Karakterisatie van functioneel geassocieerde Mirna's in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie

Samenvatting

Hier beschreven is een protocol voor het karakteriseren van modules van biologisch synergetische miRNAs en hun assemblage in korte transgenen, waardoor gelijktijdige overexpressie voor gentherapie toepassingen mogelijk is.

Samenvatting

De biologische relevantie van microRNAs (miRNAs) in gezondheid en ziekte is sterk afhankelijk van specifieke combinaties van veel gelijktijdig gedereguleerde miRNAs in plaats van de werking van een enkele miRNA. De karakterisering van deze specifieke miRNAs-modules is een fundamentele stap om het gebruik ervan in de therapie te maximaliseren. Dit is uitermate relevant omdat hun combinatorische attributen praktisch uitgebuit kunnen worden. Hier beschreven is een methode om een specifieke Mirna-handtekening te definiëren die relevant is voor de controle van oncogene chromatine-van in glioblastoma. De aanpak definieert eerst een algemene groep van miRNAs die zijn gedereguleerd in tumoren in vergelijking met normaal weefsel. De analyse wordt verder verfijnd door differentiële cultuuromstandigheden, waarbij een subgroep van Mirna's wordt onderstreept die gelijktijdig worden uitgedrukt tijdens specifieke cellulaire toestanden. Ten slotte worden de miRNAs die aan deze filters voldoet, gecombineerd tot een kunstmatige polycistronic transgenes, die is gebaseerd op een steiger van natuurlijk bestaande miRNA clusters genen, vervolgens gebruikt voor overexpressie van deze miRNA modules in ontvangende cellen.

Inleiding

miRNAs biedt een ongeëvenaarde kans voor de ontwikkeling van een brede gentherapie benadering van vele ziekten^1,2,3, waaronder kanker^4,5. Dit is gebaseerd op een aantal unieke kenmerken van deze biologische moleculen, met inbegrip van hun kleine maat⁶, eenvoudige biogenese⁷, en natuurlijke neiging om te functioneren in vereniging⁸. Veel ziekten worden gekenmerkt door specifieke miRNA-expressie patronen, die vaak convergeren over de regulering van complexe biologische functies⁹. Het doel van deze methode is om eerst een strategie te definiëren om groepen van miRNAs te identificeren die synergetisch relevant zijn voor specifieke cellulaire functies. Bijgevolg biedt het een strategie voor het opnieuw opzetten van dergelijke miRNA-combinaties in downstreamstudies en toepassingen.

Deze methode maakt functionele analyse van meerdere Mirna's tegelijk mogelijk, gebruikmakend van hun gelijktijdige targeting van een groot aantal Mrna's, waardoor de complexe landschappen van ziekten worden samengevat. Deze aanpak is onlangs gebruikt om een groep van drie Mirna's te definiëren die 1) gelijktijdig worden gedowngereguleerd in hersenkanker en 2) vertonen een sterk co-expressie patroon tijdens Neurale differentiatie, evenals in reactie op genotoxische stress door straling of een DNA alkylerende agent. De combinatorische re-expressie van deze module van drie miRNAs door de hieronder beschreven clustering methode resulteert in diepgaande interferentie met de biologie van kankercellen en kan gemakkelijk worden gebruikt als een gentherapie strategie voor preklinische studies¹⁰. Dit protocol kan van bijzonder belang zijn voor degenen die betrokken zijn bij het onderzoek van miRNA en de translationele toepassingen ervan.

Protocol

1. karakterisering van functioneel geassocieerde miRNAs in glioblastoma

1. Analyse van de brede differentiële Mirna expressie in multiform glioblastoom vs. hersenen
   1. Bepaal eerst de meest sterk gedereguleerde miRNAs in de tumor. Dit kan worden bereikt met behulp van ten minste drie verschillende methoden:
      1. Mine de kanker genoom Atlas, gevonden op https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, voor sequencing data¹¹.
      2. Voer microarray analyse uit van een vers operatief specimen¹².
      3. Gebruik eerder gepubliceerde gegevenssets¹³.
         Opmerking: Welke methode er ook wordt gekozen, de output biedt een bulk verzameling miRNAs waarvan de uitdrukking statistisch gecorreleerd is (direct of omgekeerd) met tumor biologie. Deze eerste groep vormt de pool van miRNAs die verder worden geanalyseerd voor de identificatie van een subset van miRNAs die de strengste functionele associatie weergeeft door een meer dynamische analyse van uitdrukkings wijzigingen uit te voeren, zoals hieronder wordt besproken.
2. Voorwaarde-specifieke miRNA-expressie analyse
   1. Inductie van celdifferentiatie:
      1. Gebruik pre-Coated poly-D-Lysine (PDL) plastic gerechten om de vorming van een monolaag cultuur te gunst. Voor de afdeklaag, los PDL in water op met een concentratie van 100 μg/mL. Gebruik 1 mL oplossing per 25 cm² oppervlak. Spoel 2x met PBS 6 h na toepassing van de PDL-oplossing.
      2. Plaat menselijke neurale stamcellen in gelijke hoeveelheden (100.000 cellen/5 mL) hetzij in stamcel medium (neurobasal medium + B27 supplement + 20 ng/mL EGF/FGF), astrocytische differentiatie medium (DMEM + 10% FBS), of neuronale differentiatie medium (neurobasal medium + B27 supplement, + 2 μM retinoïnezuur)¹⁴. Het protocol voor oligodendrocyten differentiatie vereist toevoeging van IGF-1 (200 ng/ml) na EGF/FGF Removal^14,15.
      3. Na celplating, plaats in incubator voor 1 week bij 37 °C, 5% CO₂.
   2. RNA-extractie:
      1. Verwijder na 7 dagen de cellen uit de incubator en verwijder het medium.
      2. Was de cellen met PBS (5 mL). Voeg vervolgens 1 mL lysisreagens (zie tabel met materialen) toe om de cellen te lyseren en de cellen in 1,5 ml microfugebuis Tube te schrapen met behulp van een celscraper. Houd de buisjes met de gelyseerd-cellen gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT).
      3. Ga naar totale RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant.
   3. miRNA expressie analyse:
      1. Kwantificeer de differentiële uitdrukking van specifieke miRNAs die in stap 1,1 is geïdentificeerd onder de drie differentiatie patronen door real-time PCR, met behulp van TaqMan probes en volgens de protocollen van de fabrikant voor omgekeerde transcriptie en PCR-versterking ( Figuur 1).
3. Validatie van miRNA-clusters door stress-specifieke uitdagingen
   1. Cultuur G34 multiform glioblastoom stam-achtige cellen in neurobasal medium + B27 supplement + 20 ng/ml EGF/FGF. Begin met 1 x 10⁶ cellen in 5 ml in een 25 cm² laag gehechtheid kolf.
   2. Vanaf 48 h na het beplating, Voeg elke 5 dagen verdubbelde concentraties van DNA alkylerende agent temozolomide (TMZ) toe, als volgt:
      1. Begin met 5 μM gedurende 5 dagen. Verwijder na 5 dagen het medium en vervang het met vers medium zonder temozolomide, zodat de overgebleven cellen kunnen worden hersteld. Na 48 h, voeg 10 μM TMZ toe en inincuberen voor nog eens 5 dagen.
      2. Herhaal stap 1.3.2.1, verdubbelde TMZ-concentratie elke keer, totdat een concentratie van ten minste 100 μM is bereikt en cellen resistent worden tegen het medicijn¹⁰.
   3. In een parallel experiment, bestraleren G34 cellen als volgt:
      1. Vanaf 48 h na het bekleden van 1 x 10⁶ cellen in 5 ml in een 25 cm² laag bevestigingkolf, bestraleren cellen met 2 gie energie (elke irradiator die foonemissie levert, is aanvaardbaar). Retourneer de cellen naar de incubator en niet storen. Na 48 h, bestraleren de cellen opnieuw met extra 2 gie van energie.
      2. Herhaal stap 1.3.3.1 4x totdat in totaal 10 GY energie wordt toegediend.
      3. Keer de cellen terug naar de incubator en laat ze gedurende ten minste 5 dagen vóór de downstream-analyse in vers medium herstellen.
   4. Na de inductie van resistentie, lyse cellen met lysisreagens en extract totaal RNA volgens het Protocol van de fabrikant.
   5. Analyseer de expressie van de specifieke miRNAs die is geïdentificeerd in de paragrafen 1.1-1.2, zoals beschreven in stap 1.2.1 (Figuur 2).
4. Karakterisatie van de functionele convergentie van geclusterd miRNAs
   1. Verkrijg de voorspelde targetome van elke miRNAs gedefinieerd in de paragrafen 1.2-1.3 verkregen met behulp van miRNA targeting Voorspellings hulpmiddelen.
      Opmerking: We in het algemeen toevlucht tot TARGET scan, als het algoritme wordt periodiek bijgewerkt¹⁶. Extra Voorspellings hulpmiddelen zijn miRanda¹⁷, mirdb¹⁸en Diana-mirpath¹⁹. Al deze Programma's zijn gratis, web-based applicaties.
      1. Selecteer op de voor pagina van target scan de miRNA van belang uit het vooraf ingevulde vervolgkeuzemenu. Klik op de knop verzenden .
      2. Download de resulterende lijst met doelen als een spreadsheet met behulp van de link Download Table (aanvullend figuur 1).
      3. Als u de kans op vals-positieve voorspellingen wilt verkleinen, neemt u in downstream-analyses alleen doelen op in de kolom geconmageerde sites. Bovendien kan verdere striktheid worden verkregen door het gebruik van extra miRNA Voorspellings programma's (zie hierboven) en alleen met inbegrip van doelen die gemeenschappelijk zijn voor alle algoritmen.
   2. Classificeer de resulterende targetomes volgens Genontologie categorieën met behulp van ToppGene Suite²⁰ om te evalueren voor de verrijking van trajecten die gemeenschappelijk zijn voor elke Mirna.
      1. Plak de lijst met doelen die zijn verkregen uit stap 1.4.1 in het venster "training Gene set", met behulp van HGNC-symbool als het boekingstype. Klik op verzenden > starten. Het programma geeft een uitvoertabel weer met de meest significante "Go"-categorieën voor de ingevoerde lijst met genen (aanvullend figuur 2).
   3. Om eindelijk de bijdrage van elke miRNA aan de regulering van een gemeenschappelijk traject of cellulair proces vast te stellen (in dit geval chromatide regulatie), controleert u elk in stap 1.4.1 verkregen targetome tegen de volledige lijst van genen die betrokken zijn bij het specifieke cellulaire proces ( dat wil zeggen, chromatine-regeling), met behulp van de Venn-diagramfunctie van de website bioinformatica en evolutionaire Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
      Opmerking: Dit programma maakt het mogelijk om meerdere groepen tegelijk te doorsnede (Figuur 3). De specifieke unieke doelen die door elke miRNA worden verstrekt, worden vervolgens geannoteerde en geselecteerd voor downstream functionele experimenten.
      1. Op de voor pagina van het programma, uploaden of kopiëren/plakken van de lijst als doel Mrna's voor elke miRNA of belang in de respectieve vensters. Noem elke lijst een unieke id.
      2. Klik op verzenden. Het programma zorgt voor een visuele output van een Venn-diagram met aantallen genen in elke sector, evenals een volledige lijst van Mrna's voor elke subset en snij combinaties.

2. assemblage van miRNA-modules in een Polycistronic transgene cluster

1. Voorbereiding van transgene steiger op basis van miR-17-92 cluster Locus
   1. Verkrijg de nucleotide-sequentie van de miR-17-92-cluster uit de ENSEMBL genoome browser²¹. Selecteer de ~ 800 basis paar "core" sequentie die alle zes gecodeerde miRNA haarspelden van de Locus en ten minste 200-nucleotide flankerende sequenties zowel upstream (5 ') en downstream (3 ') van de kern sequentie omvat.
   2. Plak de bovenstaande reeks in een Word-bewerkingsprogramma.
   3. Definieer de volgorde van elk van de zes native haarspelden door ze op te halen in mirbase²². Markeer elk van deze sequenties binnen de reeks van de eerder geïdentificeerde "core" sequentie. Alle sequenties tussen elke haarspeld vertegenwoordigen spacer sequenties, die belangrijk zijn voor de juiste verwerking van het transgene.
   4. Verwijder de inheemse haarspeld sequenties uit de "kern" sequentie, met uitzondering van 3-5 nucleotiden op zowel de 5 ' als 3 ' uiteinden van elke haarspeld, die als acceptor voor de nieuwe haarspelden zal dienen.
2. Het bouwen van een nieuwe transgen encoding meerdere miRNAs naar keuze
   1. Verkrijg haarspeld sequenties van miRNAs die bedoeld zijn om te worden overgedruct in het transgen van mirbase. Let goed op de specifieke nucleotiden die de sites van microprocessor decolleté.
   2. Vervang de verwijderde haarspelden (stap 2.1.4) door de haarspeld sequenties van de gewenste miRNAs, verkregen in stap 2.2.1.
   3. Voeg de gewenste beperkings sequenties toe aan beide flankerende gebieden van het transgen om het subklonen te faciliteren in de keuze vectoren. Controleer of de gekozen beperkings reeksen niet aanwezig zijn in de volgorde zelf.
   4. Gebruik voor negatieve controles 20-nucleotide-gecodeerde sequenties om de natuurlijke 20-nucleotide-sequentie van elke volwassen miRNA te vervangen. Genereer deze versleutelde sequenties met een online tool zoals https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
3. Controle van de tweedimensionale structuur van het transgen
   1. Kopieer de volledige transgene sequentie naar het RNA structuur Voorspellings softwareprogramma RNAweb fold²³.
   2. Klik op Doorgaanmet de standaardprogramma-instellingen.
   3. Analyseer de grafische uitvoer, met name voor de aanwezigheid van goed gedefinieerde haarspelden en de aanwezigheid van dubbel-gestrande stam structuren ten minste 11 nucleotiden proximale naar de microprocessor decolleté site. Kijk ook naar de afwezigheid van vertakkingspunten binnen de haarspeld sequenties (Figuur 4).

