Standaardiseren van een niet-dodelijke methode voor het karakteriseren van de reproductieve status en de larvale ontwikkeling van zoetwatermosselen (Bivalvia: Unionida)

Summary

Het behoud van zoet water mossel is afhankelijk van het monitoren van voortplantings patronen en processen van soorten. Deze studie standaardiseert een niet-dodelijk protocol voor het bemonsteren van Gill-inhoud, het karakteriseren van de larvale ontwikkeling en het verstrekken van een digitale repository voor verzamelde gegevens. Dit protocol-database-pakket zal een belangrijk hulpmiddel zijn voor mossel onderzoekers die niet-verontreinigde soorten herstellen.

Abstract

Het actief monitoren van de timing, ontwikkeling en voortplantings patronen van bedreigde diersoorten is van cruciaal belang bij het beheer voor populatie herstel. Zoetwatermosselen behoren tot de meest belaagde organismen in de wereld, maar informatie over vroege larvale (glochidial) ontwikkeling en broed perioden ontbreekt nog steeds voor vele soorten. Eerdere studies hebben zich geconcentreerd op de complexe levensgeschiedenis fase wanneer vrouwelijke mosselen klaar zijn om gastheer vis te parastiseren, maar weinig studies hebben zich gericht op de broedperiode en timing van de larvale ontwikkeling. Het hier beschreven protocol stelt onderzoekers in staat om de toestand van de graviiteit voor vrouwelijke mosselen niet-dodelijk te evalueren. De resultaten van deze studie tonen aan dat deze methode geen invloed heeft op het vermogen van een vrouwelijke Mossel om zwangere te blijven of na het bemonsteren opnieuw zwangere te worden. Het voordeel van deze methode kan het gebruik ervan mogelijk maken op door de federale staat bedreigde of bedreigde soorten of andere populaties met een hoog instandhoudings probleem. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik op zowel bewaarde als levende individuen en is getest op een verscheidenheid aan Mossel soorten. De verstrekte database is een opslagplaats voor een breed scala aan informatie over de timing van voortplantings gewoonten en zal toekomstig onderzoek naar zoet water Mossel, instandhouding en herstel inspanningen vergemakkelijken.

Introduction

De persistentie van populaties in zoetwatersystemen hangt af van het succes van reproductie en rekrutering. Voor parasitaire organismen kan het identificeren van de fijne kneepjes van de levenscyclus (bv. stadia van larvale ontwikkeling en attractie strategieën voor de gastheer) inzicht geven in de voortplantings gewoonten van een organisme en kritische processen die de werving beïnvloeden. Dergelijke informatie wordt belangrijk wanneer soorten worden ondoorgetrokken en succesvolle rekrutering nodig is om de overblijvende populaties te ondersteunen, of als het herstel het gebruik van gevangenschap noodzakelijk maakt voor de heroprichting van uitgeroeid populaties.

Zoetwatermosselen (Bivalvia: unionida) worden beschouwd als een van de meest belaagde groepen van organismen wereldwijd en een compilatie van soortspecifieke voortplantings gewoonten kan helpen bij onderzoeksinspanningen^{1,2,3 ,4,5}. Met meer dan 800 momenteel erkende soorten verdeeld over de hele wereld, hebben zoetwatermosselen hotspots van diversiteit in Noord-en Zuid-Amerika en Zuidoost-Azië, maar essentiële levensgeschiedenis informatie is onbekend voor vele soorten^{2, 5,6,7}. Families binnen deze orde worden gekenmerkt door het hebben van parasitaire larvale stadia die metamorfose in vrij levende jonge exemplaren tijdens gehechtheid aan een gastheer^7,8voltooien. Deze unieke levensgeschiedenis fase draagt bij aan de biodiversiteit in zoet watersystemen, die zich momenteel in crisis⁹bevinden. Hoge niveaus van imperilment kunnen worden toegeschreven aan vele antropogene dreigingen, waaronder vervuiling van waterwegen, wijziging van de habitat en vernietiging, vermindering van de overvloed en diversiteit van de gastheer vissen, en de introductie van invasieve soorten^{1, 10}. Als benthische filter feeders worden mosselen in het substraat begraven en zijn ze vatbaar voor verontreinigingen en verontreinigende stoffen die in de waterscheiding¹¹lopen. Terugwinning van Mossel soorten is relevant omdat ze een breed scala aan ecosysteemdiensten bieden, waaronder koolstofvastlegging, een voedselbron en waterzuivering door filter voeding¹¹. Daarnaast zijn mosselen gevonden om ecosysteem gezondheid aan te duiden, biodiversiteit te bevorderen en op hun beurt de veerkracht van een ecosysteem¹²te verhogen.

Veel zoet water Mossel studies hebben zich geconcentreerd op het onderzoeken van vereisten voor vroege levensgeschiedenis om de soorten status beoordelingen en management strategieën beter te informeren. De families van zoet water Mossel die relevant zijn voor deze studie (bijvoorbeeld Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) hebben een unieke levensgeschiedenis strategie waar vrouwtjes broed larven (glochidia) in hun buideldieren⁸. Door middel van een verscheidenheid aan strategieën verdrijft de vrouwelijke Mossel rijpe glochidia van buideldieren om een gewervelde gastheer met glochidia¹³te parastiseren. Onderzoek naar de ontwikkeling van glochidial binnen de kieuwen werd gewijzigd van een techniek met behulp van hypodermische spuiten om gonadale vloeistof van levende mosselen te proeven en de productie van gameten evalueren^14,15,16. Omdat onderzoekers deze niet-dodelijke methodologie voor gonaden-sampling hebben gevalideerd, werd het aangepast voor marsupiale Gill-bemonstering om broed ontwikkeling^15,16te evalueren. Brood ontwikkeling kan worden gebruikt om fylogenetische relaties te ontcijferen, omdat sommige Mossel soorten glochidia alleen kunnen broeden in de buitenste twee kieuwen (ectobranchus), alleen de binnenste twee kieuwen (endobranchus) of in alle vier de kieuwen (tetrabranchus), maar dit kenmerk is niet bekend voor elke soort¹⁷. Broed patronen zijn eerder gebruikt om Mossel soorten te classificeren door vrouwelijke mosselen brood glochidia in de winter (bradytictic) of voor een korte periode in de zomer (tachytictic)¹⁸. De overwintering van Mossel broods werd gesteund toen de voortplantingscyclus van Anodonta werd bestudeerd¹⁹. De basis reproductie biologie werd echter door de jaren heen grondig bestudeerd en vond deze dichotomie een grove generalisatie en broed perioden van sommige soorten zijn veel complexer dan oorspronkelijk verondersteld^20,21. Bijvoorbeeld, soorten van het geslacht hyridella (familie hyriidae), glebula, en elliptio (familie Unionidae) zijn waargenomen met opwaarts van drie broods per broedseizoen^{22,23, 24}. De complexiteit van soortspecifieke, en soms zelfs populatie-specifieke²⁰, voortplantings gewoonten heeft geleid tot een leemte in de kennis over de timing en de duur van broeden, en het aantal broods dat een vrouwelijke Mossel kan produceren.

Hoewel hypodermische spuiten zijn gebruikt om Gill-inhoud te extraheren, is de rapportage van de resultaten ingewikkeld vanwege het gebrek aan standaardisatie om vergelijkbare resultaten in alle onderzoeken te garanderen. Eerder werden vier ontwikkelingsstadia van glochidia (d.w.z. ei, embryo, onvolwassen, volledig ontwikkeld) geïdentificeerd in Unionidae, maar zijn niet in de standaardprocedure^16,25,26vastgesteld. Andere studies die de leden van margaritiferidae observeren, hebben de classificatie van ' onvolgroeide glochidia ' vervangen door ' het ontwikkelen van glochidia ', wat leidt tot een mogelijke verwarring van^27,28. Het gebrek aan consistentie bij het karakteriseren van de verschillende larvale ontwikkelingsstadia heeft veel onderzoekers verlaten om in het algemeen broze vrouwtjes te beschrijven als ' gravid ', wat niet de fijne kneepjes van de larvale ontwikkeling omvat. Life History studies met host-Fish Trials hebben de behoefte aan zwangere-vrouwtjes met een volledig ontwikkelde glochidia geprioriteerde, maar deze informatie is verspreid over gepubliceerde en ongepubliceerde literatuur^29,30. Momenteel ontbreken gegevens over het voortplantingsgedrag van veel Mossel soorten, waaronder de timing van de overgang tussen ei, onrijpe glochidia en volledig ontwikkelde glochidia klaar voor bevestiging aan gastheren. Voor de meeste soorten is het onduidelijk hoe lang vrouwtjes brood glochidia en hoe snel bevruchte eitjes zich volledig ontwikkelen. De kennislacunes zijn vaak breder voor soorten instandhoudings zorg, die de noodzaak van een gestandaardiseerde methode voor het extraheren van Gill-inhoud die is getest op niet-dodelijke effecten en kan worden bevorderd tot de wetenschappelijke gemeenschap ter aanvulling van reguliere gegevensverzamelingsmethoden, zonder een bedreiging voor de beschermde populaties te vormen^24,31,32.

Deze studie had drie doelstellingen: 1) formaliseren van een Gill sampling techniek en testen voor dodelijke en niet-dodelijke effecten op vrouwelijke mosselen in situ, 2) karakteriseren verschillende stadia van glochidial ontwikkeling en beschrijven een gestandaardiseerde methode voor het identificeren en het rapporteren van verschillende larvale stadia, en 3) Maak een openbare repository voor de verzamelde gegevens. Veld enquêtes, lange termijn monitoring projecten, en museumcollecties vertegenwoordigen alle mogelijkheden voor het hier beschreven protocol en aanvullende gegevens die moeten worden verzameld voor een bredere interesse. Het geformaliseerde protocol bevat visuals en karakterbeschrijvingen voor het differentiëren van elke fase van de larvale ontwikkeling. Door de categorieën te standaardiseren, kunnen de verzamelde resultaten worden vergeleken bij alle voorvallen en soorten. Zodra gegevens worden verzameld, kunnen alle worden ingediend bij de zoet water Mossel Gravidity almanac (FMGA), een database voor gravidity informatie verzameld met behulp van dit protocol. Een eindproduct voor het opslaan en compileren van alle gravidity verzamelde informatie zal een onderzoeksinstrument bieden om toekomstig onderzoek, behoud en herstel inspanningen te faciliteren. De opname van deze methodologie in verschillende Mossel projecten en de indiening van gegevens aan FMGA zou het hele jaar door de brede kennis over de gravidity status van Mossel soorten uitbreiden. Dit protocol en de resulterende database over het voortplantingsgedrag van zoetwatermosselen is als een zeer belaagde groep van organismen essentieel om de populatiedynamiek te begrijpen en het behoud van deze soorten te vergemakkelijken.

