Het doel van het protocol is om de mechanische eigenschappen van de membraan van gigantische blaasjes betrouwbaar te meten met micro pipet aspiratie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het verkrijgen van gigantische Unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Reuzen blaasjes verkregen uit fosfolipiden en copolymeren kunnen worden uitgebuit in verschillende toepassingen: gecontroleerde en gerichte levering van geneesmiddelen, biomoleculaire herkenning binnen biosensoren voor diagnose, functionele membranen voor kunstmatige cellen, en ontwikkeling van biogeïnspireerde micro/nano-reactoren. In al deze toepassingen is de karakterisering van hun membraan eigenschappen van fundamenteel belang. Onder bestaande karakterisatie technieken, micropipet aspiratie, gepionierd door E. Evans, maakt het mogelijk om mechanische eigenschappen van het membraan te meten, zoals het gebied comprimeerbare modulus, buig modulus en Lysis stress en stam. Hier presenteren we alle methodologieën en gedetailleerde procedures om gigantische blaasjes te verkrijgen van de dunne film van een lipide of copolymeer (of beide), de fabricage-en oppervlaktebehandeling van micropipetten, en de aspiratie procedure die leidt tot de meting van alle eerder genoemde parameters.
Inleiding
Reuzen blaasjes verkregen uit fosfolipiden (liposomen) zijn op grote schaal gebruikt sinds de jaren 1970 als basis celmembraan model1. In de late jaren negentig, vesiculaire morfologieën verkregen uit de zelf-assemblage van copolymeren, genaamd polymersomes in verwijzing naar hun lipide analogen2,3, snel verscheen als een interessant alternatief voor liposomen die zwakke mechanische stabiliteit en slechte modulaire chemische functionaliteit bezitten. Echter, hun cel biomimetische karakter is vrij beperkt in vergelijking met liposomen, omdat de laatste zijn samengesteld uit fosfolipiden,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. fabricating micropipetten
Let op: hier zijn micropipetten met een inwendige diameter variërend van 6 tot 12 μm en een conus lengte rond 3-4 mm noodzakelijk. Een gedetailleerde methode voor het vervaardigen van micropipetten wordt hieronder beschreven.
- Plaats het boor silicaatglas capillair in de dissel van de trekker en bevestig een van de uiteinden door de knop aan te spannen.
- Schuif het glas voorzichtig door de openingen aan de zijkant van de verwarmingskamer.
- Draai de klem knop aan de andere kant vast.
- Bedien de grootte van de tip en de taper-lengte om de gewenste specificaties te bereiken. Voor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met het bovengenoemde protocol hebben we verschillende synthetische reus unilamellaire blaasje (guv) bestudeerd, verkregen uit een fosfolipide: 2-oleoyl-1-Palmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (popc), een triblock copolymeer: poly (ethyleeneoxide)-b-poly (dimethylsiloxaan)-b-poly (ethyleeneoxide) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) gesynthetiseerd in een eerdere studie13, en een diblock copolymeer pol.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De coating van de micro Pipet is een van de belangrijkste punten voor het verkrijgen van betrouwbare metingen. Hechting van het blaasje aan de micro pipet moet worden voorkomen, en een coating wordt vaak gebruikt in de literatuur17,18,19,20,21, met BSA, β-caseïne of surfasil. Details van de coating procedure worden zelden genoemd.
H.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de ANR voor financiële steun (ANR Sysa) dankbaar.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Vereiste apparatuur en materialen voor micropipettontwerp | |||
| Boorsilicaatglas capillairen | World Precision Instruments | 1B100-4 | externe en interne diameter van respectievelijk 1 mm en 0,58 mm. |
| Geïnstalleerd filament | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2,5 mm * 2,5 mm Box Filament |
| Vlam/Brown Micropipettontrekker | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | uitgerust met twee objectieven (10x en 32x) |
| Materialen voor het coaten van pipettips met BSA | |||
| Bovine Serum Albumine Fractie V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Draaiknopoplossing 1 ml Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Draaiknopoplossing 10 ml Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Draaiknopoplossing 5 ml Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Acetaatcellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Poriegrootte: 0,22µm, diameter: 25 mm |
| Flexibele versmolten silica capillaire buis | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Binnendiameter 536µm, buitendiameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Spuit 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Roterende menger voor testbuisjes | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulatie opstelling | |||
| Aluminium optisch spoor, 1000 mm lengte, M4 schroefdraad, X48-serie | Newport | ||
| Gedempte optische tafel | Newport | gebruikt als ondersteuning van microscoop om externe trillingen te voorkomen. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | De module-eenheid (motoreenheid voor X, Y en Z beweging) is op de omgekeerde microscoop gemonteerd door middel van een adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Bereik 0,001 mm |
| Plexiglas waterreservoir (100 ml) | Zelfgemaakt | ||
| TCS SP5 omgekeerde confocale microscoop (DMI6000) uitgerust met een resonante scanner en een waterdompelingobjectief (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm lengte, met 1/4-20, 8-32 en 4-40 draad | Newport | ||
| Materialen voor sucrose en amfifiele oplossingsvoorbereiding | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Fosfatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine-gelabeld lipide |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformatie opstelling | |||
| 10 µL glazen capillaire ringkappen | Hirschmann | 9600110 | |
| Draaiknopoplossing 1 ml Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Vet | Apiezon | Apiezon H Vet | Silicon-vrij vet |
| Indium tin oxide gecoate glazen platen | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Naald | Terumo | AN2138R1 | 0,8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Tolueen | VWR | 28676.297 | |
| Spanningsgenerator | Keysight | 33210A |
Referenties
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
