Een Cryo-pulverisatie protocol voor het verwerken van muis poten voor het evalueren van moleculaire trajecten van weefsel ontsteking in een model van collageen geïnduceerde artritis

Summary

Een cryogene verpulveringsmethode om muriene poten te verwerken met behulp van een vloeibare stikstof vriezer molen werd ontwikkeld om de opbrengst en kwaliteit van RNA of eiwit geëxtraheerd uit de weefsels te verbeteren en de analyse van Moleculaire profielen in verband met inflammatoire Reacties.

Abstract

Profilering van moleculaire veranderingen in lokale weefsels is van cruciaal belang om het mechanisme (s) van de therapeutische kandidaten in vivo te begrijpen. Op het gebied van artritis Research, veel studies zijn gericht op ontstoken gewrichten die zijn samengesteld uit een complex mengsel van bot, kraakbeen, spier, stromale cellen en immuuncellen. Hier hebben we een betrouwbare en robuuste mechanische methode opgezet om ontstoken muis poten te verstoren in homogene verpulverd monsters in een cryogene gecontroleerde omgeving. Eiwit en RNA lysaten werden verwerkt om Proteomic en transcriptionele eindpunten en moleculaire karakterisering van relevante ziekte trajecten in lokaal weefsel mogelijk te maken.

Introduction

Reumatoïde artritis (RA) is een chronische systemische ontstekingsziekte met aanhoudende symmetrische inflammatoire in gewrichten en extra articulaire betrokkenheid van organen zoals de huid, hart, longen en ogen¹. Hoewel de systemische manifestaties van de immuunrespons duidelijk zijn bij menselijke patiënten, is een van de kenmerken van RA pathologie infiltratie van immuuncellen in synoviale weefsels en proliferatie van synoviale fibroblast-cellen².

Net als bij Human RA, ontlokte muis collageen geïnduceerde artritis (CIA) model sterke ontsteking van het weefsel met actieve immuunresponsen in....

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van het Comité voor de instelling van de instellingen voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC) van Janssen R & D.

1. cryogene Vries molen-gebaseerde Verpulsing methode

1. Bij beëindiging van de CIA-studie, offerande muizen met 1,5% Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Op de dag van de weefsel verwerking, pre-chill alle instrumenten (spatels, slijpen flesjes, enz.) op droogijs voor een minimum van 10 min. Draag thermische handschoenen om bevriezing schade te voorkomen.
3. Knip achterpoten met een schaar aan de pels lijn zoals afgebeeld in

Results

Hier tonen we een representatieve gel beeld visualisatie van RNA geëxtraheerd uit voorste poten van CIA muizen in Figuur 2a. De 28S rRNA en de 18S rRNA band geven aan dat alle monsters voldoende intact RNA hebben. Vervolgens tonen we een representatieve Scatter plot van totale eiwit concentraties op basis van eiwit BCA-analyse in Figuur 2B. De totale eiwit concentraties van naïeve muizen, CIA-mui.......

Discussion

Hoewel er een sterke wetenschappelijke onderbouwing is om moleculaire trajecten in synoviale weefsels te evalueren, waren veel rapporten over immuun profilering van het Murine CIA-model gericht op perifeer bloed, terwijl eiwit-en RNA-analysegegevens van ontstoken poten vrij beperkt zijn. Er zijn verschillende mogelijke redenen voor deze bias: Murine enkelgewrichten zijn niet groter dan ~ 2 cm; de aangetaste gebieden bestaan uit huid, botten en bindweefsels die vaak moeilijk te homogeniseren zijn met behulp van traditione.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing