Meting van Chitinase activiteit in biologische monsters

Samenvatting

Hier gepresenteerd is een eenvoudige methode voor het meten van Chitinase activiteit in biologische vloeistoffen zoals bronchoalveolaire spoeling of serum.

Samenvatting

Chitinasen zijn de enzymen die het aankleven van chitin. Zelfs bij afwezigheid van chitine hebben zoogdieren aanzienlijke hoeveelheden chitinases aanwezig in het lichaam, waaronder bij Baseline. De precieze rol van Chitinase is niet bekend, maar het werd verondersteld om een belangrijke rol te spelen in de spijsvertering en gastheer verdediging tegen chitin-bevattende voedsel en pathogenen, respectievelijk. Recent werk, met inbegrip van de onze, heeft een belangrijke rol getoond van Chitinase en Chitinase-achtige eiwitten in gastheer immuniteit en allergische ziekten. Belangrijk, Chitinase activiteiten dienen als belangrijke biomarkers van de ernst van de ziekte in een breed scala van ziekten, met inbegrip van type 2 ontstekingsziekten zoals astma en pulmonale fibrose. Evenzo hebben patiënten met genetische aandoeningen zoals de ziekte van Gaucher de Chitinase-niveaus significant verhoogd, die niet alleen correleren met de ernst van de ziekte, maar ook dienen als een betrouwbare biomarker voor therapeutische effectiviteit. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een eenvoudige, snelle en eenvoudige manier om Chitinase-activiteit in BAL-of serummonsters van muizen te meten en kan op grote schaal worden aangepast aan menselijke proefpersonen en andere model organismen als gevolg van de sterk geconmaelde aard van de enzymen.

Inleiding

Chitine is de op een na meest overvloedige polysaccharide op aarde na cellulose en fungeert als een belangrijke structurele component van een verscheidenheid aan organismen, waaronder het exoskelet van insecten, schimmels, gist en algen; Sommige gewervelde dieren hebben ook chitine¹. Chitinases zijn een familie van enzymen die in staat zijn chitine af te breken en worden sterk geconconserd door de evolutie in soorten variërend van bacteriën tot zoogdieren^2,3. Naast chitinases hebben zoogdieren ook Chitinase-achtige eiwitten die vergelijkbaar zijn met chitinases in hun vermogen om chitine te binden, maar verschillen in die zin dat ze het enzymatische vermogen missen om de chitine⁴te klieven.

Hoewel chitine en chitinases al lang bestudeerd zijn — met onderzoeken die dateren uit de vroege jaren 1900 — lag de nadruk op hun rol in insecten en andere ongewervelde dieren. In feite was het pas in de jaren zestig, toen gewervelde dieren in het geheel chitinases bleken te hebben. Met behulp van een op chitobiase gebaseerde assay bleken chitinases te worden gevonden in het spijsverteringskanaal van een aantal gewervelde dieren, waaronder hagedissen en Merel — een observatie veronderstelde te wijten aan het gebruik van chitine bevattende organismen zoals insecten⁵ .

Zoogdieren hebben twee enzymatisch actieve vormen van Chitinase: zure zoogdier Chitinase (AMCase; ook bekend als CHIT2 en CHIA) en chitotriosidase (CHIT1)⁴. Beide eiwitten zijn geschikt voor het hydrolyseren van chitine. Echter, CHIT1 is meer enzymatisch actief bij de mens, waar bijna alle Chitinase activiteit is afgeleid van CHIT1. ⁴ bij muizen dragen zowel Chit1 als amcase bijna evenveel bij aan de algehele activiteit van Chitinase⁶. Aan de andere kant, Chitinase-achtige eiwitten missen Chitinase activiteit.

