Een Cryo-pulverisatie protocol voor het verwerken van muis poten voor het evalueren van moleculaire trajecten van weefsel ontsteking in een model van collageen geïnduceerde artritis

Samenvatting

Een cryogene verpulveringsmethode om muriene poten te verwerken met behulp van een vloeibare stikstof vriezer molen werd ontwikkeld om de opbrengst en kwaliteit van RNA of eiwit geëxtraheerd uit de weefsels te verbeteren en de analyse van Moleculaire profielen in verband met inflammatoire Reacties.

Samenvatting

Profilering van moleculaire veranderingen in lokale weefsels is van cruciaal belang om het mechanisme (s) van de therapeutische kandidaten in vivo te begrijpen. Op het gebied van artritis Research, veel studies zijn gericht op ontstoken gewrichten die zijn samengesteld uit een complex mengsel van bot, kraakbeen, spier, stromale cellen en immuuncellen. Hier hebben we een betrouwbare en robuuste mechanische methode opgezet om ontstoken muis poten te verstoren in homogene verpulverd monsters in een cryogene gecontroleerde omgeving. Eiwit en RNA lysaten werden verwerkt om Proteomic en transcriptionele eindpunten en moleculaire karakterisering van relevante ziekte trajecten in lokaal weefsel mogelijk te maken.

Inleiding

Reumatoïde artritis (RA) is een chronische systemische ontstekingsziekte met aanhoudende symmetrische inflammatoire in gewrichten en extra articulaire betrokkenheid van organen zoals de huid, hart, longen en ogen¹. Hoewel de systemische manifestaties van de immuunrespons duidelijk zijn bij menselijke patiënten, is een van de kenmerken van RA pathologie infiltratie van immuuncellen in synoviale weefsels en proliferatie van synoviale fibroblast-cellen².

Net als bij Human RA, ontlokte muis collageen geïnduceerde artritis (CIA) model sterke ontsteking van het weefsel met actieve immuunresponsen in synoviale weefsels en systemische compartimenten. De gevoeligheid van verschillende muis stammen naar CIA model links naar Major histocompatibility complex (MHC) Haplotype en antigeen specifieke T cel en B celinteracties^3,4. Bovendien zijn veel pathogene trajecten in menselijke RA, met inbegrip van de productie van autoantilichamen, immuun complexe depositie, myeloïde celactivering, polyarticulaire manifestaties en pannus vorming met synoviale immuuninfiltratie, ook duidelijk in dit model ^5,6. Onderzoekers hebben dit gevestigde CIA-model gebruikt om de effecten van ontstekingsremmende cytokine-behandelingen te onderzoeken⁷. Veel Biologics die zijn goedgekeurd voor auto-immune of ontstekingsziekten, zoals anti-tnfα en anti-Il-6, bleken werkzaam te zijn in het CIA-model^8,9.

Profilering van de interacties van het immuunsysteem in synoviale weefsel is cruciaal om te verhelmaken moleculaire mechanismen geassocieerd met de pathogenese van RA. In de humane klinische setting is een gebruikelijke praktijk om naald synoviale biopsieën uit te voeren onder leiding van echografie. In de preklinische instellingen maakt de kleinere architectuur van de Murine gewrichten biopsie procedures veel moeilijker, zo niet onmogelijk. Onlangs toonden we het gebruik van het Murine CIA-model om combinaties van geneesmiddelen te evalueren om verschillende eindpunten te beïnvloeden en de ziekte op te lossen in een combinatorische aanpak¹⁰. Een cryogene Vries molen gebaseerde pulverisatie methode werd gebruikt om ontstoken muriene poten te verwerken in homogene fijne poeders en stroomafwaarts processen om RNA en eiwitten te extraheren. Deze methode beschermt RNA en eiwitten tegen enzymatische en chemische degratieve processen en stelt ons in staat om meerdere analytische methoden toe te passen op een enkele gehomogeniseerde monsterbron.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van het Comité voor de instelling van de instellingen voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC) van Janssen R & D.

