeg half volume gedistilleerd water toe (tabel 3) en los de ingrediënten op.
7. Voeg 1 mL redox-indicatoroplossing toe volgens tabel 3.
8. Voeg vitamine-en spoorelement-oplossing toe volgens tabel 3.
9. Pas de pH aan volgens de eisen van het medium/organisme in tabel 3.
   Opmerking: de kleur van de redox-indicator is pH-afhankelijk en kan enige tijd nodig hebben om aan te passen.
10. Breng tot een eindvolume van 1 L met gedestilleerd water.
    Opmerking: vitamine-en spoorelement oplossingen kunnen ook na Autoclaveren worden toegevoegd door aseptisch een filter gesteriliseerde aliquot (verdunde oplossingen, filter poriegrootte < 0,2 μm) toe te voegen aan eerder gesloten en geautoclaveerd serum kolven. Deze aanpak draagt echter een verhoogd risico op verontreiniging.

2. vulling van de kweek kolven

1. Grondig reinigen en drogen van 120 mL serum kolven.
   Opmerking: serum kolven zijn verkrijgbaar in verschillende volume capaciteiten (bijv. 20, 60, 120, 250 mL).
2. Grondig schoon en droog butylrubber septa.
3. Weeg extra medium componenten (bijv. fenyl zuur precursor substraten) in de kweek kolven af.
   Opmerking: aanvullende componenten zijn afhankelijk van experimentele instellingen en hypothese.
4. Vul de serum kolven met 50 mL medium.

3. vermindering/verwijdering van zuurstof in de vloeibare fase

1. Maak een ~ 100 ° C waterbad.
2. Zet gevulde serum kolven in het waterbad en inbroed ca. 20-30 min om de oplosbaarheid van O₂ in de vloeistoffase te verminderen.
3. Spoel de headspace onmiddellijk met N₂ gas of als alternatief met andere gas-of gasmengsels zoals n₂/co₂.
   Let op: zorg voor de juiste ventilatie van de ruimte.
4. Sluit de kolven met butylrubberen septa en bevestig met aluminium doppen.
   Let op: rubber septa kan vaak beter op de nek van de kolf passen door een druppel water/medium toe te voegen tijdens het boren.
5. Voeg 0,1 mL reduceermiddel (stamoplossing) toe aan elke kolf gevuld met 50 mL medium om de redoxpotentiaal verder te verminderen (0,1 mL reductiemiddel per 50 mL medium).
6. Autoclaaf gedurende 20 min bij 121 °C.
   Let op: er moet een autoclaaf gecertificeerd worden voor het steriliseren van gesloten vaten. Anders kan de overdruk die is afgeleid van de temperatuurstijging leiden tot een explosie van serum kolven.

4. inoculatie van het medium

1. Bereid entmateriaal van anaerobe digester.
   1. Voeg 400 mL gedestilleerd water in een kolf toe en breng het aan de kook.
   2. Koel het af (< 30 °C) en spoel de hoofdruimte permanent door met N₂.
   3. Voeg ca. 100 g slib toe dat is afgeleid van een anaerobe digester.
      Opmerking: vermijd overmatig contact van slib met zuurstof.
   4. Noteer de exacte massa van het toegevoegde slib voor de precieze bepaling van de verdunning.
   5. Wissel de hoofdruimte van de kolf uit met N₂ en sluit deze af met een tussenschot van butylrubber.
   6. Schud de kolf gedurende 30 minuten bij 120 rpm.
2. Verwijder 5 mL entmateriaal met behulp van de spuit + canule en Injecteer het in bereide serum kolven zoals beschreven in stap 1-3.

