Integriteit van de bloed-hersen barrière is essentieel voor de functie van het zenuwstelsel. In Drosophila melanogasterwordt de bloed-hersen barrière gevormd door gliacellen tijdens de late embryogenese. Dit protocol beschrijft methoden voor het testen van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière in D. melanogaster -embryo's en derde instar larven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Goede ontwikkeling van het zenuwstelsel omvat de vorming van de bloed-hersen barrière, de diffusie barrière die strak regelt de toegang tot het zenuwstelsel en beschermt zenuwweefsel tegen toxines en pathogenen. Defecten in de vorming van deze barrière zijn gecorreleerd met neuropathieën, en de afbraak van deze barrière is waargenomen bij veel neurodegeneratieve ziekten. Daarom is het van cruciaal belang om de genen te identificeren die de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière reguleren om mogelijke therapeutische doelen te identificeren. Om de exacte rollen die deze genen spelen in neurale ontwikkeling te begrijpen, is het noodzakelijk om de effecten van veranderde genexpressie op de integriteit van de bloed-hersen barrière te testen. Veel van de moleculen die functioneren in de oprichting van de bloed-hersen barrière zijn gevonden om te worden bewaard over eukaryotische soorten, met inbegrip van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster. Fruit vliegjes hebben bewezen een uitstekend modelsysteem te zijn voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel reguleren. Dit protocol beschrijft een stapsgewijze procedure voor de bepaling van de integriteit van de bloed-hersen barrière tijdens de embryonale en larvale stadia van de ontwikkeling van D. melanogaster .
Inleiding
Tijdens de ontwikkeling, cel-cel communicatie en interacties zijn van cruciaal belang voor de oprichting van weefsel en orgaan structuur en functie. In sommige gevallen sluiten deze celcelinteracties organen af van de omringende omgeving om een goede orgaanfunctie te waarborgen. Dit is het geval voor het zenuwstelsel, die is geïsoleerd door de bloed-hersen barrière (BBB). Dysfunctie van de BBB bij mensen is gekoppeld aan neurologische aandoeningen zoals epilepsie, en afbraak van de barrière is waargenomen bij neurodegeneratieve ziekten, waaronder multiple sclerose en Amyotrofische laterale sclerose1. Bij zoogdieren wordt de BBB gevormd door nau....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. verzameling van monsters
- Embryo collectie
- Gebruik in elke embryo-opvang kooi minimaal 50 maagdelijke vrouwtjes met 20 − 25 mannetjes voor verzamelingen. Inincuberen deze vliegen in een fles met maïsmeel-agar voedsel (tabel van de materialen) voor 1 − 2 dagen voor aanvang collecties23.
Opmerking: Er kunnen meer vliegen worden gebruikt, maar de verhouding tussen vrouwen en mannen moet op 2:1 worden gehouden. - Pre-warme appelsap agar-platen (tabel 1) bij 25 °c 's nachts.
Opmerking: Dit is nodig voor een goede enscenering van e....
- Gebruik in elke embryo-opvang kooi minimaal 50 maagdelijke vrouwtjes met 20 − 25 mannetjes voor verzamelingen. Inincuberen deze vliegen in een fles met maïsmeel-agar voedsel (tabel van de materialen) voor 1 − 2 dagen voor aanvang collecties23.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hier beschreven methoden zorgen voor de visualisatie van de integriteit van de BBB in het CZS in D. melanogaster embryo's en larven (Figuur 1). Na voltooiing van BBB formatie in de late embryogenese, de BBB functies om grote moleculen uit de hersenen en VNC5uitsluiten. Dit protocol maakt gebruik van deze functie om BBB-vorming te testen. Wanneer wild-type (Oregon R) laat stadium 17 (20 − 21 h oude) embryo's werden geïnjecteerd met 10 kDa dextran geconjugee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol bevat een uitgebreide beschrijving van de stappen die nodig zijn om de integriteit van BBB te testen tijdens de late embryonale en derde INSTAR larvale stadia van de ontwikkeling van D. melanogaster . Soortgelijke benaderingen zijn elders beschreven om te testen van de integriteit van de BBB tijdens de ontwikkeling, evenals in volwassen stadia5,7,29,30. Beschrijvingen van .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Dr. F. Bryan Pickett en Dr. Rodney Dale voor het gebruik van apparatuur voor injectie. Dit werk werd gefinancierd door onderzoeksfinanciering van Loyola University Chicago naar M.D., D.T. en J.J.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran moet worden verdund in geautoclaveerde ddH2O tot een concentratie van 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Steekproeven afgebeeld met 20x objectief (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5;.05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Aangeschaft bij supermarkt. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | Voor visualisatie van YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | Voor visualisatie van GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | Dit wordt ook wel een microinjector of drukregelaar genoemd. Aangezien het model dat in ons onderzoek werd gebruikt niet langer beschikbaar is, is dit een alternatief. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Gebruikt voor weefseldissecatie. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Gebruikt voor injectie. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionogene oppervlakteactieve stof |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
Referenties
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate br....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