1. cryogene Vries molen-gebaseerde Verpulsing methode

1. Bij beëindiging van de CIA-studie, offerande muizen met 1,5% Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Op de dag van de weefsel verwerking, pre-chill alle instrumenten (spatels, slijpen flesjes, enz.) op droogijs voor een minimum van 10 min. Draag thermische handschoenen om bevriezing schade te voorkomen.
3. Knip achterpoten met een schaar aan de pels lijn zoals afgebeeld in Figuur 1a.
4. Breng elke poot in één micro centrifugebuis van 1,5 mL, klik onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar bevroren poten bij-80 °C. Houd de monsters niet langer dan een week bevroren.
5. Vul de Vries molen met vloeibaar stikstof zoals afgebeeld in Figuur 1B en laat deze ten minste 10 min.
6. Bewaar onverwerkte monsters op droogijs en Vermijd vries dooi cycli.
7. Breng een achterpoot in de voorgekoelde grote polycarbonaat slijp flacon met een bodem stalen plug, plaats het voorgekoelde stalen botslichaam en sluit de polycarbonaat slijp flacon met de voorgekoelde bovenste stalen plug (Figuur 1C).
8. Breng grote polycarbonaat slijp flacons met de monsters in de Vries molen die vooraf is gevuld met vloeistof en sluit de deksel met de rubberen sluiting aan de voorkant van het instrument.
9. Laat monsters 1 minuut afkoelen in vloeibare stikstof.
10. Stel de Vries molen in op het 1 minuten programma met 10 cycli per seconde en druk op de startknop. Wacht tot de Vries molen zijn cyclus heeft voltooid.
    Opmerking: De machine maakt een drummen geluid als het stalen botslichaam beweegt heen en weer. Gebruik oordopjes om gehoorverlies te voorkomen.
11. Open de deksel van de Vries molen, haal de grote polycarbonaat slijp flacon eruit en plaats deze in een afzuigkap zoals afgebeeld in Figuur 1D. Verwijder de bovenste stalen plug door neerwaartse druk op de zwarte hendel te plaatsen totdat de stalen stekker uit de polycarbonaat buis glijdt.
12. Breng de geopende grote polycarbonaat slijp flacon over op droogijs. Verwijder het stalen botslichaam met voorgekoelde Tang.
13. Breng het bevroren poeder over in de voorgekoelde 50 mL conische buis.
14. Gewicht 30-50 mg bevroren poeder in een getarreerde bevroren 1,5 mL micro centrifugebuis voor RNA-extractie en 100-200 mg bevroren poeder voor EiwitExtractie.
    Opmerking: Het bevroren poeder moet er uitzien als wit of lichtroze fijn zand zoals afgebeeld in Figuur 1E.
15. Bewaar verpulverd monsters bij-80 °C en ga binnen 24 uur naar RNA-en eiwithoudende isolaties.

2. RNA-extractie

1. Voeg 10 μL β-mercaptoethanol (β-ME) toe per 1 mL RLT-buffer.
2. Bereken het volume van de RLT-buffer overeenkomend met een verhouding van 23,3 mL/mg weefsel en voeg het juiste volume van de RLT-buffer met β-ME toe aan de buis met bevroren poeder. Deze ratio werd empirisch bepaald om ideaal te zijn voor muis poten.
3. Vortex het monster bij 3.000 RPM gedurende 10 sec.
4. Meng goed door 10 keer krachtig te pipetteren met een 1 mL pipettor.
5. Vortex het monster opnieuw bij 3.000 RPM gedurende 20 sec.
6. Centrifugeer de buis bij 13.000 x g gedurende 2 minuten.
7. Breng 700 μl van de supernatanten over naar een frisse buis en voeg 700 μl 70% ethanol toe.
   Opmerking: Als < 700 μL in de buis zit, is het aanvaardbaar om verder te gaan, waarbij nog steeds een equivalent volume van 70% ethanol wordt toegevoegd.
8. Laad 700 μL van het monster op een RNA-zuiverings kolom.
9. Centrifugeer de buis bij ≥ 10.000 x g gedurende 30 sec.
10. Gooi de doorstroming weg en laad het resterende deel van het monster in de RNeasy-kolom.
11. Centrifugeer de buis bij ≥ 10.000 x g gedurende 30 sec.
12. Gooi de stroom weg en was de kolom door toevoeging van 700 μL RW1-buffer met centrifugeren van ≥ 10.000 x g gedurende 30 sec. Bij het uitvoeren van de optie DNASE spijsvertering, wordt 350 μL van RW1 toegevoegd vóór de behandeling met DNASE.  En een extra 350 μL van RW1 wordt toegevoegd na behandeling met DNASE.
13. Optioneel) Voer een DNase digestie stap Volg de instructies van de fabrikant.
14. Was de buis tweemaal door toevoeging van 500 μL RPE-buffer, gevolgd door centrifugeren bij ≥ 10.000 x g gedurende 30 sec. Gooi de stroom door elke keer weg.
15. Droog de kolom door centrifugeren bij ≥ 10.000 x g gedurende 2 min.
16. Elute RNA door toevoeging van 50 μL water met centrifugeren bij ≥ 10.000 x g gedurende 2 min. Verzamel stroom door en breng in een nieuwe 1,5 ml buis.
17. Bepaal de hoeveelheid RNA met behulp van de methode naar keuze van de onderzoeker en bewaar bij-80 °C vóór verdere analyse.