5. incubatie, bemonstering en analyse

1. Geïnculeerde serum kolven op een temperatuur die geschikt is voor het desbetreffende experiment.
   Opmerking: de incubatietemperatuur is afhankelijk van de experimentele opzet en het gebruikte entmateriaal.
   1. Afvoer overdruk als gevolg van de temperatuurstijging met behulp van spuit + canule, wanneer de vloeistof in de serum kolven is geëscaleerd tot incubatietemperatuur (ongeveer 15 – 30 min, afhankelijk van de incubatietemperatuur).
      Let op: afhankelijk van het toegepaste substraat kunnen de concentratie, temperatuur, incubatietijd, entmateriaal type en concentratie, overdruk binnen kolven oplopen tot > 2 bar druk en kunnen de serum flaks exploderen. Het bewaken van de overdruk met behulp van een manometer en vervolgens het aftappen van overdruk met een canule is daarom verplicht.
2. Evalueer de productie en samenstelling van biogas tijdens de incubatietijd.
   Opmerking: incubatietijd kan enkele dagen tot enkele weken duren.
   1. Huidige atmosferische druk vastleggen.
   2. Maak een manometer en evalueer de druk in de kolven die zijn afgeleid van microbiële activiteit.
   3. Schud de kolven.
   4. Verwijder 1 mL headspace-gas met behulp van een spuit + canule en meet de concentraties H₂, O₂, CH₄en/of co₂ via gaschromatografie.
      Opmerking: voor de kwalificatie en kwantificering van H₂, O₂, CH₄en co₂ werd een gaschromatograaf gebruikt met gebruik van bedrijfstemperaturen van 160 °c (kolomoven), 100 °c (injector) en 180 °C (thermische geleidbaarheids detector, tcd ). N₂ werd gebruikt als draaggas. Voor meer informatie, zie vorige studies¹⁰.
3. Controleer concentraties van vluchtige vetzuren (VFA) en fenyl-zuren. Gebruik voor VFA-en fenylzuuranalyse een HPLC-systeem dat is uitgerust met een UV-detector (bij 220 nm) met 5 mM H₂, dus₄ als mobiele fase. Voor de details van de methode en aanvullende informatie over de opslag van monsters, zie de vorige onderzoeken¹¹.
   NB: de analyse van VFA is voorbeeldig voor vele andere fysisch-chemische analyses of microscopische evaluaties. Bovendien kunnen moleculaire biologische methoden die gericht zijn op de overvloed aan specifieke micro-organismen en/of samenstelling van de microbiële Gemeenschap op een bepaald punt van het experiment, worden toegepast met behulp van de beschreven procedure.
   1. Verwijder 1 mL vloeistof met spuit + canule.
      Opmerking: monsters kunnen worden bevroren (-20 °C) onmiddellijk na intrekking en geanalyseerd aan het einde van het experiment¹¹.
   2. Centrifugeer bij 15000 – 20000 x g en passeren 0,2 μm RC (geregenereerde cellulose) filters.
   3. Injecteer 5-20 μL op een HPLC-systeem en analyseer de VFA-samenstelling en concentratie van fenyl-zuren.
4. Overdruk van de afvoer kolf met behulp van een canule.
   Opmerking: plaats de kweek kolf na het bepalen van de druk-en gassamenstelling en het nemen van het benodigde monster terug op de respectieve temperatuur en laat de overdruk niet lopen voordat de vloeistof de incubatietemperatuur heeft bereikt.
5. Bereken biogas-en methaanproductie V_CH4N rekening houdend met de ideale gaswet met behulp van vergelijking 1-3. Zie ook tabel 4.
   Vergelijking 1:
   Waarbij
   Vergelijking 2:
   En
   Vergelijking 3:
   Opmerking: voor de berekening van de totale biogasproductie moet de hoeveelheid CH_4% en CH_{4% X} in vergelijking 2 en 3 worden ingesteld op 100. NmL: genormaliseerd gasvolume onder gestandaardiseerde omstandigheden (0 °C, 1 ATM), waaronder het molaire gasvolume 22,414 NmL/mmol is.

Resultaten

De kweek kolven werden gevuld met medium onder anaerobe condities volgens het hierboven beschreven protocol, gecontroleerd op de juiste kleur (Figuur 1) en worden gebruikt als miniatuur batch bioreactoren die anaerobe vergisting uitvoeren. Deze werden gewijzigd met substraten die mogelijk fenyl-zure vorming veroorzaakten en geïnineerd met behulp van anaerobe vergister slib als entmateriaal (Figuur 2). Tryptofaan, tyrosine, en fenylalanine, evenals de complexe proteinaceeuze precursor vleesextract en caseïne werden toegepast in twee en drie verschillende concentraties, respectievelijk. Controles werden bereid zonder extra substraat suppletie. Verschillende substraat concentraties gericht op de simulatie van verschillende stadia van overbelasting. Kolven werden gedurende 4 weken bij 37 °C (mesophilisch) geïnineerd.

De productie en samenstelling van biogas (H₂, CH₄, co₂) werd regelmatig gecontroleerd via GASCHROMATOGRAFIE (GC tcd)¹⁰ en evaluatie van de hoofdruimte druk. Figuur 3 toont de verschillen in de cumulatieve methaanproductie, afgeleid van de vertering van de toegepaste substraten in verschillende concentraties gedurende 4 weken anaerobe incubatie. Behalve, methanogenen werden gevisualiseerd door bestraling van het co-enzym F₄₂₀, een elektron drager in de methanogenese, exposeren een blauw-groene fluorescentie met een absorptiemaximum bij 420 nm (Figuur 4).

Gelijktijdig met de gasanalyse werden monsters voor VFA en fenylzuurconcentratie metingen via HPLC¹¹ ingetrokken en bevroren opgeslagen tot verdere verwerking. Figuur 5 toont het effect van verschillende stadia van overbelasting, zoals weergegeven door een accumulatie in hoog overbelaste monsters die voor acetaat worden afgebeeld. Figuur 6 toont de dynamiek van fenyl acetaat concentraties tijdens de incubatieperiode.

Figuur 1: redox-indicator. De juiste redoxpotentiaal in de kweek kolven kan worden geregeld door een Redox indicator toe te voegen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: miniatuur batch bioreactoren. Miniatuur batch bioreactoren bereid in 120 mL teelt kolven voor anaerobe vergistings experimenten. Kolven waren gevuld met medium en geënt met verdund vergister slib. De reactoren waren gasdicht afgesloten met butylrubberen stoppers en aluminium doppen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: methaanproductie. Cumulatieve methaanproductie gedurende 28 dagen van mesofische incubatie van reactoren die verschillende overbelastingscondities weerspiegelen (laag, gemiddeld, hoog). CONT: controle; Tryp: tryptofaan; Tyr: tyrosine; PHE: fenylalanine; ME: vleesextract; CAS: caseïne. Dit is een gemodificeerde figuur uit een eerdere studie⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: fluorescerende methanogenen. Methanogens stoten een blauwachtig licht uit wanneer ze opgewonden zijn met UV-licht. Hier worden methanogenen bevestigd aan planten deeltjes (licht groen). Monsters werden genomen uit een batch reactor, verdund voor microscopie, en onmiddellijk geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: acetaat concentratie. Acetaat concentratie gedurende 28 dagen van mesofische incubatie in reactoren die verschillende overbelastingscondities weerspiegelen (laag, gemiddeld, hoog). CONT: controle; Tryp: tryptofaan; Tyr: tyrosine; PHE: fenylalanine; ME: vleesextract; CAS: caseïne. Dit is een gemodificeerde figuur uit een eerdere studie⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Fenylacetaat-concentratie. Fenylacetaat-concentratie gedurende 28 dagen van mesofische incubatie in reactoren die verschillende overbelastingscondities weerspiegelen (laag, gemiddeld, hoog). CONT: controle; Tryp: tryptofaan; Tyr: tyrosine; PHE: fenylalanine; ME: vleesextract; CAS: caseïne. Dit is een gemodificeerde figuur uit een eerdere studie⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Resazurin-reactie. Blauw gekleurde resazurin ondergaat een onomkeerbare reductie naar resorufin (roze) en een verdere reversibele reductie naar de kleurloze dihydroresorufin volgens Uzarski et al.¹². Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Cyanocobalamine	0,050 g
4-aminobenzoinezuur	0,050 g
D-Biotine	0,010 g
Nicotininezuur	0,100 g
Pyridoxine	0,250 g
D-Pantotheenzuur	0,025 g
Thiaminium chloride HCl	0,18 g
Gedistilleerd water	1000 mL