Protocol

1. gravid vrouwelijke collectie

Opmerking: verwijs naar het Freshwater Mussel Survey protocol³³ van de Fish and Wildlife Service voor richtlijnen over het adequaat onderzoeken van een bemonsteringsplaats voor bedreigde of bedreigde diersoorten. De juiste federale vergunningen moeten worden verkregen vóór het verzamelen van beschermde soorten en staats vergunningen voor alle aanwezige soorten.

1. Verzamel levende mosselen uit het veld met behulp van tactiele visuele methoden (stap 1,2) of gebruik bewaarde specimens uit een museum (stap 1,3).
   Opmerking: het is belangrijk om levende mosselen koel en nat te houden na verzameling om uitdroging te voorkomen en stress te verminderen, en minimale behandeling van zwangere mosselen is belangrijk om te voorkomen dat vrouwen voortijdig het vrijgeven van Gill-inhoud³⁴.
2. Evalueer de vrouwelijke graviditeit door middel van visuele inspectie tijdens het verzamelen (bijv. aanwezigheid van mantel lokken, conglutinaten, enz.) of door visuele inspectie na het verzamelen (bijv. zachtjes wrikt open kleppen genoeg om naar binnen te kijken en te zien of de kieuwen zijn opgeblazen, zie Figuur 1).
   Let op: de soorten variëren in hoe glochidia in de buideldieren worden gebroed, omdat soms alleen de twee buitenste kieuwen (ectobranchus), alleen de twee binnenste kieuwen (endobranchus) of alle vier de kieuwen (tetragene) buideldier¹⁷zijn. Het protocol kan hier worden onderbroken, en zwangere-vrouwtjes kunnen terug naar het laboratorium worden getransporteerd voor Gill-bemonstering.

Figuur 1: zachtjes nieuwsgierige personen open. Om de graviiteit van een levend Mossel te controleren, open de kleppen voorzichtig met duimen (a) of gebruik voorzichtig een speculum of omgekeerde tang om de kleppen te openen (B). Bekijk stap 2,3 in het protocol voor waarschuwingen die zijn gekoppeld aan deze methode. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. Voer een visuele inspectie uit op bewaarde specimens door de kleppen te openen en de kieuwen te inspecteren om te bepalen of het individu een zwangere-vrouwtje is (Figuur 2).

Figuur 2: hoe een zwangere-vrouwtje te identificeren. Vrouwelijke Mossel marsupiale kieuwen verschijnen opgeblazen wanneer het vrouwtje zwangere en brooding is. Foto's A en C tonen de kieuwen vanuit een lateraal perspectief, terwijl Foto's B en D een ventrale weergave van de kieuwen geven. Rode dozen schetsen de kieuwen om de verschillen tussen een zwangere (a/B) en niet zwangere (C/D) vrouwelijke Lampsilis straminea Mussel te benadrukken. De totale lengtes van de individuen zijn 79 mm (A/B) en 88 mm (C/D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. steekproef van Gill-content

Opmerking: dit protocol kan worden aangepast of bemonstering plaatsvindt op levende mosselen in het veld en in het laboratorium, of op geconserveerde specimens.

1. Maak een plastic microcentrifuge-opvang buisje van 1,5 mL met ongeveer 1 mL steriel water als Gill-inhoud binnen 24 uur na extractie³⁵ of ethanol (EtOH) wordt geëvalueerd als de monster beoordeling niet binnen 24 uur na de inzameling kan voorkomen of als Gill de inhoud komt van een museum specimen bewaard in EtOH. Als glochidia bedoeld is voor het scannen van elektronen microscoop (SEM) Imaging, gebruik dan 70% EtOH, en als glochidia zal worden gebruikt voor genetische testen, gebruik niet-denatureerde 95% EtOH³⁶.
2. Verwijder de papier verpakking voor één steriele 20 G schuine-punt naald op een 10 mL spuit. Draai de dop los om de naald bloot te leggen en maak een plastic buis van 1,5 mL voor de Gill content Collection. Duw de hendel van de spuit helemaal naar beneden, zodat de zwarte stopper zich op de 0 mL/CC lijn bevindt.
   Opmerking: elke keer dat de Gill-inhoud wordt bemonsterd, moet een steriele spuit worden gebruikt. Een gebruikte spuit kan in het veld worden gesteriliseerd door de punt in een 10% bleekmiddel te dompelen, vervolgens de spuit te spoelen door deze te vullen met 1 mL steriel water en de zuiger terug te trekken tot 0 mL/CC, en tenslotte de spuit met een schone doek te drogen.
3. Pak de zwangere vrouw en zachtjes wrik Open de twee kleppen met behulp van de toppen van de duimen.
   Let op: Wees voorzichtig om het dier niet te schaden. Het openen van de kleppen te breed of te snel kan de adtorspieren oververlengen en sterfte veroorzaken. Dunne gepeld specimens (bijv. soorten Anodonta, leptodea, utterbackia, enz.) en jonge individuen zijn in deze stap bijzonder kwetsbaar. Het krachtig hanteren van fragiele gepeld soorten kan de schelpen kraken en sterfte veroorzaken. In sommige gevallen, knijpen van dun gepeld dieren van de voorste en achterste schelp marges, terwijl het kijken naar het ventrale oppervlak, zal de schelp te buigen en Gape licht, waardoor men de kieuwen te observeren of wrikken Open de schelpen en Vermijd beschadiging van de fragiele Shell marge.
   Opmerking: hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om te helpen bij deze stap, maar kunnen ook sterfte veroorzaken als ze niet met zorg worden gebruikt en moeten worden vermeden wanneer dat mogelijk is. Bijvoorbeeld, een speculum of aangepaste set van reverse tangen kan worden gebruikt om te helpen wrikken de individuele open en een wig kan worden gebruikt om te helpen prop de kleppen open. Deze instrumenten zijn mogelijk niet nodig als een andere persoon beschikbaar is om te helpen (d.w.z. één persoon houdt het dier open terwijl een andere de spuit voor extractie manoeuvreer). Beschadiging of scheiding van het mantel weefsel uit het Periostracum kan leiden tot groei misvormingen en sterfte³⁷; Daarom is het essentieel om te voorkomen dat de verbinding tussen het mantel weefsel en de buitenmarge van de schelp wordt verbroken.
4. Gebruik de naaldpunt van de spuit om zachtjes in een enkele waterbuis van de opgeblazen marsupiale Gill te dringen. Schep vervolgens voorzichtig de Gill-inhoud uit door gebruik te maken van de schuine punt van de naald.
   Opmerking: Gill-inhoud heeft meestal een melkwitte consistentie, die zichtbaar moet zijn op de schuine punt van de naald.
   1. Stort de inhoud van de spuit rechtstreeks in een Petri schaaltje als een Microscoop direct beschikbaar is. Bewaar de inhoud anders in een micro centrifugebuis van 1,5 mL met aangewezen vloeistof (zie stap 2,1) voor een latere evaluatie.
      Opmerking: Minimaliseer verstoring en behandeling van glochidia-monsters tijdens transport om schade te voorkomen en verminderde levensvatbaarheid^32,35.
5. Noteer informatie over de geslachts soort identificatie, gravidity status, lengte van het vrouwtje (mm), verzamel-en contactinformatie, staat, provincie, drainage, specifieke ophaallocatie, breedtegraad en lengtegraad, een unieke identificator voor de Gill monster, een unieke identificator voor de onderzoekssite en de datum van verzameling als Gill-inhoud is geëxtraheerd (Figuur 3). Noteer op elk Verzamel schip een unieke identificatie om te zorgen voor nauwkeurige gegevens registraties tijdens het transport.
   1. Foto van de buiten rechterklep van de Mossel voor identiteits validatie en omvatten de buis gelabeld met de unieke identificator leesbaar in de afbeelding. Optioneel, verzamelen andere abiotische en biotische parameters ter aanvulling van de informatie over het milieu en de Gemeenschap de Mossel werd gevonden in (Zie Figuur 3 voor suggesties).

Afbeelding 3: voorbeeld van een veld gravidity gegevensblad. Nauwkeurige gegevensrapportage is noodzakelijk als een Gill-monster wordt genomen om betrouwbare informatie te produceren. Dit is een voorbeeld van een veldgegevens blad met de minimum velden en extra abiotische parameters die samen met elk Gill-monster moeten worden verzameld. Zie voor uitgebreidere informatie stap 4,1 in het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. laboratoriumbeoordeling van Gill-inhoud

1. Als Gill-inhoud in een tube van 1,5 mL zit, breng ze dan over in een Petri schaaltje en vul de bodem van het gerecht met water. Zwenk de Petri schaal zachtjes in een cirkelvormige beweging om de inhoud in het midden van het gerecht te verzamelen voor een meer geconcentreerde weergave van het monster.
   Opmerking: de tube van 1,5 mL moet mogelijk worden gespoeld met een spuitfles of pipet gevuld met water als de Gill-inhoud aan de buiswanden blijft kleven.
2. Plaats de Petri schaal onder een ontleed Microscoop om het monster te evalueren. Neem indien mogelijk een foto van het Gill-monster onder de Microscoop en label het met de unieke identificator voor dat monster.
   1. Record resultaten waarvan de ontwikkelingsstadia aanwezig zijn in elk Gill-monster. Gebruik Figuur 4 als leidraad om elke ontwikkelingsfase te karakteriseren. In sommige gevallen, vrouwtjes kunnen broeden larven in meerdere ontwikkelingsstadia; Rapporteer daarom elke ontwikkelingsfase die binnen een bepaald monster wordt waargenomen (bijv. ' EGG/DG/IMG/FDG '). Eenmaal bewaard gebleven glochidia zijn geëvalueerd, ga verder naar rubriek 4. Indien volledig ontwikkelde glochidia worden geïdentificeerd en EtOH niet werd gebruikt voor conservering, ga verder naar stap 3,3.
      Noot: ei, eier massa's; DG, ontwikkeling van glochidia; IMG, onvolwassen glochidia; FDG, volledig ontwikkelde glochidia.

Figuur 4: voorstellingen voor verschillende stadia van de glochidia-ontwikkeling in de buideldieren. A) Eier MASSA'S (ei) hebben een membraan dat eieren samenklontert. Binnen elk eimembraan is er een ondoorzichtige sferische massa van differentiërende cellen. De ondoorzichtige bolvormige massa kan tijdens de vroege celdeling in meerdere sferische massa's worden gesplitst, maar moet nog steeds als ei worden opgenomen totdat een afzonderlijke tweekleppige vorm wordt waargenomen. B) onrijpe glochidia (img) heeft een afzonderlijke tweekleppige massa die zich in het eimembraan bevindt. (C) het ontwikkelen van glochidia (DG) heeft een afzonderlijke tweekleppige vorm, geen eimembraan en ongeorganiseerd weefsel binnenin, vaak vaag van uiterlijk. Het ontwikkelen van glochidia (DG) is niet reactief bij blootstelling aan NaCl en geclassificeerd als "DG (T)" wanneer gegevens worden geregistreerd. (D) volledig ontwikkelde glochidia (FDG) hebben de verschillende tweekleppige vorm en voor de hand liggende adder spierweefsel waardoor glochidia kan sluiten. Volledig ontwikkelde glochidia (FDG) worden vaak gezien als twee open kleppen na conservering. Twee open kleppen worden meestal gesloten, of open en gesloten, wanneer ze worden blootgesteld aan NaCl en worden geclassificeerd als ' FDG (T) '. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. Voer een natriumchloride (NaCl)-test uit om de levensvatbaarheid van een volledig ontwikkelde glochidia verder te evalueren door een kristal van NaCl toe te voegen aan een subset druppel van het Gill-monster³⁵. Levensvatbare glochidia zal reageren op NaCl door het sluiten van hun kleppen vanuit een open positie. Alle zoutgeteste glochidia melden met ' (T) ' aan het einde van de aanwijzing wanneer gegevens worden geregistreerd.
   Opmerking: volledig ontwikkelde glochidia kan ook worden waargenomen actief magnetisch open en gesloten zonder blootstelling aan NaCl.

4. rapporteren aan de database

1. Toegang tot de fmga Web (http://arcg.is/089uee), die werd ontwikkeld met behulp van online software Programma's^38,39,40. De pagina FMGA bevat een koppeling naar het formulier voor het invoeren van bureaublad gegevens en het downloaden van een toepassing voor mobiele apparaten. De mobiele app maakt gegevensinvoer in het veld en automatische georeferentie⁴¹mogelijk.
   Opmerking: de gravidity kalender en andere afbeeldingen in verband met de levensgeschiedenis van zoet water Mossel soorten zijn ook te vinden op het FMGA dashboard.
   1. Gebruik de mobiele app of de desktopsite om resultaten op te nemen in het formulier voor gegevensinvoer door gebruik te maken van vervolgkeuzemenu's en tekstinvoer velden. Neem voor grote, vooraf bestaande gegevenssets contact op met de auteurs voor het sjabloonwerkblad. Voer opgenomen gegevens in onder de juiste kolomkoppen en onthoud dat elke record of rij in het werkblad observaties van een Gill-monster van één zwangere-individu vertegenwoordigt.
   2. Verzend de resultaten en ze worden toegevoegd aan de FMGA-database nadat ze zijn gevalideerd door een beheerder, die contact kan opnemen met het verzamelprogramma om meer details of Foto's aan te vragen.
      Opmerking: zodra gegevens zijn gevalideerd en gecompileerd in de FMGA-database, worden alle gravidity-kalenders en andere interactieve afbeeldingen die worden weergegeven op het FMGA-dashboard bijgewerkt.

Results

Dit protocol werd toegepast tijdens een Capture-Mark-recapture-studie die de zoet water Mossel Gemeenschap bewaakte binnen een 750 m² stuk Bruce Creek (Walton County, Florida) van januari 2015 tot december 2015. Er werd elke vier weken veld bemonstering gepland; echter, als gevolg van High-Flow gebeurtenissen, bemonstering werd niet uitgevoerd in april of september van 2015. Staats-en federale agentschappen, waaronder U.S. geologische Survey, U.S. Fish and Wildlife Service, en Florida Fish and Wildlife Conservation Commission assisteerde in veld enquêtes en Gill sampling. Elke zwangere-vrouw die tijdens de enquête werd aangetroffen, werd onderworpen aan in-Field steekproeven met behulp van het hierboven beschreven protocol, getagd (Zie tabel van materialen), en terug in de rivier substraat geplaatst. De Gill-monsters werden opgeslagen in 95% EtOH en getransporteerd naar het Wetland en het aquatische onderzoekscentrum laboratorium van de Amerikaanse Geological Survey voor de beoordeling van Gill-inhoud.

Door vrouwen te taggen en ze gedurende het hele jaar maandelijks te heroveren, hebben we zowel dodelijke als niet-dodelijke effecten van het Gill sampling protocol geëvalueerd op een totaal van 90 individuen. De volgende zeven soorten werden heroverd tijdens deze studie : Elliptio pullata (n = 5) , fusconaia burkei (n = 1), hamiota australis (n = 19), obovaria Choctawensis (n = 1), strophitus williamsi (n = 1) , Villosa lienosa (n = 60), en villosa vibex (n = 3). Onze bemonstering omvatte individuen variërend van 24 mm tot 80 mm in totale lengte en twee soorten (F. burkei en H. australis) beschermd door de Amerikaanse bedreigde soorten Act. Alle gegevens die in deze studie worden gebruikt, zijn openbaar beschikbaar we hebben toegang tot onze gegevensset op ScienceBase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)⁴².

Survivorship werd beoordeeld aan de hand van hoeveel individuen levend werden heroverde na Gill sample Collection. We observeerden hoog overlevings (97%) tijdens de studie met enige sterfte, eventueel bijdragetabel aan predatie, aangegeven door waarnemingen op locatie. Resultaten toonden rond 51% van individuen (46 van 90) bleken te blijven zwangere tussen opeenvolgende bemonstering gebeurtenissen. Nog eens 10% van de individuen (9 van 90) werden gevonden zwangere, heroverde niet zwangere en vonden zwangere opnieuw. Ongeveer 39% van de individuen (35 van 90) in deze studie werden gevonden zwangere, een Gill monster werd genomen, maar toen heroverde het hele jaar door, ze werden nooit gevonden zwangere een tweede keer. De resultaten geven aan dat het hier beschreven protocol niet dodelijk of subdodelijk is en de huidige broedperiode na het bemonsteren van de Gill niet wezenlijk verstoort.

Hoewel steekproefgroottes in deze studie ongelijk zijn over verschillende soorten, wijzen de resultaten van deze studie op de nuttige en praktische toepassingen van dit protocol. De gravidity kalender voor V. lienosa illustreert zwangere vrouwtjes broding FDG werden gevonden in bijna elke maand van het jaar behalve augustus, toen alleen vrouwen broeden Egg werden gevonden (figuur 5a). Het vrouwtje H. australis werd in juli, augustus en december niet in de zwangere (ng) aangetroffen. Een groter deel van de vrouwtjes was in januari en februari een broze FDG, maar vond ook in oktober en november (Figuur 5b). Geen individuen van E. pullata werden gevonden broeden FDG hoewel vrouwtjes waren broeden ei van mei tot juni, en een zwangere vrouwelijk opgenomen (GFR) in juni (figuur 5c). De enige zwangere F. burkei vrouw werd gevonden GFR in juni en heroverde ng in juli. De zelfde O. choctawensis individu werd verzameld FDG in februari en heroverde ng in juli. Slechts één S. williamsi werd gevonden en werd drie keer heroverde. Deze vrouw werd gevonden FDG in maart, NG in mei, GFR in juni, en ei in augustus (figuur 5c). Gravid vrouwtjes van V. vibex broeden FDG werden gevonden tussen februari en juni (figuur 5c).

Figuur 5: resultaten van de studie in Bruce Creek, FL weergegeven in een gravidity kalender formaat. (A) gravidity kalender voor villosa lienosa vangt/herneemt. B) gravidity kalender voor hamiota australis vangt/herplaatst. C) gravidity kalenders voor alle soorten met minder dan 10 personen bemonsterd. De y-as bevat afkortingen voor de maanden januari (Ja), februari (F), maart (Dhr.), mei (mijn), juni (JN), juli (Jl) augustus (A), oktober (O), november (N) en december (D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Betekenis

Instandhouding van onbeschermde soorten is afhankelijk van succesvolle rekrutering binnen bestaande populaties. In sommige gevallen kan kunstmatige vermeerdering nodig zijn om de werving van deze risicopopulaties te vergroten. Dit vereist dat onderzoekers worden geïnformeerd over de timing van de actieve reproductie voor elke soort en mogelijk verschillende methodologieën of beheerspraktijken toepassen om de impact op de werving te beperken. Als een ontoiled groep van organismen is het van het grootste belang om een gestandaardiseerde en niet-dodelijke benadering te hanteren voor het bestuderen van voortplantings gewoonten, en om een platform te bieden waarop gegevens kunnen worden gecompileerd en visualiseren om de wetenschappelijke gemeenschap te informeren over de meest up-to-date beschikbare informatie. Deze studie biedt een stapsgewijs protocol om ervoor te zorgen dat er voorzorgsmaatregelen worden genomen en Gill-inhoud kan adequaat worden bemonsterd en geëvalueerd door vrouwelijke mosselen. Dit protocol is getest op dodelijke en niet-dodelijke effecten, waardoor onderzoekers en managers deze methodologie op een verantwoorde manier kunnen implementeren. We ontwikkelden ook een reeks database management tools en applicaties om de compilatie van gravidity informatie op een publiek beschikbaar, gebruiksvriendelijk dashboard te faciliteren. Studies over epidemiologie, glochidia morfologie, levensgeschiedenis, fylogenetica, propagatie, en translocaties kunnen allemaal profiteren en gebruik maken van deze repository van temporele gravidity informatie voor alle soorten van zoetwatermosselen.

Deze studie alleen ondersteunde eerdere studies ' bevindingen van sommige soorten voortplantings gewoonten, maar ook onthuld nieuwe informatie over anderen. Hoewel v. vibex in minder aantallen dan v. lienosawerd verzameld, zijn er gelijkenissen gevonden tussen de twee op basis van de gravidity gegevens. Beide soorten villosa lijken tijdens een groot deel van het jaar volledig ontwikkelde glochidia te broeden, wat ze karakteriseert als een overwinterende brooder. Dit is consistent met eerdere studies over andere villosa soorten^43,44,45. De resultaten van deze studie suggereren dat H. australis kan worden gevonden zwangere van oktober en overwinterende in juni, behalve dat geen opnames werden gevonden zwangere in december. Een eerder gepubliceerde studie geïdentificeerd congeneer H. altilis met een gravidity periode van vier maanden, maart tot en met juni^46,47. Deze bevinding illustreert een langere gravidity periode dan eerder gedacht en in het algemeen groepen H. australis als een overwinterende brooder. Als federaal beschermde soorten kunnen wisselende broed perioden voor h. altilis en h. australis invloed hebben op beheersbeslissingen om populaties beter te beschermen tijdens reproductief actieve tijden. Elliptio pullata werden alleen gevonden zwangere met ei in mei en juni die overeenkomt met hun karakterisering als een tachytictic soort met een zeer korte broedperiode^{24,48,49, 50}. Naarmate gegevens worden gecompileerd op Elliptio -soorten met behulp van dit protocol, kan gedetailleerde informatie de veld inspanningen efficiënter maken wanneer bepaalde glochidial-ontwikkelingsstadia zijn gericht, omdat glochidia slechts enkele maanden uit het jaar wordt gevonden. Deductie van de andere soorten met lagere steekproefgroottes is beperkt, maar naarmate gegevens in de database worden gecompileerd, geven hogere steekproefgrootten inzicht in de voortplantings gewoonten van extra Mossel soorten.

Procedurele opmerkingen

Zoetwatermosselen en hun glochidia zijn bekend om gevoelig te zijn voor antropogene stressoren^10,35. Tijdens de gravidity inspectie zijn de Mossel kleppen mogelijk niet gemakkelijk te openen, en het onzorgvuldig forceren van de kleppen open kan onbedoelde schade veroorzaken en resulteren in stress of sterfte. Sommige fragiele gepeld soorten (bijv. soorten Anodonta, leptodea, utterbackia, enz.) en kleinere individuen kunnen zeer fragiele schelpen en zwakke adder spieren hebben die gemakkelijk kunnen breken en scheuren. Gill sampling kan worden beschouwd als een stressor als de behandeling niet verantwoord en met de nodige voorzichtigheid wordt gedaan. Uit een eerdere studie bleek dat het hanteren en blootstelling van de lucht bij mosselen tijdens de reproductief actieve tijden verschillende fysiologische stress kan veroorzaken, waaronder de vroegtijdige afgifte van Gill-inhoud³⁴. Echter, een studie met behulp van een soortgelijke methodologie zoals hier beschreven, gevonden omgaan met zwangere vrouwelijke mosselen tijdens Gill bemonstering niet onderbreken de huidige broed of veroorzaken vroegtijdige vrijlating in zowel korte-en lange-termijn broeden soorten¹⁶. Bovendien moet tijdens dit protocol een steriele spuit worden gebruikt om onbedoelde infectie of kruisbesmetting te voorkomen bij het prikken van kieuwen van meerdere personen. Bovendien, glochidia zijn kwetsbaar en broods kunnen worden gerijpt en gestrest, maar niet uitgezet. Volwassen glochidia in slechte gezondheid kan resulteren in minder individuen reageren op zout tests³⁵. Bij het maken van het onderscheid tussen DG (T) en FDG (T) is het belangrijk om zout te testen met een grote steekproefomvang, aantekeningen te maken op observaties om onderscheid tussen DG en FDG glochidia zorgvuldig te identificeren aan de hand van de beschrijvingen die in deze studie worden gegeven. Wanneer de juiste verzorging wordt gemaakt, kan de minimale stress die door deze procedure wordt veroorzaakt, vrouwelijke mosselen in staat stellen om glochidia natuurlijk voort te zetten en de impact op rekrutering in de populatie te verminderen.

Aanvullende gegevens kunnen worden opgenomen ter aanvulling van de database en bieden een brede context voor reproductieve gewoonten van zoetwatermosselen. Sommige soorten (bijv. soorten Fusconaia), zijn waargenomen om kieuwen van verschillende kleuren te hebben op basis van de ontwikkelingsfase van de glochidia⁵¹. Tijdens een initiële gravidity controle van het vrouwtje, kan een beschrijving van de Gill Color worden opgenomen in de gerapporteerde gegevens om toekomstig onderzoek mogelijk te maken. Ook, op dit punt in het Protocol, onderzoekers kunnen opmerken of de broeden vrouw werd gevonden broeden glochidia in de twee buitenste kieuwen (ectobranchus), twee innerlijke kieuwen (endobranchus), of alle vier kieuwen (tetragene)¹⁷. Deze informatie kan worden toegevoegd aan FMGA en helpen bij het invullen van gegevens hiaten met betrekking tot broeden voor elke onderzochte diersoort. Milieuomstandigheden, met name watertemperatuur, kunnen worden verzameld en geregistreerd in het veld voor een uitgebreidere observatie van de gravidity status en timing van soorten in verschillende latitudinale bereiken. Uit onderzoek blijkt dat milieuparameters, zoals temperatuur, foto operiod, debiet en beschikbaarheid van levensmiddelen, voortplantings verschijnselen kunnen veroorzaken in zoetwatermosselen^{52,53,54,55 ,56}. Aanvullende velden kunnen worden toegevoegd aan de database als ze worden ingediend ter bevordering van toekomstig onderzoek naar abiotische factoren die van invloed zijn op de grafediteit. Een wijziging van Capture-Mark-recapture gemodelleerd na onze studie kan ook aan dit protocol worden toegevoegd, waardoor onderzoekers de voortplantings gewoonten van een specifiek Mossel kunnen monitoren en informatie over meerdere broods per jaar konden onthullen.

De juistheid van de informatie in de FMGA is afhankelijk van de bron. De identificatie van zoetwatermosselen is bijvoorbeeld gebruikelijk als gevolg van het feit dat veel soorten soortgelijke externe kenmerken hebben die het moeilijk maken om onderscheid tussen soorten⁵⁷. Een Gill-monster van een verkeerd geïdentificeerd individu zou verwarring en valse informatie kunnen creëren voor de broedperiode van een soort. Als er een Gill-monster wordt genomen, moeten er Foto's worden genomen van beide kleppen (als het individu niet in leven is), buiten de rechterklep en de umbo (scharnier waar twee kleppen zijn verbonden) en verzonden met gravidity gegevens via de desktopsite of mobiele applicatie. We verwelkomen ook foto's van de Gill-inhoud. Binnen de indieningsformulieren is er een drop-down menu waarmee de verzamelaar hun betrouwbaarheidsniveau met betrekking tot soorten identificatie aangeeft. Voordat de registratie wordt gevalideerd, wordt deze informatie in aanmerking genomen bij het controleren van de identificatie van de verzamelaar tegen plausibele distributie, enz. Vanwege de hoge mate van intraspecifieke morfologische variatie in soorten Unionidae wordt het indienen van weefselmonsters aangemoedigd en kan het nodig zijn om moleculaire identificatie mogelijk te maken.

Toekomstige implicaties

Als niet-dodelijke methode kan dit protocol worden toegepast op zowel gewone als ondoorlatende soorten. De gravidity kalenders voor onverijdelde soorten kunnen instandhoudings managers helpen die betrokken zijn bij bedreigde soorten wetgeving en herstelplanning door informatie te verstrekken over perioden waarin soorten reproductief actief zijn. De staats-en federale agentschappen die risicosoorten beheren, kunnen beter adviseren om toewijzingen toe te staan voor tijden waarin de soort niet kwetsbaar is en weer wordt geproduceerd, en zelfs de oogst van de vis van de gastheer beperken in tijden dat mosselen een volledig ontwikkelde glochidia zijn. Daarnaast kunnen veld enquêtes doelsoorten targeten tijdens niet-reproductieve perioden om de impact op wervingsprocessen te minimaliseren. De openbaar toegankelijke database, FMGA, biedt onderzoekers en managers een hulpmiddel om belangrijke reproductieve informatie te verkrijgen over alle doel dierwater Mossel soorten. De database zal ook gegevens hiaten markeren, het aanmoedigen van verder onderzoek naar soortspecifieke broeden patronen. Aangezien het begrijpen van een soort voortplantings patroon het mogelijk maakt om adequate beheersbeslissingen te nemen, hopen we dat ons protocol en onze database toekomstig onderzoek, behoud en herstel van zoet water Mossel mogelijk maken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL snap cap centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510	Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost.
20 G needle on 10 mL disposable syringe	Exelint International	26255	sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2"
Dissecting Microscope	any	any
Marking Pen	Fisher Scientific	13-379-4	This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof.
Molecular grade ethanol	any	any	Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work.
Paper	any	any	Needed to record information on samples collected.
Pen/pencil	any	any	If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine.
Petri dish	DWK Life Sciences (Kimble)	23000-9050	This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used.
Sodium Chloride	any	any	Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this.
Speculum	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.
Sterile water	any	any	Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection.
Super glue	Gorilla	Gorilla super glue gel	Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Tags	Hallprint	FPN 8x4	Only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Transfer Pipet	Thermo Scientific Samco	225	This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable.
Tweezers	any	any	Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this.
Waterproof paper	RainWriter	any	Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from.
Wooden pick	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.