Chit1 wordt voornamelijk uitgescheiden door macrofagen en wordt vaak beschouwd als een immuunrespons op chitine bevattende pathogenen⁷. Het enzym is ook betrokken bij de rijping van monocyten in zowel M1 en m2 macrofaag subtypen, zelfs zonder de aanwezigheid van het substraat chitine⁸. Bovendien, het kan ook worden betrokken bij de rijping van andere immuuncellen, met inbegrip van T helper type 2 (Th2) cellen en eosinofielen — zoals bleek het geval te zijn in crypto Kokken longinfectie⁹. Deze studies wijzen op een complexe rol van chitinases in het immuunsysteem.

In de afgelopen jaren, Chit1 niveaus zijn gevonden om te dienen als een belangrijke biomarker van progressie voor meer dan 40 verschillende ziekten van de mens, met inbegrip van lysosomale opslag ziekten, infectieziekten, ademhalingsziekten, endocrinologische ziekten, cardiovasculaire ziekten, neurologische aandoeningen, en anderen (beoordeeld¹⁰). In veel van deze ziekten, de niveaus van Chit1 zijn een sterke voorspeller van de ernst van de ziekte en therapeutische effectiviteit¹⁰.

Omdat chitinases een reputatie hebben opgebouwd als biomarker voor talrijke medische aandoeningen, waaronder de ziekte van Gaucher, zijn gereedschappen en assays ontwikkeld om het testen van de aanwezigheid van Chitinase te vergemakkelijken. Oudere methoden zijn onder meer de procedure van Schales, een protocol dat is aangepast aan een bloedglucose test en de methode met 3, 5 dinitrosalicyl zuur (DNS). Echter, deze methoden zijn vaak tijd gevoelig en technisch moeilijk¹¹. De procedure voor beide tests vereist de reductie van anorganische oxidanten, ferricyanide in het geval van de Schales-procedure, bijvoorbeeld het produceren van een kleurverandering die alleen spectrofotometrisch kan worden gemeten. Daarnaast hebben beide tests betrekking op een verwarmings-of kook stap die zowel tijdrovend als noodzakelijk is om de kleur^12,13te ontwikkelen.

Hier beschreven is een snelle en eenvoudige fluorimetrische assay om de Chitinase spiegels in zoogdier monsters^14,15te bepalen. Twee van de hier gebruikte monsters omvatten serum en bronchoalveolaire spoeling vloeistoffen (bal); Chitinase activiteit is ook gemeten in moedermelk en urine monsters, en de techniek kan worden uitgevoerd in dit soort monsters, alsmede in elke andere biologische vloeistof^16,17.

Protocol

Alle dier procedures werden uitgevoerd onder een IACUC-goedgekeurd protocol aan de Yale University School of Medicine.

1. voorbeeld verzameling van muizen

1. Esthetisering
   1. Anesthetiseer muizen met ketamine en xylazine (100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine).
2. Bloedmonster collectie
   1. Bevestig de diepte van de anesthesie door niet-responsiviteit op een teen knijpen.
   2. Open de borstholte chirurgisch om het hart bloot te leggen.
   3. Steek een 26,5 G naald in de linker ventrikel en verzamel bloed in een spuit.
      Opmerking: Meestal kan ongeveer 0,5 – 1 mL bloed worden geoogst van een gezonde 20 – 25 g muis.
   4. Verzamelen van het bloed in heparine buizen, voor plasma inzameling, of niet-gehepariniseerd buizen voor serum collectie.
3. Verzameling van bronchoalveolaire spoeling vloeistof (bal)
   1. Om de BAL te verzamelen, maak een verticale snede op de nek om de luchtpijp bloot te leggen.
   2. Cannulaat de luchtpijp met een 22 G katheter en bevestig het stevig met behulp van een string om lekkage uit de neus van de muis te voorkomen.
   3. Injecteer langzaam twee aliquots van steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,75 mL elk) in de longen via de luchtpijp en haal terug.
   4. Pool aliquots en blijf op ijs voor verdere analyse.
4. De verwerking van de biologische monsters.
   1. Bloedmonster: ofwel vers (plasma) of na het toestaan van coagulatie voor 4 uur (serum), centrifugeer bij 600 x g gedurende 10 minuten. Neem de supernatant en ofwel bevriezen voor opslag of gebruik voor experiment.
   2. BAL: Centrifugeer het monster bij 350 x g gedurende 5 min. Neem de supernatant en ofwel bevriezen voor opslag of gebruik voor experiment.

2. Chitinase-test

Opmerking: De wetenschap achter de assay is relatief eenvoudig. Een niet-fluorescerende substraat wordt gespleten door enzymatisch actieve Chitinase om een fluorescerend product te produceren, dat vervolgens wordt gemeten als een indirecte marker van Chitinase activiteit. De chitinases in de monsters breken het substraat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose aanwezig in de 1x McIlvain buffer. Een fluorescerende molecuul 4-methylumbelliferyl wordt vrijgegeven. Door de totale fluorescentie van elk goed te meten, verkrijgen we een nauwkeurige meting van de actieve Chitinase in elk monster. Omdat de afbraak van chitine door Chitinase een Hydrolytische reactie is, beëindigt de stop buffer, een mengsel van 0,3 M glycine en NaOH (12,0 g/L bij pH 10,6), de afbraak van chitine door een omgeving te creëren die te eenvoudig is om het enzym te laten functioneren.

1. Bereid de substraten, standaarden en oplossingen voor.
   1. De McIlvain-buffer voorbereiden. De McIlvain buffer bestaat uit 0,1 M citraat en 0,2 M fosfaat bij een pH van 5,2. Verdun met een verhouding van 1:1 voor 1x McIlvain buffer.
   2. Los zowel 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose en 4-methylumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetylchitotriose in 1x McIlvain buffer tot een concentratie van 500 μM elk.
      Opmerking: Stock oplossing kan bij-20 °C worden opgeslagen voor verder gebruik; beste opgeslagen in aliquots.
   3. Los standaard 4-methylumbelliferone op tot een concentratie van 0,1 mM in de stop buffer (mengsel van 0,3 M glycine en NaOH (12,0 g/L bij pH 10,6)) om de standaard curve stockoplossing te creëren.
2. Creëer en plaat de werkoplossing.
   1. Combineer 1x McIlvain buffer en chitine substraat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose om de werkoplossing te creëren. Meng voor elke 10 monsters 100 μL substraat met 2,17 mL 1x McIlvain buffer. Zie tabel 1 voor aanvullende berekeningen op basis van de steekproefgrootte.
      Opmerking: Gebruik 4-methylumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetylchitotriose voor menselijke monsters. Hoewel beide substraten kunnen worden gecleaved door humane of muis enzymen, zijn ze toegewezen voor menselijke of muis monsters op basis van de efficiëntie van decolleté⁶.
   2. Pipetteer 95 μL werkoplossing in elke put van een 96-well plaat.
3. Voeg biospecimen monsters toe aan de werkoplossing.
   1. Voeg vervolgens 5 μL van het testmonster (bloed/BAL/weefsel lysaat/andere biologische vloeistof) toe aan elk goed.
   2. Meng het monster in de werkoplossing voor de nauwkeurigste en betrouwbaarste resultaten.
      Opmerking: Monsters moeten worden uitgevoerd in duplicaten/triplicaten met speciale aandacht besteed aan potentiële randeffecten. Alle monsters moeten vooraf worden opgewarmd om het randeffect te minimaliseren. Aangezien de test een reactie inhoudt tussen chitinases in het monster en substraat in de werkoplossing, is het het beste om relatief snel te werken om het verschil in tijd te minimaliseren tussen wanneer het eerste monster wordt verguld en het laatste monster wordt verguld. Multikanaalspipet wordt aanbevolen.
4. Incuberen bij 37 °C.
   1. Dek de plaat af en schud kort (5 s).
   2. Inincuberen van de plaat bij 37 °C gedurende 15 minuten. Hierdoor kan de enzymatische reactie plaatsvinden.
5. Bereid de standaard curve voor.
   1. Terwijl de monsters worden geïnbroed, bereid een seriële verdunning van 4-methylumbelliferone, een standaard die vaak wordt gebruikt bij de fluorimetrische bepaling van enzymactiviteit.
   2. Verdun de kolf van de standaardoplossing in de stop buffer tot een concentratie van 5 μM.
   3. Voer een reeks verdunningen uit zoals aangegeven in tabel 2. Voeg de componenten toe in de aangegeven hoeveelheid en meng goed.
      Opmerking: De standaard curve helpt ervoor te zorgen dat de gemeten monsters in het lineaire bereik van de standaard curve vallen.
6. Stop de reactie met stop buffer.
   1. Voeg aan elke put 200 μL stop buffer toe om de reactie te stoppen.
7. Plaat de normen.
   1. Voeg in duplicaten op dezelfde plaat 300 μL van elke norm per put toe.
8. Lees de plaat met een fluorometrische lezer.
   1. Lees de plaat bij een excitatie van 360 nm en een emissie van 455 nm.

3. gegevensanalyse

1. De lege cellen aftrekken
   1. Gemiddelde van de waarden van de dubbele standaard verdunningen die geen 4-methylumbelliferone hebben. Deze waarde aftrekken van alle andere vastgelegde waarden.
2. Neem het gemiddelde van de technische replicaten en plot de normen.
   1. Gemiddelde de twee metingen voor elke concentratie en grafiek de gemiddelde lezing door concentratie.
      Opmerking: De resulterende plot moet lineair uitzien en hebben een R² waarde dicht bij 1. Als dat niet zo is, kan het nodig zijn om de normen opnieuw te maken en de plaat te herlezen om de kwaliteit van de gegevensanalyse te garanderen.
3. Standaardiseer de uitleeswaarden.
   1. Maak een best passende lijn voor de uitgezette Standards-gegevens. Verdeel de Lees-outs van de samples door de helling van de best passende lijn.
4. Waarden vergelijken van controlegroep en variabelengroep.
   1. Gebruik een t-toets of ANOVA, voor meer dan twee groepen, om te bepalen of het verschil tussen groepen statistisch significant is. De waarden zullen de eenheden nmol/mL · h nemen.

Resultaten

De getoonde resultaten zijn afkomstig uit een studie die de Chitinase activiteit in serum en BAL monsters van wild type (C57BL/6) en Chit1 transgene muizen (op C57BL/6 achtergrond) meet die het Chit1 gen op een doxycycline-promotor overdrukken. Uit onze gegevens blijkt dat zowel serum-als BAL monsters detecteerbare Chitinase-activiteit hebben bij Baseline 698,2 ± 189,9 nmol/mL · h en 485,7 ± 114 nmol/ml · h, respectievelijk. Overexpressie van het Chit1 gen met behulp van doxycycline in drinkwater gedurende 4 weken result...

Discussie

Chitinase activiteit is ontstaan als een belangrijke biomarker voor het voorspellen van de ernst van de ziekte, ziekteprogressie, therapeutische effectiviteit en de aanwezigheid van specifieke pathogenen¹⁸. Hoewel veel van de lang gepostleerde theorieën over de rol van chitinases niet experimenteel zijn bewezen¹⁹, hebben nieuwe studies belangrijke inzichten gegeven in de rol van chitinasen en Chitinase zoals eiwitten in verschillende ziekten^{2, <...}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Standaard: veel gebruikt in fluorimetrische assays voor bepaling van enzymactiviteit
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescentie chitinase substraat voor gebruik in muismonsters
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescentie chitinase substraat voor gebruik in menselijke monsters
Citroenzuur-monohydraat			voor gebruik in McIlvain Buffer
Glycine			voor gebruik in Stop Buffer op een concentratie van 0,3 M
Na2HPO4xH2O			voor gebruik in McIlvain Buffer
NaOH			voor gebruik in Stop Buffer op een concentratie van 12 g/L
Vision Plate: Niet-steriele, onbehandelde zwarte 96-wellsplaat	4titude	4ti-0224