3. EiwitExtractie

1. Verdun de lysis-stamoplossing met 10x cel in 1x celllysis Stock-oplossing met behulp van celcultuurgrade water.
2. Reconstitueer de protease inhibitor cocktail set I met 1 mL water om een 100x protease remmer voorraad te maken.
3. Voeg 100 μL proteaseremmer toe aan 9,9 mL 1x Celllysis om een 1x Final stockoplossing te maken.
4. Voeg 4 μL ijskoud 1x Celllysisbuffer per mg weefsel poeder toe (bijv. 800 μL lysisbuffer tot 200 mg weefsel poeder).
5. Voeg een roestvrijstalen kraal van 5 mm toe aan de buis.
6. Vortex de buis bij 3.000 RPM voor 60 s. Breng de buis over naar nat ijs en ga verder naar het volgende monster.
7. Plaats alle monsterbuisjes in een doos en schud de centrifuge box op een rocker bij 1.000 RPM, 4 °C gedurende 1 uur.
   Opmerking: Onderzoekers kunnen vinden dat het plaatsen van de doos verticaal kan beter mengen met de kraal te vergemakkelijken.
8. Centrifugeer de buisjes op 10.000 x g en 4 °c gedurende 15 minuten.
9. Breng de supernatanten over in een frisse buis en Vermijd de vetlaag bovenaan.
10. Bepaal de totale eiwitconcentratie. 10 tot 30-voudige verdunningen van proteïne lysaat zijn ideaal voor een BCA-test.
11. Aliquot het monster in 1,5 mL micro centrifugebuizen en bewaar bij-80 °C vóór verdere analyse.

Resultaten

Hier tonen we een representatieve gel beeld visualisatie van RNA geëxtraheerd uit voorste poten van CIA muizen in Figuur 2a. De 28S rRNA en de 18S rRNA band geven aan dat alle monsters voldoende intact RNA hebben. Vervolgens tonen we een representatieve Scatter plot van totale eiwit concentraties op basis van eiwit BCA-analyse in Figuur 2B. De totale eiwit concentraties van naïeve muizen, CIA-mui...

Discussie

Hoewel er een sterke wetenschappelijke onderbouwing is om moleculaire trajecten in synoviale weefsels te evalueren, waren veel rapporten over immuun profilering van het Murine CIA-model gericht op perifeer bloed, terwijl eiwit-en RNA-analysegegevens van ontstoken poten vrij beperkt zijn. Er zijn verschillende mogelijke redenen voor deze bias: Murine enkelgewrichten zijn niet groter dan ~ 2 cm; de aangetaste gebieden bestaan uit huid, botten en bindweefsels die vaak moeilijk te homogeniseren zijn met behulp van traditione...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5 mm roestvrijstalen kraal	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample verminderend middel dat RNASE-enzymen remt
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA-kwalificatiekit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Water voor celcultuur	Corning	25-055-CI	Water
Stockoplossing voor cellysis	Cell Signaling	9803
Eppendorfbuis	Eppendorf	22363204	Microfugebuizen
Eppendorfbuis centrifugebox	Nalgene	5055	Box voor het houden van eppendorfbuizen in horizontale buisopstelling
Everlast 247 Variabele snelheidsrocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill voor het verwerken van poten in poedervorm
Slijpvial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonaatvial voor het verwerken van poten in poedervorm
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit voor totale eiwitkwantificering
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Proteaseremmers
Proteïne BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysekit
Gekoelde microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugatie
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extractiebuffer
RNeasy minikit	Qiagen	74104	inclusief RNeasy kolom, RLT Buffer en RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatelka	VWR	10806-412	Spatelka voor poederoverdracht
Roestvrijstalen kraal	Qiagen	69989	Kraal voor mengen tijdens eiwitextractie
Buisextractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor voor het verwijderen van de bovenkant van de slijpvial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixen