Methodenartikel

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms met behulp van ConfocalMicroscopie

DOI:

10.3791/60270

⸱

30 januari 2020

 , 
1Department of Dentistry and Oral Health, Aarhus University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft de teelt van cross-kingdom biofilms bestaande uit Candida albicans en Streptococcus mutans en presenteert een confocale microscopie-gebaseerde methode voor het monitoren van extracellulaire pH in deze biofilms.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Langlaufbiofilms bestaande uit zowel schimmel- als bacteriële cellen zijn betrokken bij een verscheidenheid aan orale ziekten, zoals endodontische infecties, parodontitis, mucosale infecties en, met name, vroege kindercariës. In al deze omstandigheden beïnvloedt de pH in de biofilmmatrix microbe-host interacties en dus de progressie van de ziekte. Het huidige protocol beschrijft een confocale microscopiegebaseerde methode om de pH-dynamiek te monitoren in cross-kingdom biofilms bestaande uit Candida albicans en Streptococcus mutanen. Het pH-afhankelijke dual-emissiespectrum en de kleureigenschappen van de ratiometrische sonde C-SNARF-4 worden benut om druppels pH te bepalen in extracellulaire gebieden van de biofilms. Het gebruik van pH-ratiometrie met de sonde vereist een zorgvuldige keuze van imaging parameters, een grondige kalibratie van de kleurstof, en zorgvuldige, drempel-gebaseerde nabewerking van de beeldgegevens. Bij correct gebruik maakt de techniek een snelle beoordeling van extracellulaire pH mogelijk in verschillende gebieden van een biofilm en dus de monitoring van zowel horizontale als verticale pH-gradiënten in de tijd. Hoewel het gebruik van confocale microscopie Z-profilering beperkt tot dunne biofilms van 75 μm of minder, is het gebruik van pH-ratiometrie bij uitstek geschikt voor de niet-invasieve studie van een belangrijke virulentiefactor in cross-kingdom biofilms.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Langlaufbiofilms bestaande uit zowel schimmel- als bacteriële soorten zijn betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen in de mondholte. Candida spp. zijn vaak geïsoleerd van endodontische infecties1 en van parodontale laesies2,3. Bij slijmvliesinfecties is aangetoond dat streptokokkensoorten uit de mitisgroep de vorming van schimmels biofilm, weefselinvasie en verspreiding in zowel in vitro als murinemodellen4,5,6,7verbeteren. Het meest interessant, mondelinge vervoer van Candida spp. is bewezen te worden geassocieerd met de prevalentie van cariës bij kinderen8. Zoals blijkt uit knaagdiermodellen, verhoogt een symbiotische relatie tussen Streptococcus mutans en Candidas albicans de productie van extracellulaire polysachariden en leidt tot de vorming van dikkere en meer cariogene biofilms9,10.

In alle bovengenoemde omstandigheden, met name voor jonge kinderen, is de pH van de biofilm van belang voor de progressie van de ziekte, en de eminente rol van de biofilmmatrix voor de ontwikkeling van acidogene microomgevingen11 vraagt om methodologieën die het bestuderen van pH-veranderingen in cross-kingdom biofilms mogelijk maken. Eenvoudige en nauwkeurige confocale microscopiegebaseerde benaderingen om pH in bacteriële12 en schimmel13 biofilms te monitoren zijn ontwikkeld. Met de ratiometrische kleurstof C-SNARF-4 en op drempels gebaseerde beeldnabewerking kan extracellulaire pH in real-time worden bepaald in alle drie de dimensies van een biofilm14. In vergelijking met andere gepubliceerde technieken voor op microscopie gebaseerde pH-monitoring in biofilms is pH-ratiometrie met C-SNARF-4 eenvoudig en goedkoop, omdat het niet de synthese vereist van deeltjes of verbindingen die een referentiekleurstof15 of het gebruik van tweefotonexcitatie16bevatten . Het gebruik van slechts een kleurstof voorkomt problemen met sonde compartimentering, fluorescerende bleed-through, en selectief bleken16,17,18 terwijl nog steeds rekening houdend met een betrouwbare differentiatie tussen intra- en extracellulaire pH. Ten slotte wordt incubatie met de kleurstof uitgevoerd na de groei van de biofilm, waardoor zowel laboratorium als in situ-gekweekte biofilms kunnen worden bestudeerd.

Het doel van het huidige werk is om het gebruik van pH-ratiometrie uit te breiden en een methode te bieden om pH-veranderingen in cross-kingdom biofilms te bestuderen. Als proof of concept wordt de methode gebruikt om pH te monitoren in biofilms van twee soorten bestaande uit S. mutanen en C. albicans die aan glucose zijn blootgesteld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol voor speekselafname werd herzien en goedgekeurd door de Ethische Commissie van Aarhus County (M-20100032).

