Methodenartikel

Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

DOI:

10.3791/60202

⸱

27 september 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celco-cultuur assays zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van celcelinteracties tussen verschillende celtypen om beter te begrijpen van de biologie van ziekten met inbegrip van Cancer. Het is echter een uitdaging om het complexe mechanisme van intercellulaire interacties in zeer heterogene celpopulaties te verduidelijken met behulp van conventionele co-cultuur systemen, omdat de heterogeniteit van de celsubpopulatie wordt bedekt door de gemiddelde waarden; de conventionele co-cultuur systemen kunnen alleen worden gebruikt om het bevolkings signaal te beschrijven, maar zijn niet in staat om het gedrag van individuele cellen te volgen. Bovendien hebben conventionele eencellige experimentele methoden een lage efficiëntie bij het manipuleren van cellen vanwege de Poisson-verdeling. Micro fabricaat-apparaten zijn een opkomende technologie voor eencellige studies omdat ze afzonderlijke cellen nauwkeurig kunnen manipuleren bij hoge doorvoer en het monster-en reagens verbruik kunnen verminderen. Hier beschrijven we het concept en de toepassing van een microfluïdische chip voor meerdere eencellige co-culturen. De chip kan efficiënt meerdere soorten afzonderlijke cellen in een cultuur kamer vastleggen (~ 46%) en heeft een voldoende cultuur ruimte die nuttig is om het gedrag van de cellen te bestuderen (bijv. migratie, proliferatie, enz.) onder celcelinteractie op het eencellige niveau. Lymfatische endotheliale cellen en oraal plaveiselcelcarcinoom werden gebruikt om een eencellige co-cultuur experiment uit te voeren op het microfluïdische platform voor Live meervoudige interactiestudies met één cel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efficiënte inname van verschillende soorten afzonderlijke cellen en het verstrekken van voldoende cultuur ruimte zijn nodig voor co-cultuur experimenten met één cel van meerdere typen enkelvoudige cellen1. Beperkende verdunning is de meest gebruikte methode om de afzonderlijke cellen voor dergelijke experimenten voor te bereiden, vanwege de lage kosten van de benodigde apparatuur. Vanwege de Poisson-verdelings beperking is de maximale kans op een enkelvoudige celverwerving echter slechts 37%, waardoor de experimentele operatie moeizaam en tijdrovend is2. Daarentegen kan het gebruik van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) de Poisson-verdelings begrenzing overwinnen tot hoog-efficiënt enkelvoudige cellen voorbereiden3. FACS is echter mogelijk niet toegankelijk voor sommige laboratoria vanwege dure instrumentatie-en onderhoudskosten. Micro fabricaat-apparaten zijn onlangs ontwikkeld voor single cell-overvulling4, eencellige pairing5en toepassingen voor één celcultuur. Deze apparaten zijn voordelig op basis van hun vermogen om nauwkeurig individuele cellen te manipuleren6, uitvoeren van experimenten met hoge doorvoer, of verminderen van monster en reagens verbruik. Het uitvoeren van eencellige co-cultuur experimenten met meerdere celtypen met de huidige microfluïdische apparaten is echter nog steeds een uitdaging vanwege de beperking van Poisson-distributie1,7,8of het onvermogen van de apparaten om meer dan twee soorten afzonderlijke cellen vast te leggen4,5,6,9,10.

Bijvoorbeeld, Yoon et al. rapporteerde een microfluïdisch apparaat voor cel-cel interactiestudie11. Dit apparaat gebruikt de probabilistische-methode om cellen in één kamer te koppelen. Het kan echter alleen de koppeling van twee verschillende celtypen bereiken vanwege geometrische beperkingen in de apparaatstructuur. Een ander verslag van Lee et al. demonstreerde een deterministische methode om enkelvoudige cellen vast te leggen en te koppelen12. Dit apparaat verhoogt de koppel efficiëntie door de deterministische methode, maar het wordt beperkt door de verlengde bewerkingstijd die nodig is om cellen te koppelen. Specifiek, de tweede cel Capture kan alleen worden uitgevoerd nadat de eerste vastgelegde cel is bevestigd aan het oppervlak na 24 h. Zhao et al. rapporteerde een op droplet gebaseerd microfluïdisch apparaat om twee typen van één cel13vast te leggen. We kunnen vinden dat het op druppel gebaseerde microfluïdische apparaat nog steeds beperkt is tot de Poisson-verdeling en alleen kan worden gebruikt op niet-aangehechte cellen, en het is niet mogelijk om de cultuur oplossing tijdens het teeltproces te veranderen.

Eerder hebben we een microfluïdische "hydrodynamische pendelen chip" ontwikkeld die deterministische hydrodynamische krachten gebruikt om meerdere soorten eencellige in de cultuur kamer vast te leggen en vervolgens celco-cultuur experiment kan uitvoeren om te analyseren individuele Celmigratie gedrag onder celcelinteracties14. De hydrodynamische pendelen chip bestaat uit een reeks eenheden die elk een serpentine by-pass kanaal, een Capture-site en een cultuur kamer bevat. Door gebruik te maken van het verschil in stromingsweerstand tussen het serpentine by-pass kanaal en de kweekkamer, en een speciaal ontworpen operatie procedure, kunnen verschillende soorten enkelvoudige cellen herhaaldelijk in de kweekkamer worden gevangen. Met name de ruime ruimte van de cultuur kamer kan niet alleen voorkomen dat de cel wordt gespoeld tijdens het vastleggen van de cel, maar biedt ook voldoende ruimte voor de cellen om te verspreiden, te vermenigvuldigen en te migreren, waardoor het observeren van Live eencellige interacties mogelijk is. In dit artikel richten we ons op de productie van dit apparaat en gedetailleerde protocol stappen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. fabricage van een wafer Mold door zachte lithografie

Opmerking: masker patroon gegevens zijn beschikbaar in onze vorige publicatie14.

  1. Dehydraat een 4-inch silicium wafer in een oven van 120 °C gedurende 15 minuten.
  2. Spin Coat 4 g van Su-8 2 Negative fotoresist op een 4-inch silicium wafer bij 1.000 rpm voor 30 s om een 5 μm dikke laag te maken (Layer #1).
  3. Soft Bake Layer #1 op een 65 °C-kookplaat gedurende 1 minuut en breng vervolgens de laag #1 over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 3 minuten.
  4. Koele laag #1 op kamertemperatuur, plaats deze op de houder van de semi-automatische masker aligner en lijn deze uit met de laag #1 verchroomde photomask (Capture-sitelaag).
  5. Stel laag #1 bloot met 365 nm UV-licht in een dosis van 150 mJ/cm2.
  6. Verwijder laag #1 van de aligner en na het bakken op een 65 °C-kookplaat gedurende 1 min. overdrachts laag #1 naar een kookplaat van 95 °C gedurende 1 minuut.
  7. Koele laag #1 op kamertemperatuur. Dompel onder in een propyleenglycol monomethylether acetaat oplossing om de niet-crosslinked fotoresist gedurende 2 min. zachtjes te drogen met stikstofgas om een laag #1 uitlijnings markering te onthullen.
  8. Bedek de laag #1 uitlijnings markering door een plakband, spin Coat 4 g van Su-8 10 Negative fotoresist op de laag #1 bij 1.230 rpm voor 30 s om een 25 μm dikke laag te creëren #2.
  9. Verwijder de tape, zachte bak laag #2 op een 65 °C-kookplaat gedurende 3 minuten en breng vervolgens de laag #2 over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 7 minuten.
  10. Koele laag #2 op kamertemperatuur, plaats de laag #2 op de houder van de semi-automatische masker aligner en lijn de laag #2 verchroomde photomask (bypass Channel Layer) uit op de laag #1 uitlijnings markering.
  11. Stel laag #2 bloot met 365 nm UV-licht in een dosis van 200 mJ/cm2.
  12. Verwijder laag #2 van de aligner en na het bakken op een 65 °C-kookplaat gedurende 1 minuut en breng laag #2 over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 3 minuten.
  13. Koele laag #2 op kamertemperatuur, en dek de laag #1 uitlijning markering door plakband. Spin jas 4 g van Su-8 2050 negatieve fotoresist op laag #2 bij 1.630 rpm voor 30 s om een 100 μm dikke laag te maken #3.
  14. Verwijder de tape, de zachte bak laag #3 op een 65 °C-kookplaat gedurende 5 minuten en breng de laag #3 vervolgens over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 20 minuten.
  15. Koele laag #3 op kamertemperatuur, plaats de laag #3 op de houder van de semi-automatische masker aligner en lijn de laag #3 verchroomde photomask (kweekkamer Layer) uit op de laag #1 uitlijnings markering.
  16. Stel laag #3 bloot met 365 nm UV-licht in een dosis van 240 mJ/cm2.
  17. Verwijder laag #3 van de aligner en na het bakken op een 65 °C-kookplaat gedurende 5 min. overdrachts laag #3 naar een kookplaat van 95 °C gedurende 10 minuten.
  18. Koele laag #3 op kamertemperatuur. Dompel onder in een propyleenglycol monomethylether acetaat oplossing om de niet-crosslinked fotoresist gedurende 10 minuten weg te spoelen en zachtjes te drogen met stikstofgas.

