Methodenartikel

Een Ectopic Chemokine-expressie model voor het testen van macrophage Recruitment in vivo

DOI:

10.3791/60161

⸱

25 september 2019

 ,  , 
1Department of Developmental Biology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2Division of Cell, Developmental and Integrative Biology, School of Medicine, South China University of Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het effect van een Chemokine op macrofaag werving in vivo te testen, werd de hele mount in situ-hybridisatie gebruikt om de ectopische uitdrukking van de Chemokine te detecteren en werd immunokleuring gebruikt om macrofagen te labelen. Live Imaging werd gebruikt voor real-time observatie van macrofaag migratie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravis wordt veel gebruikt in het basis-en biomedisch onderzoek. Veel zebravis transgene lijnen zijn momenteel beschikbaar om verschillende soorten cellen te labelen. Door het transparante embryonale lichaam van zebravis is het voor ons handig om het effect van één Chemokine op het gedrag van een bepaald type cellen in vivo te bestuderen. Hier hebben we een workflow gegeven om de functie van een Chemokine op macrofaag migratie in vivo te onderzoeken. We bouwden een Weefselspecifieke overexpressie plasmide om de IL-34 te overdrukken en injecteerde het plasmide in ééncellige transgene visembryo's waarvan de macrofagen specifiek werden gelabeld door een fluorescerend eiwit. Vervolgens gebruikten we hele Mount fluorescerende in-situ hybridisatie en immunokleuring om het patroon van de Chemokine expressie en het aantal of de locatie van macrofagen op te sporen. De geïnjecteerde WT-embryo's werden verhoogd om een stabiele transgene lijn te genereren. Tot slot gebruikten we confocale Live beeldvorming om het macrofaag gedrag in de stabiele transgene vis direct te observeren om de functie van IL-34 op macrofagen in vivo te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravis is een kleine tropische zoet water vis afkomstig uit India. Wat betreft het behoud van genen, zebravis hebben een gelijkenis van 87% voor de menselijke1. Het kan ons inzicht geven in Verwante onderwerpen van mensen door het bestuderen van de genregulatie, eiwit functie en Celgedrag zoals migratie, proliferatie et.al in zebravis. Zebravis embryo kan worden gebruikt om de ontwikkeling van vroege embryo's in verschillende stadia na remming van pigment te observeren. Ondertussen duurt het slechts drie maanden voordat zebravis zich tot seksuele volwassenheid ontwikkelt, waarna de zebravissen elke 4 dagen honderden eieren kunnen produceren. Mini formaat, eenvoudige fokkerij, sterke reproductieve capaciteit, deze voordelen maken zebravis cultuur zeer ruimtebesparend, bevorderlijk voor grootschalige cultuur. Het traditionele zoogdier model muis heeft hogere onderhoudskosten dan zebravis, waardoor de schaal van muis verhoging wordt beperkt. In het aspect van de vroege embryo ontwikkeling is muis embryo moeilijk te observeren in levende toestand als gevolg van de kenmerken van de ontwikkeling van muizen embryo's in de moeder baarmoeder. Integendeel, zebravis embryo's ontwikkelen zich extern en zijn transparant, daarom zijn ze gemakkelijk te observeren onder een microscoop. Bovendien is zebravis heel eenvoudig om een verscheidenheid aan transgene lijnen te construeren voor gerelateerd genfunctieonderzoek. Momenteel zijn verschillende zebravis transgene lijnen beschikbaar om verschillende soorten cellen te labelen. Het is nu erg handig om transgene lijnen te construeren om chemokines op specifieke locaties te overdrukken en de chemokines-functie op Celgedrag in zebravis te bestuderen.

Hier hebben we een workflow voor het gebruik van zebravis transgene lijn voor het onderzoeken van de functie van Il-34 op macrofaag gedrag in vivo2,3,4,5,6,7. Ten eerste bouwden we een leverspecifieke overexpressie plasmide van het gen il34 en injecteerde het plasmide in ééncellige fase TG (MPEG1: GFP) visembryo's die specifiek de macrofagen met fluorescerende proteïne GFP gelabeld. Vervolgens gebruikten we hele Mount fluorescerende in-situ hybridisatie en immunokleuring om het patroon van de il34 expressie en het aantal of de locatie van macrofagen te detecteren. De geïnjecteerde WT-embryo's werden verhoogd om een stabiele transgene lijn te genereren. In deze stappen hebben we de cytokine-producerende lijn vastgesteld en gevalideerd en visueel beoordeeld welke effecten kunnen worden gezien op de macrofaag verdeling. Tot slot, om het macrofaag gedrag te onderzoeken in reactie op de cytokine, gebruikten we confocale Live Imaging om direct de macrofaag migratie te observeren om de functie van il34 op de macrofaag migratie in vivo te bevestigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Alle monsters werden behandeld met fenylthiourea (PTU) Eier water om pigment te remmen.

1. generatie van TG (fabp10a: il34) transgene constructies en visinjectie

  1. Kloon de 2,8 KB fabp10a promotor8 en de Il-34 CODERINGS gebieden (ensdart 00000126460.3) van zebravis in de pTol2 vector om de fabp10a-il34 constructie te genereren. Injecteer de constructies in eencellige fase TG (MPEG1: GFP) en WT vissen embryo's samen met de Transposase mRNA. Verhoog de fabp10a-il34 geïnjecteerde WT-embryo's tot volwassen9 en Identificeer de transgene oprichter door in-situ hybridisatie.
    Opmerking: De injectie van de Tol2 construct direct in een andere transgene kan problematisch zijn als de andere transgene lijn wordt gemaakt met hetzelfde transposon systeem. Een algemene praktijk zou zijn om een onafhankelijke transgene lijn te maken en vervolgens de nieuwe lijn over te steken met een andere reporter lijn. Dit zorgt ervoor dat er geen effecten zullen zijn van de nieuwe Transgenese op een eerder ingebracht transgene.

2. fluorescerende hele mount in situ hybridisatie (WISH) combineren met immunokleuring

  1. Monster fixatie
    1. Verzamel embryo's van voorbijgaande injectie of stabiele IL-34 transgene lijn die gekruist met TG (MPEG1: GFP) in de gewenste stadia.
      Opmerking: In dit geval werden de embryo's verzameld bij 4 d post fertilisatie (DPF). (Indien nodig) Verwijder de chorion per spuit.
    2. Bevestig de embryo's met 4% Paraformaldehyde (PFA) 's nachts bij 4 °C of 2 uur bij kamertemperatuur (RT) (ongeveer 25 °C).
    3. Was de embryo's met fosfaatgebufferde zoutoplossing plus tween 20 (PBST) 3x 5 min.
    4. Dehydraat de embryo's afzonderlijk met 50% methanol in PBST (50% methanol/PBST) en 100% methanol, 1x 5 min per stuk. Vervolgens verandert u in vers 100% methanol en bewaart u bij-20 °C (minimaal 2 uur).
      Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.
  2. Sonde hybridisatie (dag I)
    1. Hydrateer de embryo's in de voorgaande stappen met 50% methanol in PBST (50% methanol/PBST) en was vervolgens met PBST 3x 5 min.
    2. Verteren de embryo's met proteïnase K in PBST bij RT (eindconcentratie: 10 μg/ml; 1:2000 in PBST).
      Opmerking: Digestie tijd is afhankelijk van het stadium van de embryo's: minder dan 36 h post bemesting (HPF), geen behoefte; 36 HPF-2 DPF embryo, 3-5 min; 2-3 DPF embryo, 10 min; 3-4 DPF embryo, 15 min; 4-5 DPF embryo, 15-20 min; 5-6 DPF embryo, 20-27 min; > 6 DPF embryo, 25-30 min bij RT (ongeveer 25 °C).
    3. Gooi de digestie oplossing weg en voer de fixatie opnieuw uit met 4% PFA, gedurende 20 min bij RT.
    4. Was de embryo's met PBST 2x 10 min.
    5. Gooi de PBST weg, voer pre-hybridisatie uit met verwarmde hybridisatie buffer (HB-buffer) bij 65 °C gedurende 5 minuten, Recycle de HB-buffer in de originele buis.
    6. Voer pre-hybridisatie uit met de nieuwe verwarmde HB-buffer bij 65 °C ten minste 1 uur.
    7. Verwarm de sonde9 (voor dit geval was een il34 sonde, 1 ng/ml) bij 65 °c ten minste 10 min. Recycle de HB-buffer vervolgens in de originele buis. Voer met de voorverwarmde sonde bij een nacht van 65 °C hybridisatie uit.
  3. Behandeling van antilichamen (dag II)
    1. Verwarm de 50% formamide/2x Saline Natriumcitraat plus tween 20 (SSCT), 2x SSCT, 0.2 x SSCT bij 65 °C.
    2. Recycle de sonde in de originele buis en bewaar de sonde bij-20 °C.
    3. Was de embryo's afzonderlijk met 50% formamide/2x SSCT; 2x SSCT; 0.2 x SSCT, 3x 20 min of 2x 30 min elk bij 65 °C.
    4. Was de embryo's met PBST 3x 5 min.
    5. Blokkeer de monsters met 600 μL blokkerende buffer (5% gefilterd foetaal runderserum (FBS) in PBST) gedurende 1 uur bij RT.
    6. Voeg 400 μL anti-digoxigenin-HRP-antilichaam oplossing (1:1000-1:2000 in blokkerende buffer) toe en inbroed de embryo's bij 4 °C 's nachts. Als signalen zwak zijn, gebruik 1:500 verdunning van antilichamen.
  4. Inkleuring en primair antilichaam drachtige (dag III)
    1. Verwijder het antilichaam; was de embryo's met PBST, 6x 20 min bij RT.
    2. Spoel het monster met 30 μL 1x plus versterkings verdunningsmiddel gedurende 5 minuten bij RT.
    3. Gooi het verdunningsmiddel weg door het pipetteren; verdunde Fluorophore Tyramide stamoplossing (Cyanine 3 plus versterkings reagens (Cy3) of Cyanine 5 plus versterkings reagens (Cy5), voor dit geval Cy3 werd gebruikt) 1:50 in 1x plus versterkings verdunningsmiddel om de Fluorophore Tyramide werkoplossing te maken. Bereid voor elk monster 50-100 μL werkoplossing voor.
    4. Inincubeer het monster in de werkoplossing Fluorophore Tyramide voor 5-15 min in het donker bij RT. Als de signalen zwak zijn, verlengt u de incubatietijd tot 30 minuten.
    5. Stop de reactie door de werkoplossing met PBST te veranderen en de signalen te onderzoeken.
    6. Was de embryo's met PBST 3x 10 min bij RT.
    7. Incuberen het monster met primair antilichaam bij 4 °C 's nachts. Gebruik voor dit geval het Goat-anti-GFP-antilichaam als primair antilichaam.
  5. Secundaire antilichaam kleuring (dag IV)
    1. Was de embryo's met PBST 4x 30 min.
    2. Incuberen de embryo's met secundair antilichaam bij 4 °C 's nachts. Voor dit geval, gebruik Alexa 488-anti-geiten antilichaam als het secundaire antilichaam.
  6. Foto's maken (dag V)
    1. Was de embryo's met PBST 3x 10 min bij RT.
    2. Bewaar de embryo's in 70% glycerol in het donker bij 4 °C 's nachts of-20 °C langer.

3. live beeldvorming

  1. Voorbeeld selecteren
    Opmerking:     gebruik het live-beeld om direct te observeren of macrofagen van TG (fabp10a: Il34; fabp10a: DSRED; MPEG1: GFP) vis zou migreren naar de lever onder Il-34 inductie tijdens 3-3.5 DPF. Hier wordt de TG (Fabp10a-dsred) transgene lijn gebruikt om de lever regio te labelen en zichtbaar te maken, om de lokalisatie van de lever te vergemakkelijken en om te bepalen of macrofagen migreren naar de lever. Gebruik vóór de beeldvorming een fluorescentiemicroscoop om de dubbele positieve embryo's van DsRed en GFP te selecteren.
  2. Vis montage
    1. Gebruik een metaalbad om 1 mL van 1% laag smelt agarose te verwarmen tot boven 90 °C om het volledig te smelten.
    2. Na de lage smelt agarose wordt gekoeld tot lichaamstemperatuur, voeg 50 μL van 0,2% tricaïne, en gelijkmatig mengen tricaïne met de agarose.
    3. Verplaats de verdoofd embryo's naar een klein gerecht gemonteerd met een afdekplaat op de bodem, verwijder het omringende water, laat langzaam de lage smelt agarose op de embryo's vallen, stel de positie van de vis zorgvuldig in voordat de agarose wordt gestijgd, houd het levergebied dicht bij de afdekking schuift op de bodem van de schaal.
    4. Nadat de lage smelt agarose is gestomgd, zorgvuldig bedekken met een andere laag van agarose om het te versterken.
    5. Plaats het gerecht op de confocale Microscoop drager tafel, bedek de vis met de E2-oplossing10 met tricaïne en begin met beeldvorming.
  3. Software werking van de confocale Microscoop
    1. Open de Zen black 2,3 -software, installeer de Living Cell Workbench op de Microscoop drager tafel.
    2. Klik op zoeken | Incubatie | Temperatuur om de temperatuur op 29 °c te zetten.
    3. Plaats het gerecht in het midden van de Living Cell Workbench, bedek de vis met de E2-oplossing10 met tricaïne.
    4. Klik op het menu acquisitie , selecteer de gewenste scanmodus en lasers in het Smart Setup -menu en selecteer vervolgens Z-stack en Position.
    5. Klik op het menu experiment ontwerper , selecteer multi-blok experiment inschakelen, in het eerste blok, om het monster onder de lage vergroting te vinden en schakel vervolgens over naar de hoge vergroting, laat het waargenomen gebied in het midden van het gezichtsveld staan.
    6. Stel de positie en Z-stack informatie in, selecteer de juiste laserintensiteit, scan lagen en imaging snelheid.
    7. Maak een nieuw blok en herhaal de bovenstaande stappen. Stel na het instellen van alle blokken het juiste aantal lussen in en start de opname (Figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De stappen in het Protocol van zebravis worden geïllustreerd in Figuur 2. Eerst genereerden we de pBLK-fabp10a-il34-SV40 construct waarin il34 werd gedreven door de Fabp10a Promoter (Figuur 2). De constructie werd microgeïnjecteerd in eencellige fase TG (MPEG1: GFP) zebravis embryo's die macrofagen kunnen labelen met GFP en WT embryo's die aan volwassenen werden verhoogd om transgene stabiele l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol stelt ons in staat om de functie van een Chemokine op het gedrag van macrophagein vivo te onderzoeken en de procedure vereist enige technische expertise. Samenvattend zijn er verschillende kritieke stappen om complicaties in het protocol te voorkomen: 1) Selecteer een geschikte transgene lijn die een specifiek en sterk transgene signaal toont om de cel van belang te labelen; 2) Selecteer een geschikt weefsel dat toegankelijk is voorbeeld vorming en transgene genen overexpressie; 3) Maak een g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr. Jingrong Peng voor het delen van de TG (fabp10a: DsRed) transgene lijn; Dr. Zilong Wen voor het delen van de TG (MPEG1: GFP) transgene lijnen; Dr. Koichi Kawakami voor het leveren van de pTol2 vector. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (31771594), Guangdong Science and Technology plan Projects (2019A030317001) en de fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten (D2191450).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichaam
Alexa 488-Anti-Geit antilichaamInvitrogenA11055
Anti-Digoxigenine-HRP perkinelmerNEF832001EA
Geit-Anti-GFP antilichaamAbcamab6658
Reagens
CaCl2· 2H2OSigma21097
Cyanine 3 Plus AmplificatiereagensperkinelmerNEL745001KT
E2 oplossing15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 
Fetaal runderserum (FBS)Life10099-133
FormamideDiamondA100314
Glycerol SigmaV900860
Heparine-natriumSigmaH3149
Hybridisatiebuffer (HB)50% formamide+ 5×SSC+9 mM natriumcitraat+50 μg/ml heparine-natrium+ 500 μg/mL tRNA+ 0.1% Tween20
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Agar-agar met lage smelttemperatuurSigmaA9414
MethanolGHTECH1.17112.023
Methyleenblauw SigmaM9140
MgSO4SigmaM2643
Na2HPO4SigmaS5136
NaClSigmaS5886
NaHCO3 SigmaS5761
Paraformaldehyde (PFA)Sigma158127Hang 16 g PFA op in 400 ml 1x PBS, verwarm gedurende 30 min op 60 °C  om op te lossen. Deze oplossing kan van tevoren worden bereid en bij -4 °C worden bewaard. Let op. Behandeling met masker.
10×PBS14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
Fenylttioureum (PTU)SigmaP7629
1×Plus Amplificatie DiluentperkinelmerNEL745001KT
Proteinase K FermentasE00492
20×Saline natriumcitraat(SSC)175.3 g NaCl+ 88.2 g natriumcitraat in 1 L ddH2O, PH 7.0
NatriumcitraatSigmaA5040
TricaienSigmaE10521
tRNA SigmaR6625
Tween20SigmaP2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40Voor Tg (fab10a:il34) transgenische lijngeneratie
pBSK-il34Voor il34 sondebereiding
Vis
Tg (mpeg1: GFP)Label macrofagen met GFP
Tg (fabp10a: DsRed)Label levercellen met DsRed
Tg (fab10a:il34)Overexpressie IL-34 in levercellen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
  3. Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
  4. Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
  5. Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045(2013).
  6. Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
  7. Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
  8. Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
  9. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. Eugene, OR. (2000).
  10. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: a practical approach. , Oxford University Press. New York. (2002).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ZebravismodelIL 34 overexpressiefluorescente in situ hybridisatieimmuunkleuringconfocale live imagingtransgene visembryo sGFP gelabelde macrofagenweefselspecifiek plasmide

Gerelateerde artikelen