1. Teelt van biofilms over het koninkrijk sekoninkrijk

  1. Kweek S. mutans DSM 20523 en C. albicans NCPF 3179 op bloedagarplaten bij 37 °C onder aërobe omstandigheden.
  2. Breng enkele kolonies van elk organisme over naar reageerbuizen gevuld met 5 mL hersenhartinfusie (BHI). Groei 18 uur onder aërobe omstandigheden bij 37 °C.
  3. Centrifugeer de nachtculturen op 1.200 x g voor 5 min. Gooi de supernatant weg, bredig de cellen in fysiologische zoutvastheid opnieuw op en pas de OD550 nm aan 0,5 aan voor C. albicans (~107 cellen/mL) en S. mutans (~108 cellen/mL). Verdun de S. mutans suspensie 1:10 met steriele fysiologische zout (~107 cellen/mL).
  4. Pipette 50 μL steriele speekseloplossing, bereid volgens de methode van de Jong et al.19,in de putten van een optische bodem 96-put plaat voor microscopie. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C. Was de putten 3x met 100 μL steriele fysiologische zoutlijn. Maak de putten leeg.
  5. Voeg 100 μL C. albicans vering toe aan elke put. Incubeer bij 37 °C gedurende 90 min. Was 3x met steriele fysiologische zoutlijn.
    LET OP: Maak de putten niet volledig leeg tijdens het wassen. Laat een reservoir van 20 μL achter om overmatige afschuifkrachten te voorkomen.
  6. Voeg 100 μL warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (geïnactiveerd bij 56 °C gedurende 30 min) toe aan elke put. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur. Was 3x met steriele fysiologische zoutlijn. Maak de putten leeg en laat een reservoir van 20 μL achter.
  7. Voeg 100 μL S. mutans suspensie (voorbereid in stap 1.3) toe aan elke put. Voeg 150 μL BHI met 5% sacharose toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur of langer. Bij het cultiveren van oudere biofilms, verander het medium dagelijks in verse BHI. Aan het einde van de langlauffase was 5x met steriele fysiologische zoutlijn.

2. Ratiometrische pH-beeldvorming

OPMERKING: Ratiometrische pH-beeldvorming moet onmiddellijk worden uitgevoerd nadat de groei van de biofilm is voltooid.

  1. Gebruik voor ratiometrische pH-beeldvorming een omgekeerde confocale laserscanningmicroscoop met een 63x olie- of wateronderdompelingslens, een 543 nm-laserlijn en een spectralimagingsysteem (d.w.z. META-detector) om de beeldvorming van overlappende fluorescente signalen mogelijk te maken. Gebruik een couveuse om het microscoopstadium op te warmen tot 35 °C.
  2. Stel de detector in om de detectie van groene fluorescentie van 576−608 nm en gelijktijdige detectie van rode fluorescentie van 629−661 nm te garanderen. Kies een geschikte laserkracht en gain om over- en onderbelichting te voorkomen.
    OPMERKING: Belichting van de afbeeldingen is het best te zien in paletafbeeldingen met valse kleuren.
  3. Stel de pinholegrootte in op 1 Airy Unit of een optisch segment van ~0,8 μm. Stel de afbeeldingsgrootte in op 512 x 512 pixels en de scansnelheid op 2. Kies een lijngemiddelde van 2, met de gemiddelde optie.
    OPMERKING: Controleer aan het begin van een reeks experimenten of de gekozen microscoopinstellingen een duidelijk contrast bieden tussen bacteriële cellen, schimmelcelwanden, biofilmmatrix en schimmelcytoplasma.
  4. Bereid 100 μL steriele fysiologische zoutoplossing voor die 0,4% (w/v) glucose bevat, getitreerd tot pH 7. Bereid een voorraadoplossing van C-SNARF-4 (1 mM in dimethylsulfoxide). Voeg de kleurstof toe aan een eindconcentratie van 30 μM.
    LET OP: Draag nitrilhandschoenen bij het hanteren van de ratiometrische kleurstof.
  5. Leeg een van de putten met een cross-kingdom biofilm, waardoor een reservoir van 20 μL. Voeg de steriele zoutoplossing met glucose en de ratiometrische kleurstof. Plaats de 96-put plaat op de microscoop podium en beginnen met het beeld van de biofilm.
  6. Verwerf enkele afbeeldingen of Z-stacks op verschillende locaties van de biofilm. Markeer de X-Y-positie in de microscoopsoftware om pH-veranderingen in bepaalde gezichtsvelden in de loop van de tijd te volgen. Neem regelmatig foto's met de laser uitgeschakeld om te corrigeren voor detectoroffset.
  7. Herhaal stap 2.4–2.6 voor de analyse van elke biofilm die in een andere put wordt geteeld.

3. Kalibratie van de ratiometrische kleurstof

OPMERKING: Kalibratie van de kleurstof en de montage van een kalibratiecurve kan worden uitgevoerd op een andere dag dan ratiometrische pH-beeldvorming.

  1. Bereid een serie van 50 mM 2-morfolinoethaanzuur (MES) buffer getitreerd tot pH 4.0−7.8 in stappen van 0,2 pH-eenheden bij 35 °C. Pipetteer 150 μL van elke bufferoplossing in de putten van een optische bodem 96-put plaat voor microscopie.
  2. Voeg de kleurstof toe aan de met buffer gevulde putten van de 96-putplaat tot een eindconcentratie van 30 μM. Laat 5 min equilibrate.
  3. Verwarm het microscoopstadium tot 35 °C. Kies dezelfde microscoopinstellingen als voor ratiometrische pH-beeldvorming. Plaats de 96-put plaat op de microscoop podium. Focus op de bodem van de putten. Verwerf twee afbeeldingen (groen en rood kanaal) voor alle bufferoplossingen, 5 μm boven de onderkant van de put. Neem regelmatig foto's met de laser uitgeschakeld om te corrigeren voor detectoroffset.
  4. Voer het kalibratie-experiment uit in drievoud.
  5. Exporteer alle afbeeldingen als TIF-bestanden. Importeer ze in speciale beeldanalysesoftware (d.w.z. ImageJ20). Trek de foto's die met de laser zijn gemaakt af van de respectievelijke afbeeldingen van de bufferoplossingen door op Proces te klikken | Afbeeldingsrekenmachine | Aftrekken).
    OPMERKING: Snijd indien nodig de afbeeldingen bij om artefacten aan de afbeeldingsranden te elimineren door rechthoekige selectie uit te voeren met Afbeelding | Bijsnijden.
  6. Verdeel de groene kanaalafbeeldingen door de rode kanaalafbeeldingen en bereken de gemiddelde fluorescentieintensiteiten in de resulterende afbeeldingen door op Analyseren te klikken | Histogram.
  7. Uit de drievoudexperimenten, plot de gemiddelde groen /rode verhoudingen tegen de pH. Gebruik speciale software om een functie aan de kalibratiegegevens te passen (d.w.z. MyCurveFit).

4. Digitale beeldanalyse

OPMERKING: Digitale beeldanalyse kan op elk moment worden uitgevoerd na kalibratie van de pH-beeldvorming van de kleurstof en ratiometrische pH.

  1. Bewaar de groene en rode kanaalbiofilmafbeeldingen in afzonderlijke mappen en wijzig de naam van beide reeksen bestanden met sequentiële nummers (bijvoorbeeld GREEN_0001). Importeer de afbeeldingen in speciale beeldanalysesoftware (d.w.z. ImageJ). Klik op Analyseren | Histogram om de gemiddelde fluorescentieintensiteit in de genomen beelden te bepalen en de waarde van de biofilmbeelden af te trekken door op Proces te klikken | Wiskunde | Aftrekken.
  2. Importeer de 2 beeldreeksen in speciale beeldanalysesoftware (d.w.z. daime21). Een op drempelgebaseerde segmentatie van de rode kanaalafbeeldingen uitvoeren (Segment | Automatische segmentatie | Aangepaste drempelwaarde). Stel de 'lage' drempel boven de fluorescentieintensiteit van het schimmelcytoplasma en de 'hoge' drempel onder de intensiteit van de schimmelcelwanden en de bacteriën.
    OPMERKING: Wanneer de juiste drempelwaarden zijn gekozen, worden alleen extracellulaire gebieden herkend als objecten.
  3. De objectlaag van de gesegmenteerde afbeeldingsreeks overbrengen naar de afbeeldingsreeks voor groene kanalen. Klik hiervoor op Segment | Objectlaag overbrengen.
    OPMERKING: Als het contrast tussen extracellulaire gebieden en schimmelcytoplasma te zwak is in de afzonderlijke kleurkanalen, voegt u de groene kanaalafbeeldingsreeks toe aan de rode kanaalreeks voordat u segmenteert door op Bewerken te klikken | Afbeeldingscalculator | Bijtelling. Voer de segmentatie uit zoals beschreven onder punt 4.2 en zet de objectlaag van de gesegmenteerde afbeeldingsreeks over naar zowel de groene als de afbeeldingsreeks met rood kanaal.
  4. Gebruik de objecteditor om niet-objectpixels in de rode en groene kanaalafbeeldingsreeks te verwijderen (Visualizer | Objecteditor | In alle afbeeldingen | Niet-objectpixels verwijderen). Nu worden de biofilmbeelden gewist uit zowel bacteriële als schimmelcellen. Exporteer de verwerkte afbeeldingsreeks als TIF-bestanden.
  5. Importeer beide afbeeldingsreeksen naar ImageJ. ImageJ kent een intensiteit van 0 toe aan alle niet-objectpixels. Verwijder deze pixels door de rode afbeeldingsreeks (R1) zelf te delen (Proces | Afbeeldingscalculator | Afbeelding 1: R1; Operatie: Verdeel; Afbeelding 2: R1) en vermenigvuldigen van de resulterende afbeeldingsreeks (R2) met de oorspronkelijke rode afbeeldingsreeks(Proces | Afbeeldingscalculator | Afbeelding 1: R1; Bewerking: Vermenigvuldigen; Afbeelding 2: R2). Er wordt een derde afbeeldingsreeks (R3) gemaakt, identiek aan R1, met uitzondering van het feit dat NaN is toegewezen aan alle pixels met een intensiteit van 0 in R1. Ga op dezelfde manier verder met de groene afbeeldingsreeks.
  6. Gebruik het filter 'Gemiddelde' (Proces | Filters | Gemiddelde | Straal | 1 pixel) op de rode en groene kanaal beeldserie om detectorruis te compenseren. Verdeel de groene kanaalafbeeldingsreeks door de rode kanaalafbeeldingsreeks (Proces | Afbeeldingscalculator | Afbeelding 1: G3; Operatie: Verdeel; Afbeelding 2: R3). De resulterende afbeeldingsreeks (G3/R3) toont de groen/rode verhouding voor alle objectpixels.
  7. De gemiddelde verhouding voor elke afbeelding berekenen (Analyseren | Histogram). Valse kleuring toepassen voor een betere visuele weergave van de verhoudingen in de afbeeldingen (Afbeelding | Opzoektabellen). Zet de groen/rode verhoudingen om naar pH-waarden met behulp van de functie die is uitgerust onder 3.6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na 24 uur en 48 uur ontwikkelden robuuste cross-kingdom biofilms zich in de putplaten. C. albicans vertoonden verschillende mate van filamenteuze groei en S. mutanen vormden dichte clusters tot 35 μm hoog. Enkele cellen en ketens van S. mutanen gegroepeerd rond schimmel hyphae, en grote intercellulaire ruimten aangegeven de aanwezigheid van een volumineuze matrix (Figuur S1).

Kalibratie van de ratiometrische kleurstof levert een asymmetrische sigmoïd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende protocollen voor de teelt van langlauffolies waarbij C. albicans en Streptococcus spp betrokken zijngeweest . De huidige opstelling richt zich echter op eenvoudige groeiomstandigheden, een tijdschema dat compatibel is met reguliere werkdagen, een evenwichtige soortensamenstelling en de ontwikkeling van een volumineuze b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anette Aakjær Thomsen en Javier E. Garcia worden erkend voor uitstekende technische ondersteuning. De auteurs bedanken Rubens Spin-Neto voor vruchtbare discussies over beeldanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Blood agar platesStatens Serum Institut677
Brain heart infusionOxoidCM1135
Brain heart infusion + 5 % sucroseBDH laboratory supplies10274
Candida albicansNational Collection of Pathogenic FungiNCPF 3179
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
daime: digital image analysis in microbial ecologyUniversität WienN/AFreeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxideLife TechnologiesD12345
Fetal bovine serumGibco Life technologies10270
GS-6R refrigerated centrifugeBeckmanN/A
ImageJNational Institutes of HealthN/AFreeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
JavaOracleN/AFreeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well BlackIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) bufferBioworld700728
PHM210 pH-meterRadiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objectiveZeissN/ANA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic AcidLife TechnologiesS23920
Sterile physiological salineVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PCVWRN/A
XL IncubatorPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527(2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967(2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407(2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622(2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457(2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242(2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920(2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299(2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Monitoring van de extracellulaire pHpH ratiometrieC SNARF 4 sondeCandida albicansStreptococcus mutansbiofilmgroeibeeldsegmentatiefluorescentie imaging

Gerelateerde artikelen