2. PDMS apparaat voorbereiding voor meerdere single cell Capture

  1. Plaats de wafer Mold en de weegschaal met 100 μL trichloorsilaan in een exsiccator (alleen voor silanisatie) en breng gedurende 15 minuten een vacuüm aan (-85 kPa).
    Opmerking: Silanize het oppervlak met trichloorsilaan om hydrofobische oppervlakte eigenschappen te creëren vóór PDMS castingso, zodat het moeiteloos kan worden geschild van de mal van de wafer PDMS.
  2. Stop het vacuüm en silanize de wafer Mold in de exsiccator (alleen voor silanisatie) bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur.
  3. Meng PDMS base en PDMS Uithardings middel in een verhouding van 10:1. Giet in totaal 20 g gemengde PDM'S op de wafer Mold in een 15 cm schaal.
  4. Plaats de 15 cm schaal in een exsiccator en breng een vacuüm aan (-85 kPa) voor 1,5 min. Verwijder dan de 15 cm schaal van de desiccator. Houd gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder ten slotte resterende luchtbellen in PDM'S met stikstofgas.
  5. Plaats de 15 cm schaal in een oven bij 65 °C gedurende 2-4 uur om PDM'S te genezen.
  6. Verwijder de PDMS-replica van de wafer Mold en Punch vervolgens een 1,5 mm inlaat en een 0,5 mm uitlaat op de PDMS met een binnendiameter van 1,5 mm en een Puncher met een binnendiameter van 0,5 mm (Figuur 1C).
  7. Reinig de PDMS replica en het schuif oppervlak met verwijderbare tape en behandel het oppervlak met zuurstof plasma (100 W voor 14 s).
  8. De PDMS-replica's handmatig uitlijnen met de dia en ze in contact brengen met elkaar.
  9. Plaats de PDMS Slide 1 dag in een 65 °C oven.
    Opmerking: permanente binding tussen de dia en de PDMS replica wordt bereikt om het apparaat te vormen.
  10. Dompel het PDMS-apparaat onder in een container gevuld met fosfaatgebufferde zoutoplossing en plaats deze in een exsiccator. Breng vervolgens een vacuüm aan (-85 kPa) gedurende 15 minuten om luchtbellen te verwijderen.
  11. Plaats het PDMS-apparaat in een celcultuurkap en steriliseer het apparaat met UV-licht (licht golflengte: 254 nm) gedurende 30 minuten.
  12. Vervang de apparaatbuffer van PDMS door middel van medium (DMEM-F12 Basaal medium met 1% antibioticum en 10% foetaal runderserum) en inincuberen het PDMS-apparaat bij 4 °C gedurende 1 dag. Dit voorkomt dat cellen zich aan het PDMS-oppervlak hechten.