3. verkrijgen van transgenen door DNA-synthese

1. Na het ontwerp en in silico validatie van de chimeer Mirna cluster, verkrijgen van de werkvolgorde met behulp van DNA-synthese van commerciële leveranciers²⁴ en verder met downstream klonen in vectoren en transgen levering. We hebben lentivirale vectoren gebruikt voor in vitro levering¹⁰ en adeno-geassocieerde virussen (aavs) voor in vivo intracraniële levering²⁵.

Resultaten

Deze methode toegestaan karakterisatie van een module van drie miRNAs die consequent worden gedowngereguleerd in hersentumoren, die zijn mede-uitgedrukt specifiek tijdens neuronale differentiatie (Figuur 1) en betrokken bij de tumor Survival reactie na therapie (Figuur 2). Dit wordt bereikt door het reguleren van een complexe oncogene chromatine repressieve traject. Dit co-expressie patroon suggereerde een sterke synergetische ac...

Discussie

Dit protocol is gebaseerd op het idee dat, in plaats van te functioneren in afzondering, miRNAs biologisch relevant is door in groepen te werken, en deze groepen worden transcriptioneel bepaald door specifieke cellulaire contexten²⁶. Om deze benadering vanuit een translationeel perspectief te rechtvaardigen, wordt een follow-up protocol geïntroduceerd dat het mogelijk maakt dit multi-miRNA-patroon in cellen/weefsels te recreëren. Dit is mogelijk door gebruik te maken van de relatief eenvoudige bio...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.4% low melting temperature agarose	IBI Scientific	IB70058
0.45 µM sterile filter unit	Merck Millipore	SLH033RS
1.5 mL Microcentrifuge tube	Eppendorf	22431081
6-Well plates	Greiner Bio-One	657160
Athymic mice (FoxN1 nu/nu)	Envigo	069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	12587010
Cell culture flask	Greiner Bio-One	660175
Cell Scraper, 16cm	Sarstedt	83.1832
Cesium 137 irradiator	JL Sheperd and Associates	Core Facility (Harvard Medical School)
Chloroform	Sigma-Aldrich	439142-4L
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11995040
Dulbecco’s phosphate-buffered saline	Gibco	14190144
Eosin Y solution	Sigma-Aldrich	E4009
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEK-293	American Type Culture Collecti	ATCC CRL-1573
Hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	1051750500
Human primary glioma stem-like cells (GBM62)			Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Human primary glioma stem-like cells (MGG4)			Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP	System Biosciences	CD511B-1
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
Microcentrifuge refrigerated	Eppendorf	model no. 5424 R, cat. no.5404000138
Mounting medium	Thermo Fisher Scientific	4112APG
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	3117-0380PK
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	2000c
Neural Progenitor cells (NPC)			Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system	Nikon, Japan	14314
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985088
PCR tubes	Sigma-Aldrich	CLS6571-960EA
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri-Dishes 94/16	Greiner Bio-One	632180
Poly-D-Lysine	Sigma- Aldrich	P4707
Recombinant Human EGF	PeproTech	AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic	PeproTech	AF-100-18B
Retinoic acid	Gibco	12587-010
RNA Miniprep Kit	Direct-zol	R2050
S1000 Thermal Cycler	Bio-Rad	1852196
Small Animal Image-Guided Micro Irradiator	Xstrahal Life Sciences, UK	Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75000100
StemPro Accutase	Thermo Fisher Scientific	A1110501
StepOne Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376357
SterilGARD biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A-HE
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
T98-G	American Type Culture Collecti	ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4324018
Temozolomide	Tocris Bioscience	2706
Tissue-Tek optimum cutting temperature	Fisher Scientific	NC9636948
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	Lysis reagent
U251-MG	American Type Culture Collecti	ATCC HTB-17
U87-MG	American Type Culture Collecti	ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expression system	Thermo Fisher Scientific	K4970-00
Water, HPLC grade	Fisher	W54
Xylene	Sigma-Aldrich	534056