Tabel 1: Vitamine oplossing.

25% (w/v) HCl	10,0 mL
FeCl2 x 4 H2O	1,50 g
ZnCl2	0,070 g
MnCl2 x 4 H2O	0,100 g
H3Bo3	0,006 g
CoCl2 x 6 H2O	0,190 g
CuCl2 x 2 H2O	0,002 g
NiCl2 x 6 H2O	0,024 g
Na2Moo4 x 2 H2O	0,036 g
Gedistilleerd water	990,0 mL
Voorbereiding aanbeveling	Voeg HCl toe en los FeCl2op, voeg 100 ml gedestilleerd water toe, Los de andere ingrediënten op en maak tot 1000 ml.

Tabel 2: oplossing voor spoorelementen.

Nacl	1,0 g
MgCl2 x 6 H2O	0,4 g
KH2po4	0,2 g
Kcl	0,5 g
CaCl2 x 2 H2O	0,15 g
L-cysteïne	0,5 g
Gistextract	1,0 g
Resazurin oplossing	1 mL
Vitamine oplossing	1 mL
Oplossing voor spoorelementen	1 mL
Gedistilleerd water	1000 mL
Ph	7,2

Tabel 3: minimaal zout medium.

Variabele	Eenheid	Beschrijving
tY	d	Tijdspunt van meting
tX	d	Tijdpunt van voorgaande meting
pM	mbar	Gemeten overdruk bij tY
pA	mbar	Omgevingsdruk bij tY
pAX	mbar	Omgevingsdruk bij tX
pS	mbar	Standaarddruk, 1013, 25 mbar acc. DIN 1343
TI	K	Incubatietemperatuur
TS	K	Standaardtemperatuur, 273, 15 K (komt overeen met 0 ° C) volgens DIN 1343
VH	ml	Headspace volume bij tY
VHX	ml	Headspace-volume bij tX
CH4%	[vol%]	Methaan concentratie volgens GC-meting bij tY
CH4% X	[vol%]	Methaan concentratie volgens GC-meting bij tX
VCH4T	Nml	Totale hoeveelheid methaan in de serum fles bij tY
VCH4R	Nml	Residueel methaan bedrag in de headspace bij tX
VCH4N	Nml	Nieuw geproduceerd methaan van tX tot tY

Tabel 4: beschrijving van de variabelen in vergelijking 1-3.

Discussie

De belangrijkste en cruciale stap in het kweken van anaerobe micro-organismen is het garanderen van zuurstofvrije omstandigheden in de kweekmedia en de headspace van de kolven. Een indicator zoals resazurin kan worden gebruikt om indirect de juiste anaerobe vulling van de kolven te controleren. Resazurin is een veelgebruikte redox-kleurstof omdat het goedkoop, niet-toxisch, en al effectief in lage doses en korte incubatietijd ¹². Wanneer opgenomen in de media, de blauwe gekleurde resazurin eerst ondergaat een onomkeerbare reductie stap naar resorufin, die roze met neutrale pH-waarden is. Deze eerste reactie kan optreden wanneer de media worden verwarmd ¹³. Vervolgens wordt resorufin gereduceerd tot kleurloze dihydroresorufin in een omkeerbare secundaire reactie (Figuur 7)¹². Het resorufin/dihydroresorufin redox-systeem wordt volledig kleurloos bij een standaard oxidatie-reductie potentiaal van ongeveer E_h =-110 MV en wordt roze boven een redoxpotentiaal van-51 MV ¹³.