3. bereiding van een eencellige suspensie

Opmerking: celtypen omvatten menselijke lymfatische endotheliale cellen (LECs), humane OSCC TW 2.6-cellen die WNT5B-specifieke shRNA (WNT5B SH4) en vector Control (pLKO-GFP) uitdrukken die werden verkregen uit onze vorige studie15. Raadpleeg onze vorige publicatie voor gedetailleerde teelt stappen.

  1. Verwijder het kweekmedium wanneer de cellen 70-80% samenloop bereiken. Vervolgens driemaal de cellen voorzichtig wassen met 5 mL steriele PBS.
  2. Voeg 1 mL DMEM-F12 medium met 1 μM fluorescerende kleurstof toe aan WNT5B SH4 en pLKO-GFP cellen (gebruik MV2 medium voor LECs) en inincuberen de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: LECs waren gekleurd met groene chlooromethylfluorescein DIACETAAT (CMFDA) kleurstof, WNT5B SH4 cellen werden bevlekt met blauwe 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) kleurstof en pLKO-GFP cellen werden gekleurd met rode DIL fluorescerende kleurstof.
  3. Spoel de cellen drie keer zachtjes met 5 mL steriele PBS.
  4. Verwijder de PBS en voeg 2 mL 0,25% trypsine-EDTA (0,05% trypsine-EDTA voor LECs) toe.
  5. Inincuberen de cellen gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur en tik vervolgens zachtjes op de weefselkweek schaal om de loslating van cellen te bevorderen.
  6. Voeg 4 mL DMEM-F12 medium toe om WNT5B SH4 en pLKO-GFP cellen te dispergeren (voor LECs gebruikt u 3 mL MV2 medium en 1 mL trypsine neutralisatieoplossing). Breng de cellen vervolgens over in een buis van 15 mL en centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten.
  7. Verwijder de supernatant en rebreng de celpellet voorzichtig in 1 mL DMEM-F12 medium. Tel het aantal levende cellen in een hemocytometer met behulp van de standaard Trypan Blue uitsluitings methode16. Bereid 1 mL celsuspensie bij 3 x 105 cellen/ml concentratie in DMEM-F12 medium, en houd vervolgens cellen op ijs om celaggregatie te voorkomen.
    Let op: om de single-cell Capture-efficiëntie te verbeteren, is een zorgvuldige voorbereiding van de eencellige suspensie met goed-dissociated vereist.

4. meerdere single-cell Capture en Triple eencellige cultuur

  1. Sluit een poly-tetrafluoretheen (PTFE) buis aan tussen de uitlaat van het apparaat en de spuitpomp. Verwijder het medium en voeg 1 μL celsuspensie toe bij een concentratie van 3 x 105 cellen/ml in de inlaat van het PDMS-apparaat.
  2. Laad de celsuspensie in het apparaat door een spuitpomp met een debiet van 0,3 μL/min (Figuur 2a). Stroomrichting is van de inlaat naar de uitlaat.
    Opmerking: laad onmiddellijk na het toevoegen van de celsuspensie in de inlaat om celsedimentatie te voorkomen.
  3. Voeg na stap 4.2 1 μL DMEM-F12-medium toe aan de inlaat van het PDMS-apparaat. Laad het medium op de DMEM-F12 in het apparaat door een spuitpomp met een debiet van 0,3 μL/min (Figuur 2B). Stroomrichting van de inlaat naar het stopcontact stroomt.
  4. Laad 0,3 μL DMEM-F12 medium in het apparaat door middel van een spuitpomp met een debiet van 10 μL/min (Figuur 2C). Stroomrichting stroomt van de uitlaat naar de inlaat.
  5. Herhaal de stappen 4,1 tot 4,4 om andere celtypen in het apparaat te laden.
  6. Na het voltooien van de celopname, gebruik een microscoop met 4x lens om elke cultuur kamer te beelden.
    NB: de fluorescentie-uitstoot van de cellen werd gebruikt om het aantal individuele cellen in elke kweekkamer te identificeren en te tellen.
  7. Verwijder de PTFE-buis en verzegel de inlaat en de uitlaat met Polyolefine tape om een gesloten cultuur systeem te creëren.
  8. Verplaats het PDMS-apparaat naar een kweek schaal van 10 cm en voeg 10 mL steriele PBS rond het PDMS-apparaat toe om de verdamping van het medium van het apparaat te voorkomen.
  9. Breng de kweek schaal over naar een incubator (37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid) voor drievoudige eencellige kweek.
  10. Microscopisch observeren en fotograferen celgroei elke 12 h.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het apparaat heeft een drie lagenstructuur zoals aangegeven door de doorsnede foto van een cut PDMS-apparaat (Figuur 1a). De eerste laag bevat een Capture-site (6,0 μm in breedte en 4,6 μm in hoogte) die de cultuur kamer en het by-pass kanaal verbindt. Het verschil in stromingsweerstand tussen de kweekkamer en het by-pass kanaal zorgt ervoor dat de cellen in de veroverings positie stromen en de ingang van het kleine pad vullen. Nadat een cel ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De intercellulaire interacties van verschillende cellen in de tumor micro omgeving spelen een belangrijke rol in de progressie van de tumor17. Om het mechanisme van celcelinteracties te begrijpen, worden co-cultuur systemen gebruikt als een gemeenschappelijke analytische methode. Echter, meerdere celtypen en de heterogeniteit van de cellen zelf hebben geleid tot experimentele complexiteit en analytische moeilijkheden.

De hydrodynamische pendelen chip laat meerdere eence...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het ministerie van Wetenschappen en technologie (105-2628-E-400-001-MY2), en het Ph.D. programma in weefsel engineering en regeneratieve geneeskunde, nationale Chung Hsing University en National Health Research instituten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape3M Company9795R
AntibioticsBiowestL0014-100Glutamine-Penicillin-Streptomycin
AutoCAD softwareAutodeskAutoCAD LT 2011Part No. 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC DyeInvitrogenC2110
CellTracker Green CMFDA DyeInvitrogenC7025
Conventional ovenYEONG-SHIN companyovp45
DesiccatorBel-Art ProductsF42020-0000Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
DiIC12(3) cell membrane dyeBD Biosciences354218Used as a cell tracker
DMEM-F12 mediumGibco11320-082
Endothelial Cell Growth Medium MV 2PromoCellC-22022
Fetal bovine serum HycloneThermoSH30071.03HI
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )Hamilton80630100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncherTed Pella Inc.15075with 1.5mm inner-diameter
Harris Uni-Core puncherTed Pella Inc.15071with 0.5mm inner-diameter
HotplateYOTEC companyYS-300S
Msak alignerDeya Optronic CO.A1K-5-MDA
Oxygen plasmaNORDSON MARCHAP-300
Plasma cleanerNordsonAP-300Bench-Top Plasma Treatment System
Polydimethylsiloxane (PDMS) kitDow corningSylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE)Ever Sharp Technology, Inc.TFT-23Tinner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm
Removable tape3M CompanyScotch Removable Tape 811
Silicon waferEltech corperationSPE0039
Spin coaterSynrex Co., Ltd.SC-HMI 2" ~ 6"
StereomicroscopeLeica MicrosystemsLeica E24
SU-8 10 negative photoresistMicroChemY131259
SU-8 2 negative photoresistMicroChemY131240
SU-8 2050 negative photoresistMicroChemY111072
SU-8 developerGrand Chemical CompaniesGP5002-000000-72GCPropylene glycol monomethyl ether acetate
Syringe pumpHarvard Apparatus703007
TrichlorosilaneGelest, IncSIT8174.0Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Trypsin Neutralizer SolutionGibcoR-002-100

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  2. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  3. Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804(2008).
  4. Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
  5. Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
  6. Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
  7. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340(2015).
  8. Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
  9. Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
  10. Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
  11. Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
  12. Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
  13. Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
  14. He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
  15. Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503(2016).
  16. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  17. Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
  18. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  19. Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
  20. Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single cell co cultuurcelvangsteffici ntiePDMS apparaatlymfatische endotheelcellenoraal plaveiselcelcarcinoomladen van spuitpompbereiding van celsuspensietriple single cultuurdynamische live imaging

Gerelateerde artikelen