Om de redoxpotentiaal verder te verminderen, bijvoorbeeld om de groei van methanogene micro-organismen te bevorderen waarvan bekend is dat ze minder dan-200 mV¹⁴nodig hebben, kan een na₂S-oplossing worden toegevoegd. Als alternatief, cysteïne-HCl, natrium-thioglycolate, of natriumdithioniet worden vaak gebruikt. Echter, welke reducerende agent is geschikt voor gebruik is afhankelijk van de respectieve experimentele Setup en kan speciale aandacht vereisen. Natriumthioglycolaat heeft bijvoorbeeld temperatuur activatie nodig (bijv. door autoclaven).

Een goed uitgebalanceerd microbieel consortium, bestaande uit verschillende geslachten van bacteriën en archaea, en een efficiënt werkende anaerobe afbraak Cascade kunnen verder worden geëvalueerd door het bepalen van de headspace-gassamenstelling in de cultuur kolven via gas Chromatografie. Bij het hanteren van verbindingen zoals fenyl-zuren afgeleid van verschillende precursoren, de beoordeling van de headspace is een snelle manier om te controleren van de methaanvorming proces⁸. Een headspace CH₄ -concentratie van ca. 50-60% in de controles aan het einde van de incubatieperiode duidt op een succesvolle benutting van de toegepaste nutriënten en dus een mineralisatie van organisch materiaal onder anaerobe condities. De theoretische methaanproductie en de expectable methaan concentraties tijdens het verteringsproces kunnen ex ante worden bepaald volgens de buswell-Boyle vergelijking na elementaire analyse van het substraat of door het inschatten van de inhoud van koolhydraten, eiwitten en vetten in het substraat. Volgens VDI 4630 ¹⁵kunnen koolhydraten leiden tot een theoretische biogasproductie van 750 L kg^-1 VSS (50% CH₄ en 50% CO₂), eiwitten tot 800 l kg^-1 VSS (72% CH₄ en 28% co₂), en vetten tot 1.390 l kg ^-1- VSS (60% CH₄ en 40% co₂).

Bovendien werden de vorming en de mogelijke daaropvolgende afbraak van VFAs en fenyl zuren gemonitord. Het afbraakproces kan worden geëvalueerd door de VFA-concentraties (bijv. acetaat, propionaat) op verschillende tijdstippen te analyseren. Accumulatie van korte-keten vetzuren zoals acetaat en/of propionaat kan wijzen op verstoringen in de methanogene samenstelling van de Gemeenschap en op een algehele overbelasting van de reactor. Echter, een evenwichtige microbiële degradatie Cascade kan zelfs omgaan met zeer hoge VFA en acetaat concentraties⁹. Bovendien kan de acetaat/propionaat-verhouding verder informatie verschaffen over de algehele reactor conditie¹⁶. Er zijn echter veel parameters geschikt voor procesbewaking die moeten worden geselecteerd volgens de voorgestelde experimentele hypotheses. In het onderhavige voorbeeld waren de doelvariabelen Fenylzuur concentraties (Figuur 6).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
culture flasks (120 mL, N20)	Ochs, Duitsland	102046
buty rubber septa (N20)	Ochs, Duitsland	102049
aluminium caps (N20)	Ochs, Duitsland	102050
N2 gas	Messer, Oostenrijk		zuiverheid 5.0
syringes + cannulae	diversen
crimper	Ochs, Duitsland	102051
de-crimper	Ochs, Duitsland	102052
GC2010	Shimadzu
Shin-carbon GC column	Restek		chromatografische scheiding van H2, O2, CH4 en CO2
HPLC Prominence	Shimadzu
Fast Fruit HPLC Column	Phenomenex		chromatografische scheiding van VTZ's, fenylzuren, enz.